武 昌，劉琳琳2*，高秀展3，徐 暖，李 強(qiáng)

(1臨沂市河?xùn)|區(qū)人民醫(yī)院，山東 臨沂 276000；2山東醫(yī)專；3臨沂市腫瘤醫(yī)院)

結(jié)直腸癌(Coloretal cancer，CRC)是最常見的消化道腫瘤，目前臨床尚無有效的標(biāo)志物用于其早期診斷。循環(huán)腫瘤DNA(Circulating tumor DNA，ctDNA)是源于腫瘤細(xì)胞的雙鏈DNA片段[1]。研究證實(shí)，ctDNA所攜帶的腫瘤基因組信息與腫瘤組織具有良好的一致性，能克服常規(guī)腫瘤組織活檢所無法突破的腫瘤異質(zhì)性問題[2]。通過對外周循環(huán)樣本進(jìn)行ctDNA檢測，從而為腫瘤原發(fā)灶的實(shí)時動態(tài)檢測、復(fù)發(fā)灶基因組信息的轉(zhuǎn)移過程提供便利，甚至為早期的診斷、療效的評定，乃至預(yù)后的判斷過程提供必要的協(xié)助[3]，也有助于靶向治療適應(yīng)癥的評估，從而推進(jìn)精準(zhǔn)醫(yī)療的實(shí)施。本研究旨在探討ctDNA MET基因與CRC發(fā)病之間的關(guān)系，以期為臨床早期診斷做出有益的探索。

1 對象與方法

1.1研究對象 收集2015年1月-2018年6月在臨沂市中心醫(yī)院、臨沂市腫瘤醫(yī)院、河?xùn)|區(qū)人民醫(yī)院和山東醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校附屬醫(yī)院治療的CRC新發(fā)病例，共計(jì)50例納入病例組，納入標(biāo)準(zhǔn)：通過臨床表現(xiàn)、血清標(biāo)志物和組織比例學(xué)等檢查，將其確診為CRC；既往無其他惡性腫瘤史；調(diào)查前未行化療和/放射治療。同期收集來自上述醫(yī)院的慢性腸炎患者50例，健康體檢者50例作為對照，匹配標(biāo)準(zhǔn)：年齡(±5歲)和性別與病例組相匹配；過去沒有其他病史。本研究獲醫(yī)院倫理委員會的批準(zhǔn)。

1.2方法 準(zhǔn)備3組研究者的血清，采用改良酚-氯仿抽提法提取其外周血循環(huán)DNA(cDNA)，采用實(shí)時熒光定量PCR(Real-time PCR)檢測其含量。所選的定量標(biāo)準(zhǔn)品為人類基因組DNA，將其稀釋為以下5個梯度：0.01、0.1、1、10、100 ng/μl。在此基礎(chǔ)上對管家基因中的β-actin 400 bp和100 bp片段進(jìn)行分析，并以其為混合血清中循環(huán)DNA表達(dá)量的代表。上游引物為5’-ATCGCTCACCGCAAATGC-3’，下游引物分別為5’-AATGCTATCACCTCCCCTGTGT-3’、5’-CATCTTGTTTTCTGCGCAAGTT-3’。探針序列為5’-FAM-CTAGGCGGACTATGACTTAGTTGCGTTACA CCC-TAMRA-3’。模板為實(shí)驗(yàn)提取的血清DNA，對每個樣本出現(xiàn)3次重復(fù)，最終以結(jié)果的平均值為準(zhǔn)。反應(yīng)體系：premix Ex TaqTM(2×)12.5μl，上游引物(10μM)0.5μl，下游引物(10μM)0.5μl，探針(10μM)0.25μl，模板DNA 10 ng，滅菌蒸餾水加至總體積為25μl。與此同時，以60℃ 30 s、95℃ 5 s和95℃ 1 min為發(fā)生反應(yīng)的條件(FAM/Sybr)。

2 結(jié)果

2.1血清循環(huán)DNA的定量分析 CRC患者、慢性腸炎患者和正常對照組血清400 bp β-actin方面的平均含量分別為(48.00±10.35)、(9.37±1.86)和(7.81±1.67)ng/μl。三組比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=685.79，P<0.01)；兩兩比較顯示：慢性腸炎患者和正常對照組均低于 CRC患者(q=44.43，46.23；P<0.05)，二者之間差異不顯著(q=1.79，P>0.05)。三組在血清100 bp β-actin方面的含量分別為(31.40±6.91)、(6.87±1.35)和(6.43±1.23)ng/μl，三組比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=599.71，P<0.01)；兩兩比較顯示：慢性腸炎患者和正常對照組均低于 CRC患者(q=42.03，42.79；P<0.05)，二者之間差異不顯著(q=0.75，P>0.05)。

2.2CRC患者cDNA水平與臨床病理特征 分別以患者血清中β-actin 400 bp、100 bp片段含量的中位數(shù)為參考依據(jù)，β-actin 400bp片段含量的中位數(shù)為43.9 ng/μl，100bp片段含量的中位數(shù)為27.1 ng/μl，400bp/100bp比值的中位數(shù)為1.78，將其為高、低兩個表達(dá)組。其表達(dá)量的高低與患者的年齡、性別、TNM分期、腫瘤數(shù)目以及CEA的相關(guān)性并不顯著。400bp/100bp比值的大小同樣不會受到以下因素的顯著影響：患者的性別、年齡、腫瘤數(shù)目、HBeAg、TNM分期及GGT。

3 討論

目前，臨床對CRC的早期診斷仍然缺乏有效的手段。有研究顯示，包括肝癌、淋巴瘤、乳腺癌和肺癌等患者血清cDNA含量的完整水平相對較高[4]。本研究對結(jié)直腸癌患者、慢性腸炎患者和正常人群中β-actin400bp、100bp兩種片段的含量進(jìn)行了定量檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，CRC血清中這兩種片段的含量要高于慢性腸炎患者和正常對照組，而慢性腸炎患者和正常對照組之間并沒有顯著差異；CRC患者β-actin400bp、100bp兩種片段的含量水平與其臨床病例特征之間并沒有相關(guān)性。