王長鷹,李 軍

(1西安國際醫(yī)學(xué)中心心臟內(nèi)科,西安 710075;2空軍軍醫(yī)大學(xué)第二附屬醫(yī)院心血管內(nèi)科;*通訊作者,E-mail:junliafmu@126.com)

嚴重?zé)齻缙?心肌細胞因有效循環(huán)血容量不足即可發(fā)生缺血缺氧并導(dǎo)致能量代謝失衡。早期的心肌損傷是導(dǎo)致嚴重?zé)齻笮呐K功能障礙的主要原因,繼而可進一步引起燒傷后機體血流動力學(xué)紊亂,加重?zé)齻蟮男菘藸顟B(tài),甚至誘發(fā)多器官功能衰竭[1-3]。因此,在嚴重?zé)齻脑缙诰戎芜^程中,注重對心肌損傷的防護是保護心臟功能和改善患者預(yù)后的重要保證。

金絲桃苷(hyperoside,Hyp),又名槲皮素-3-O-β-D-半乳糖苷,是一種從金絲桃屬或山楂屬等植物中提取出的黃酮醇苷類化合物。藥理學(xué)研究表明,金絲桃苷具有多種生物學(xué)活性,如抗氧化、抗炎、抗高血糖、抗腫瘤等,并且對肝損傷、心腦缺血、感染、腫瘤等多種疾病都具有一定的治療效果[4,5]。但Hyp能否減輕機體嚴重?zé)齻蟮男募p傷未見相關(guān)報道,因此,本研究通過構(gòu)建Ⅲ度燒傷大鼠模型,觀察Hyp對嚴重?zé)齻笫笤缙谛募p傷的作用并初步探究其分子機制,為臨床治療提供一定的理論和實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及試劑

8周齡雄性SD大鼠60只,清潔級,體質(zhì)量200-250 g,空軍軍醫(yī)大學(xué)動物實驗中心提供,動物生產(chǎn)許可證號:SCXK(軍)2007-007號。金絲桃苷(Hyp)和EX527購自美國Sigma公司。肌鈣蛋白I(cTnI)和肌酸激酶同工酶(CK-MB)ELISA試劑盒購自美國USCN life公司。超氧化物歧化酶(SOD)和還原型谷胱甘肽(GSH)檢測試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。小鼠抗大鼠髓過氧化物酶(MPO)單克隆抗體購自美國LifeSpan Biosciences公司。anti-SIRT1、anti-Ac-foxo1、anti-gp91phox、anti-Nox4、anti-IL-6、anti-IL-1β和anti-Cleaved Caspase-3抗體購自美國Abcam公司,anti-β-actin抗體購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.2 動物分組及處理

將60只雄性SD大鼠(200-250 g)隨機分為4組：假燒傷組(sham組)、燒傷組、金絲桃苷處理組(Hyp組)和金絲桃苷處理加抑制劑組(EX527+Hyp組)，每組15只。大鼠經(jīng)戊巴比妥鈉(30 mg/kg)麻醉，背部脫毛仰臥位固定于特制的燙傷裝置上，僅將其背部浸入到98°C的熱水15 s，以造成30%體表面積Ⅲ度燙傷，構(gòu)建燒傷動物模型;sham組大鼠則將背部浸入到25 ℃水中15 s。燒傷結(jié)束后，立即腹腔注射乳酸林格液(50 mg/kg)進行液體復(fù)蘇，并在燒傷后6 h補充注射乳酸林格液1次[6]。Hyp組和EX527+Hyp組大鼠在燒傷后0，3，6 h灌胃給予Hyp(30 mg/kg)處理，sham組和燒傷組則給予相同劑量的生理鹽水灌胃；EX527+Hyp組大鼠在藥物灌胃處理后同時給予腹腔注射EX527(5 mg/kg)處理。

1.3 心肌力學(xué)指標監(jiān)測

在燒傷后12 h,通過右側(cè)頸總動脈將一根細導(dǎo)管插入大鼠左心室,然后將導(dǎo)管另一端與BL-420生理信號采集處理系統(tǒng)壓力換能器相連接,待大鼠呼吸心率穩(wěn)定后記錄左心室收縮壓(left ventricular systolic pressure,LVSP)、左心室舒張末壓(left ventricular end-diastolic pressure,LVEDP)、左心室內(nèi)壓最大上升速率(+dP/dtmax)和左心室內(nèi)壓最大下降速率(-dP/dtmax),并計算出左室發(fā)展壓(left ventricular developmental pressure,LVDP=LVSP-LVEDP)。

1.4 心臟HE染色

大鼠心臟標本經(jīng)10%甲醛固定、酒精脫水處理后石蠟包埋,然后制成5 μm厚心臟切片,常規(guī)HE染色,光學(xué)顯微鏡拍照觀察。

1.5 心肌損傷生化指標檢測

各組大鼠頸動脈取血后靜置并離心獲得血清標本,經(jīng)血生化分析儀測定心肌肌鈣蛋白I(cardiac troponin I,cTnI)和肌酸激酶同工酶(creatine phosphokinase-isoenzyme-MB,CK-MB)的含量。

1.6 心肌炎性因子水平測定

按照ELISA試劑盒說明書加入標準品,同時每個待測樣品設(shè)置2個復(fù)孔,待反應(yīng)終止后用酶標儀測定各孔吸光密度值并繪制標準曲線,分別計算各組大鼠血清中TNF-α和IL-1β的含量。

1.7 心肌組織中性粒細胞染色

將制備好的心臟石蠟切片經(jīng)脫蠟復(fù)水操作和PBS液洗滌后，分別滴加100 μl小鼠抗大鼠MPO單克隆抗體，4 ℃過夜孵育，DAB顯色和蘇木精復(fù)染后封片，顯微鏡觀察并拍照記錄MPO在心臟組織中的陽性表達情況，進而明確各組中性粒細胞(MPO+)在心臟組織中的浸潤情況。

1.8 心肌抗氧化物含量測定

測定心肌組織超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)和還原型谷胱甘肽(glutathione,GSH)來評價各組大鼠刺激后的心肌組織抗氧化能力。嚴格按照試劑盒說明書檢測組織勻漿中SOD和GSH水平,并用分光光度法測量吸光度值以計算出抗氧化物的含量。

1.9 Western blot檢測蛋白表達水平

提取各組大鼠心臟總蛋白后定量,按每孔40 μg上樣量將各組蛋白經(jīng)聚丙烯酰胺變性凝膠電泳分離,并通過濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。將切好的各條帶用5%的脫脂牛奶室溫下封閉2 h,封閉完成后孵育在SIRT1(1 ∶1 000)、Ac-foxo1(1 ∶1 000)、Nox4(1 ∶1 000)、gp91phox(1 ∶1 000)、IL-6(1 ∶1 000)、IL-1β(1 ∶1 000)、cleaved Caspase-3(1 ∶1 000)和β-actin(1 ∶3 000)的抗體管中,4 ℃過夜。TBST搖洗條帶3次,再使用辣根過氧化物酶標記的二抗(1 ∶4 000)室溫孵育2 h,TBST洗滌條帶3次,通過Bio-Rad系統(tǒng)成像并Image Lab軟件分析結(jié)果。

1.10 統(tǒng)計學(xué)分析

所有數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差表示,通過單因素方差分析(ANOVA)對多個組進行比較。用Prism 5.0程序?qū)?shù)據(jù)進行分析,以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 心肌力學(xué)指標比較

大鼠心肌力學(xué)監(jiān)測指標顯示,與sham組相比,燒傷組大鼠的LVDP、+dP/dtmax與-dP/dtmax均顯著降低(P<0.05);給予金絲桃苷處理后,Hyp組大鼠的LVDP、+dP/dtmax與-dP/dtmax值顯著升高(與燒傷組相比,P<0.05);而使用SIRT1特異性阻斷劑EX527則會明顯逆轉(zhuǎn)Hyp對心肌力學(xué)參數(shù)的保護作用(P<0.05,見圖1)。

與sham組相比,#P<0.05,##P<0.01;與燒傷組相比,**P<0.01;與Hyp組相比,△△P<0.01圖1 大鼠心肌力學(xué)指標比較Figure 1 Comparison of myocardial mechanical indexes among four groups

2.2 心肌損傷形態(tài)學(xué)及生化指標比較

大鼠心臟切片HE染色顯示,與sham組相比,燒傷組大鼠心肌纖維排列紊亂,波浪樣改變,甚至出現(xiàn)肌束分離、斷裂現(xiàn)象;Hyp組較燒傷組大鼠心肌纖維排列紊亂的現(xiàn)象顯著改善,纖維斷裂顯著減少;而使用SIRT1特異性阻斷劑EX527則會明顯逆轉(zhuǎn)Hyp對心肌損傷的保護效果(見圖2)。各組大鼠血清標本經(jīng)血生化檢測顯示,與sham組相比,燒傷組大鼠cTnI和CK-MB均顯著升高(P<0.05);給予金絲桃苷處理后,Hyp組大鼠的cTnI和CK-MB值顯著降低(與燒傷組相比,P<0.05);而使用SIRT1特異性阻斷劑EX527則會明顯逆轉(zhuǎn)Hyp對心肌損傷生化指標的改善(P<0.05,見圖2)。

與sham組相比,#P<0.05,##P<0.01;與燒傷組相比,**P<0.01;與Hyp組相比,△△P<0.01圖2 大鼠心肌組織HE染色及壞死標志物含量比較 (×400)Figure 2 HE staining of myocardium and the contents of necrotic markers in each group (×400)

2.3 心肌炎性水平比較

心肌炎性水平檢測結(jié)果顯示,與sham組相比,燒傷組大鼠血清中炎癥因子TNF-α和IL-1β的含量顯著增加,心肌組織中性粒細胞浸潤明顯,IL-6和IL-1β蛋白表達量顯著升高(P<0.05);給予金絲桃苷處理后,Hyp組大鼠血清中TNF-α和IL-1β的含量顯著降低,心肌組織中性粒細胞浸潤明顯減輕,IL-6和IL-1β蛋白表達顯著受抑制(與燒傷組相比,P<0.05);而使用SIRT1特異性阻斷劑EX527則會明顯逆轉(zhuǎn)Hyp的上述保護作用(P<0.05,見圖3-5)。

與sham組相比,#P<0.05,##P<0.01;與燒傷組相比,**P<0.01;與Hyp組相比,△△P<0.01圖3 大鼠心肌組織中性粒細胞浸潤情況比較 (×400)Figure 3 Comparison of the infiltration of neutrophilic granulocyte in myocardial tissue in each group (×400)

與sham組相比,#P<0.05,##P<0.01;與燒傷組相比,**P<0.01;與Hyp組相比,△△P<0.01圖4 大鼠血清中炎癥相關(guān)因子含量比較Figure 4 Comparison of the contents of inflammatory-related factors in rat serum among four groups

與sham組相比,#P<0.05,##P<0.01;與燒傷組相比,**P<0.01;與Hyp組相比,△△P<0.01圖5 大鼠心肌組織炎癥相關(guān)因子蛋白表達比較Figure 5 Comparison of the protein expression of inflammatory-related factors in myocardial tissue among four groups

2.4 心肌組織氧化應(yīng)激水平比較

心肌組織氧化應(yīng)激水平檢測結(jié)果顯示,與sham組相比,燒傷組大鼠心肌組織中抗氧化物SOD和GSH水平顯著降低,氧化應(yīng)激標志蛋白Nox4和gp91phox的表達量明顯升高(P<0.05);給予金絲桃苷處理后,Hyp組燒傷大鼠心肌組織中SOD和GSH水平顯著增加,Nox4和gp91phox的蛋白表達量明顯下降(與燒傷組相比,P<0.05);而使用SIRT1特異性阻斷劑EX527則會明顯逆轉(zhuǎn)Hyp的上述保護作用(P<0.05,見圖6,7)。

與sham組相比,#P<0.05,##P<0.01;與燒傷組相比,**P<0.01;與Hyp組相比,△△P<0.01圖6 大鼠心肌組織抗氧化物含量比較Figure 6 Comparison of the contents of antioxidants in myocardial tissue among four groups

與sham組相比,#P<0.05,##P<0.01;與燒傷組相比,**P<0.01;與Hyp相比,△△P<0.01圖7 大鼠心肌組織氧化應(yīng)激標志蛋白表達比較Figure 7 Expression of oxidative stress marker proteins in myocardial tissue in each group

2.5 心肌SIRT1信號及凋亡蛋白表達的比較

Western blot檢測結(jié)果顯示,與sham組相比,燒傷組大鼠心肌組織中SIRT1蛋白表達明顯下降,Foxo1的乙?；矫黠@升高,同時凋亡蛋白cleaved Caspase-3表達明顯上調(diào);給予金絲桃苷處理后,Hyp+燒傷組大鼠心肌組織中SIRT1蛋白表達明顯升高,Foxo1的乙?；矫黠@下降,同時cleaved Caspase-3蛋白表達明顯下調(diào);而使用SIRT1特異性阻斷劑EX527則會明顯逆轉(zhuǎn)Hyp的上述保護作用(P<0.05,見圖8)。

與sham組相比,#P<0.05,##P<0.01;與燒傷組相比,**P<0.01;與Hyp組相比,△△P<0.01圖8 大鼠心肌組織SIRT1信號表達水平Figure 8 Expression of SIRT1 signaling in myocardial tissue in each group

3 討論

近年來,研究已證實嚴重?zé)齻烧T發(fā)心臟損傷,且燒傷后的機體常伴有明顯的心肌收縮力減弱,嚴重時會導(dǎo)致心功能障礙,極大地影響了患者的預(yù)后。嚴重?zé)齻笮墓δ艿母淖冎饕憩F(xiàn)在心肌力學(xué)功能和心肌微觀結(jié)構(gòu)的變化上,如心輸出量和心指數(shù)的下降、中心靜脈壓和肺毛細血管楔壓的升高、以及心肌酶譜改變和心肌細胞水腫等方面[7,8]。本研究結(jié)果同樣證實,大鼠Ⅲ度燒傷后心肌力學(xué)監(jiān)測指標顯示,與sham組相比,燒傷組大鼠的LVDP、+dP/dtmax與-dP/dtmax均顯著降低。同時,燒傷組大鼠心肌壞死標志物cTnI和CK-MB均顯著升高。此外,大鼠心臟微觀結(jié)構(gòu)顯示,與sham組相比,燒傷組大鼠心肌纖維排列紊亂,波浪樣改變,甚至出現(xiàn)肌束分離、斷裂現(xiàn)象。由此得出,在臨床燒傷一線的救治過程中,注重對機體心臟功能的保護,將能明顯改善嚴重?zé)齻颊叩念A(yù)后。

氧化應(yīng)激損傷在嚴重?zé)齻蟮男募p傷中起著關(guān)鍵的作用,活性氧簇可導(dǎo)致心肌細胞膜脂質(zhì)和胞內(nèi)蛋白質(zhì)過氧化,以及心肌細胞DNA損傷和內(nèi)源性抗氧化酶的耗盡,并最終導(dǎo)致心肌細胞死亡和器官損傷[9,10]。機體內(nèi)氧自由基的清除與活性氧簇生成間的失衡已成為嚴重?zé)齻蟮男募p傷的機制之一。此外,炎癥也在嚴重?zé)齻鸬男呐K損傷中扮演著重要的角色,中性粒細胞、巨噬細胞等炎癥細胞以及TNF-α,IL-1β、IL-6等促炎因子均可響應(yīng)有害刺激而引發(fā)強烈的炎癥反應(yīng),大量研究已表明,這些炎癥細胞和促炎因子在嚴重?zé)齻蟮男呐K表達中明顯上調(diào)[11,12]。因而有效抑制嚴重?zé)齻笮募〖毎难趸瘧?yīng)激水平和炎癥反應(yīng)是保護心臟功能的重要舉措。

金絲桃苷是一種從植物中提取的類黃酮類化合物,具有抗炎、抗氧化、抗癌、抗高血糖和抗凝血等多種生物學(xué)效應(yīng)[13]。大量研究報道金絲桃苷在多種損傷因素所致的心血管損害中均發(fā)揮重要的保護作用,并且與其抗氧化和抗炎效應(yīng)密切相關(guān)[14,15]。王成等[16]研究發(fā)現(xiàn),金絲桃苷可通過激活PI3K/AKT/Nrf2信號通路保護心肌細胞免受高糖誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激損傷。舒慶等[17]系統(tǒng)綜述了金絲桃苷可通過細胞外信號調(diào)節(jié)激酶通路、磷脂酰肌醇-3激酶/蛋白激酶B信號通路、抗氧自由基和一氧化氮自由基的形成、抑制鈣離子內(nèi)流等分子機制,發(fā)揮減輕心肌缺血/再灌注損傷的作用。李春陽等[18]報道,金絲桃苷預(yù)處理人臍靜脈血管內(nèi)皮細胞能顯著抑制ACE酶活性和炎癥因子含量的增加,具有一定的抗炎和舒血管作用。本研究同樣觀察到,嚴重?zé)齻?與sham組相比,燒傷組大鼠心肌組織氧化應(yīng)激水平與炎癥反應(yīng)明顯增強,而給予金絲桃苷處理后,能顯著促進燒傷大鼠心肌組織中抗氧化物的生成并抑制炎癥細胞以及炎癥相關(guān)因子的釋放,從而減輕了心肌損傷。

作為一種關(guān)鍵的內(nèi)源性心血管疾病保護分子[19,20],SIRT1因其明顯的抗氧化與抗炎特性在心肌損傷保護中均扮演著重要角色,并且有研究發(fā)現(xiàn)激活SIRT1信號可以顯著減輕嚴重?zé)齻鸬难装Y反應(yīng)[21],因而,本課題組猜想SIRT1信號在嚴重?zé)齻笫笤缙谛募p傷中是否同樣發(fā)揮保護性作用。本研究結(jié)果首先觀察到,與sham組相比,燒傷組大鼠心肌組織中SIRT1蛋白表達明顯下降,Foxo1的乙酰化水平明顯升高,同時凋亡蛋白cleaved Caspase-3表達明顯上調(diào)。因此,嚴重?zé)齻笫笏碌脑缙谛募p傷與心肌組織中SIRT1蛋白降低可能密切相關(guān)。此外,有研究報道SIRT1可介導(dǎo)多種抗氧化物質(zhì)發(fā)揮心肌保護作用[22-24],并且高健美等[25]發(fā)現(xiàn)金絲桃苷對D-半乳糖致衰老小鼠具有抗氧化作用,其作用可能通過調(diào)控SIRT1/Nrf2信號通路相關(guān)。張婷等[26]發(fā)現(xiàn)金絲桃苷能通過激活SIRT1基因,抑制NF-κB基因保護高糖所致的人神經(jīng)母細胞瘤細胞的氧化損傷,那么金絲桃苷是否能通過激活SIRT1信號從而減輕燒傷后的心臟損傷有待于進一步探究。本研究結(jié)果進一步證實,給予金絲桃苷處理后,Hyp組大鼠心肌組織中SIRT1蛋白表達明顯升高,Foxo1的乙酰化水平明顯下降,同時明顯下調(diào)cleaved Caspase-3的蛋白表達。而使用SIRT1特異性阻斷劑EX527則會明顯逆轉(zhuǎn)金絲桃苷對燒傷后大鼠心臟功能、心肌組織微觀形態(tài)、心肌壞死標志物、心肌組織氧化應(yīng)激損傷以及炎癥反應(yīng)的保護作用,從而進一步驗證了金絲桃苷減輕燒傷后大鼠心肌損傷的可能內(nèi)源性分子機制。

綜上所述,金絲桃苷可通過抗氧化應(yīng)激損傷與抗炎作用減輕嚴重?zé)齻笫笤缙谛募p傷,其分子機制可能與其激活SIRT1信號通路有關(guān)。