李澤平， 陳彥霖，李曉苗，焦慧鳳

1.南昌大學(xué)瑪麗女王學(xué)院(南昌330031)；2.空軍軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院(西安 710032)，3.南昌大學(xué)生命科學(xué)院(南昌330031)

神經(jīng)干細(xì)胞(Neural stem cell，NSC)起源于多能干細(xì)胞，具有自我復(fù)制和多向分化的潛能，并在學(xué)習(xí)記憶和海馬突觸可塑性中起重要作用。Mash-1基因是堿性螺旋-環(huán)-螺旋基因(basic helix-loop-helex，bHLH)家族的一類(lèi)成員。bHLH家族因在一個(gè)近60個(gè)氨基酸的片段內(nèi)具有特征性的bHLH序列模式而得名。多種細(xì)胞和組織分化發(fā)育的過(guò)程由此家族調(diào)控，對(duì)神經(jīng)發(fā)育有重大意義。近年研究表明Mash-1基因?qū)SC有正性調(diào)控作用。作為哺乳動(dòng)物早期神經(jīng)發(fā)育的關(guān)鍵性基因之一，Mash-1的表達(dá)有助于多功能細(xì)胞向神經(jīng)祖細(xì)胞分化并產(chǎn)生神經(jīng)元的過(guò)程[1]。此外，bHLH家族中的負(fù)性調(diào)控基因Hes可以抑制Mash-1的表達(dá)，同時(shí)bHLH基因也被Notch信號(hào)調(diào)控。本文對(duì)Mash-1蛋白特性和notch、Hes-1對(duì)Mash-1通路影響以及Mash-1對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞發(fā)育神經(jīng)發(fā)生予以綜述。

1 Mash-1基因及Mash-1蛋白功能特性

Mash-1對(duì)哺乳動(dòng)物的神經(jīng)發(fā)生具有重要意義，敲除這些基因會(huì)導(dǎo)致特定神經(jīng)元亞型的缺失。Mash-1蛋白分子量約為34kD，其具有bHLH結(jié)構(gòu)，可以與啟動(dòng)子E-BOX特異性結(jié)合，與E蛋白如E12和E47結(jié)合，啟動(dòng)下游基因的轉(zhuǎn)錄。有研究表明，Mash-1基因的負(fù)調(diào)控作用與Id競(jìng)爭(zhēng)性地和E蛋白結(jié)合有密切聯(lián)系[1]。Mash-1基因在CNS的發(fā)育中被Notch介導(dǎo)的一系列信號(hào)所調(diào)控。而且BMP、ras基因、hedgehog和Wnt通路也可作為其調(diào)控神經(jīng)發(fā)育的影響因素[2]。Mash-1除上述互相調(diào)控外，通過(guò)維持其持續(xù)表達(dá)可以使BMP誘導(dǎo)NSC向神經(jīng)元分化，并對(duì)BMP-2誘導(dǎo)膠質(zhì)細(xì)胞的分化具有抑制作用。在NSC向神經(jīng)細(xì)胞及中間神經(jīng)元分化的過(guò)程中，MDLX基因可作為Mash-1誘導(dǎo)的靶基因，繼而DLX-2誘導(dǎo)谷氨酸脫羧酶67對(duì)于GABA能神經(jīng)元分化產(chǎn)生抑制作用[3]。

2 Notch信號(hào)通路對(duì)Mash-1基因的調(diào)控作用

Notch基因編碼的Notch蛋白和Notch配體、DNA結(jié)合蛋白、其他效應(yīng)物[3]以及相關(guān)調(diào)節(jié)分子共同組成了Notch通路在中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育過(guò)程里，Notch介導(dǎo)的一系列信號(hào)可調(diào)控Mash-1基因的轉(zhuǎn)錄。研究表明，Mash-1可通過(guò)NRSF/REST轉(zhuǎn)錄復(fù)合物相結(jié)合而激活[4]。NRSF/REST是保持神經(jīng)未分化狀態(tài)的關(guān)鍵性轉(zhuǎn)錄因子，其存在于Notch通路中。

另一方面Notch可以通過(guò)調(diào)控Hes基因來(lái)間接調(diào)控Mash-1的表達(dá)(見(jiàn)下文)。Notch激活時(shí)，其結(jié)構(gòu)發(fā)生變化并釋放細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)區(qū)[2](ICD),該結(jié)構(gòu)區(qū)進(jìn)入細(xì)胞核與RBP-J形成復(fù)合物。RBP-J可通過(guò)結(jié)合Hes蛋白的啟動(dòng)子抑制轉(zhuǎn)錄，下調(diào)Hes1與Hes5表達(dá)[4]。但當(dāng)RBP-J與ICD結(jié)合后，則會(huì)產(chǎn)生相反的作用。

Delta1(Dll1)的表達(dá)被mash-1所調(diào)控，Dll1可與相鄰細(xì)胞的Notch信號(hào)結(jié)合進(jìn)行調(diào)節(jié)[5]。Hes5可以抑制NGND等基因的表達(dá)[4],NGND也可調(diào)節(jié)Dll1的表達(dá)。由此也印證了，下一步會(huì)分化為原始神經(jīng)元的細(xì)胞Notch信號(hào)表達(dá)較弱。實(shí)驗(yàn)證明[5]，Mash-1對(duì)早期室管膜區(qū)的神經(jīng)前體細(xì)胞的分化起推動(dòng)作用，如果Notch信號(hào)丟失,神經(jīng)前體細(xì)胞則會(huì)缺失,除Notch缺失細(xì)胞外，Mash-1均表達(dá)正常。

3 Hes基因?qū)ash-1基因的調(diào)控作用

Hes基因是一種負(fù)調(diào)控型的bHLH轉(zhuǎn)錄因子,其作用體現(xiàn)在維持神經(jīng)干細(xì)胞增殖,使大腦細(xì)胞具有正確的數(shù)目、形態(tài)和細(xì)胞排列等方面。相反的是正調(diào)控型轉(zhuǎn)錄因子Mash-1基因,其具有促進(jìn)神經(jīng)前體細(xì)胞向神經(jīng)元分化的功能。[6]正調(diào)控型和負(fù)調(diào)控型bHLH轉(zhuǎn)錄因子之間拮抗式的互相作用意味著二者共同控制神經(jīng)干細(xì)胞的分化并且決定細(xì)胞命運(yùn)。Hes家族成員高度表達(dá)于神經(jīng)干細(xì)胞中(Hes1和Hes5)[4],是Notch通路的靶基因。Hes1和Hes5在早期發(fā)育的腦中的異位表達(dá)可抑制神經(jīng)元的分化，維持干細(xì)胞數(shù)量。然而,在Hes1和Hes5雙敲除小鼠中,許多放射狀膠質(zhì)細(xì)胞不能維持而提前分化為神經(jīng)元。[7]Hes家族對(duì)于神經(jīng)干細(xì)胞數(shù)量維持的重要性對(duì)于再生醫(yī)學(xué)有很大意義。亦有研究表明[6]，其對(duì)細(xì)胞干性也具有影響。

小鼠模型中[7]，Mash-1在胚胎發(fā)育極早期有表達(dá),其表達(dá)局限在發(fā)育中的神經(jīng)系統(tǒng)中。Mash-1可以對(duì)哺乳動(dòng)物自主神經(jīng)、嗅神經(jīng)視網(wǎng)膜以及端腦神經(jīng)元產(chǎn)生調(diào)控。Mash-1與Hes1共表達(dá)時(shí),存在能夠促進(jìn)GABA能神經(jīng)元形成特定情況,但無(wú)論Hes1還是Mash-1單獨(dú)表達(dá)則不會(huì)產(chǎn)生上述情況。

Hes1的過(guò)表達(dá)可以抑制Mash-1的轉(zhuǎn)錄。Hes因子作用的靶基因包含激活型的Mash-1[4]。通過(guò)直接結(jié)合到啟動(dòng)子部位而抑制Mash-1基因的表達(dá)。因?yàn)榧せ钚偷腷HLH因子可與另一個(gè)bHLH激活物E47形成異源二聚體，由此促進(jìn)向神經(jīng)元的分化，而Hes1可與E47形成一個(gè)非功能性的異源二聚體而抑制正常異源二聚體的形成[8]。綜上所述，Hes1通過(guò)兩個(gè)不同的機(jī)制而拮抗Mash-1的功能轉(zhuǎn)錄水平抑制它的表達(dá)，蛋白與蛋白相互作用的水平抑制其活性。

4 Mash-1基因表達(dá)對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞分化發(fā)育和神經(jīng)發(fā)生的作用

在ESC維持全能性時(shí)，Mash-1基因的轉(zhuǎn)錄受到抑制；一旦神經(jīng)分化發(fā)生，Mash-1基因的轉(zhuǎn)錄則被上調(diào)。敲除Mash-1基因可導(dǎo)致神經(jīng)發(fā)育不全或特定神經(jīng)元亞型的缺失[9]。

4.1 對(duì)干細(xì)胞分化發(fā)育的積極作用 研究表明[10]，在ESC分化過(guò)程中，Hes1基因無(wú)明顯變化，而Mash-1在分化的細(xì)胞中表達(dá)，證明了Mash-1在神經(jīng)發(fā)育中具有很大作用，其表達(dá)影響待分化干細(xì)胞的細(xì)胞命運(yùn)，對(duì)干細(xì)胞維持是消極因素。

GDNF和IL-1α聯(lián)合作用可誘導(dǎo)NSCs以較高的比例水平分化成為多巴胺能神經(jīng)元。熒光定量PCR得出Mash-1基因在分化開(kāi)始后表達(dá)上升，隨時(shí)間延長(zhǎng)表達(dá)升高，以實(shí)驗(yàn)組尤為顯著，Hes1于分化后明顯降低，但時(shí)長(zhǎng)上間比較無(wú)顯著性差異[6,10]。這一結(jié)果即，分化開(kāi)始后Hes1基因表達(dá)降低，減少了與E47的結(jié)合，對(duì)Mash-1的競(jìng)爭(zhēng)性抑制作用由此降低，NSCs向多巴胺能神經(jīng)元分化則受到了促進(jìn)。同時(shí)Mash-1基因的表達(dá)可能在細(xì)胞因子的誘導(dǎo)作用下隨著分化的進(jìn)程逐步升高，進(jìn)一步的加強(qiáng)對(duì)NSCs的分的促進(jìn)作用[11]。

谷氨酸能與GABA能的分化是神經(jīng)元分化過(guò)程中與神經(jīng)發(fā)生一起出現(xiàn)的精細(xì)調(diào)整過(guò)程。這個(gè)過(guò)程可以通過(guò)多種因素調(diào)節(jié)或選擇，包括Mash-1在內(nèi)的神經(jīng)元基因和(或)同源域轉(zhuǎn)錄因子[13]。有絲分裂調(diào)節(jié)因子在谷氨酸能與GABA能分化中的作用很大，可能具有同Mash-1交互的作用。這些過(guò)程背后的因素是不同的[10]，并且可能會(huì)在不同的大腦區(qū)域有所不同。遺憾的是，在神經(jīng)系統(tǒng)的不同區(qū)域具有不同機(jī)制的優(yōu)點(diǎn)尚不太了解。

另有研究表明[13]，移植的神經(jīng)干細(xì)胞可分化為神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細(xì)胞，并在小鼠PSC中表現(xiàn)出典型的興奮性和突觸反應(yīng)?？纱_定EE和Mash-1轉(zhuǎn)導(dǎo)顯著影響移植的NSCs向神經(jīng)元的分化，并抑制NSC分化為神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞和抑制性神經(jīng)元[12]。此外，神經(jīng)決定基因NeuroD的表達(dá)與Mash-1表達(dá)正性相關(guān)[13]，Mash-1起促進(jìn)表達(dá)的作用。bHLH轉(zhuǎn)錄因子Mash-1和Ngn2與神經(jīng)元分化和NSC存活相關(guān)。因此，研究了Mash-1和Ngn2轉(zhuǎn)導(dǎo)對(duì)NSCs移植到完整體感皮層的命運(yùn)的影響，結(jié)果表明[13]，Mash-1和Ngn2轉(zhuǎn)導(dǎo)的NPCs在成人受體體感皮層移植后增強(qiáng)了成熟神經(jīng)元分化并抑制了體內(nèi)的膠質(zhì)分化(盡管該研究中實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組之間的差異僅在Mash-1轉(zhuǎn)導(dǎo)的NPC中達(dá)到顯著性)。

另外有報(bào)道[14]在誘導(dǎo)Mash-1表達(dá)后，體外培養(yǎng)的NPC向神經(jīng)元分化顯著增強(qiáng)。表達(dá)Mash-1的移植NPC在成年大鼠大腦中產(chǎn)生大的移植物，移植Ngn2轉(zhuǎn)導(dǎo)的NPC也增強(qiáng)了神經(jīng)元產(chǎn)量和供體細(xì)胞存活[15]。有研究發(fā)現(xiàn)逆轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)的bHLH轉(zhuǎn)錄因子Ascl1(Mash-1)的過(guò)度表達(dá)改變了增殖的成體海馬干/祖細(xì)胞后代的命運(yùn)，從而導(dǎo)致以犧牲新生神經(jīng)元為代價(jià)的少突神經(jīng)細(xì)胞系的排他性生成[16]。而Mash-1誘導(dǎo)的神經(jīng)球培養(yǎng)系統(tǒng)中體外抑制性神經(jīng)元的分化也歸因于bHLH轉(zhuǎn)錄因子之間的補(bǔ)償和交叉調(diào)節(jié)機(jī)制[17]。

4.2 中樞神經(jīng)系統(tǒng)的影響 在中樞發(fā)育層面，Mash-1在腹側(cè)端腦和腹側(cè)雙眼蛛內(nèi)的特定區(qū)域中以高水平表達(dá)。在沒(méi)有Mash-1的情況下，這些前腦區(qū)域內(nèi)的組織形態(tài)、增殖和基因表達(dá)被破壞[18-19]。Mash-1對(duì)腹側(cè)前腦結(jié)構(gòu)正常發(fā)育是必須的[12]。先前的研究已經(jīng)表明，基因Mash-1的小鼠突變體在自主神經(jīng)系統(tǒng)的嗅覺(jué)上皮和神經(jīng)節(jié)中顯示嚴(yán)重的神經(jīng)元損失，表明Mash-1在周?chē)窠?jīng)系統(tǒng)中神經(jīng)元譜系的發(fā)育中發(fā)揮作用。Mash-1突變小鼠呈現(xiàn)嚴(yán)重的祖細(xì)胞丟失，尤其是內(nèi)側(cè)神經(jīng)節(jié)隆起的室下區(qū)中的神經(jīng)元前體。隨后隨發(fā)育失去基底神經(jīng)節(jié)和大腦皮層的離散神經(jīng)元群體。對(duì)Mash-1功能的候選效應(yīng)子的分析揭示Notch配體Dll1和Dll3以及Notch信號(hào)傳導(dǎo)Hes5的靶標(biāo)不能在Mash-1突變腹側(cè)端腦中表達(dá)[18]。因此，Mash-1是腹側(cè)端腦神經(jīng)發(fā)生的重要調(diào)節(jié)因子，它需要既指定神經(jīng)元前體又控制其產(chǎn)生的時(shí)間。

4.3 周?chē)窠?jīng)系統(tǒng)的影響 在周?chē)窠?jīng)系統(tǒng)中的研究表明[20]，Mash-1具有促進(jìn)神經(jīng)嵴細(xì)胞(Neural crest stem cell，NCSC)分化為自主神經(jīng)元的關(guān)鍵功能。NCSC在體外培養(yǎng)時(shí)，加有誘導(dǎo)性生長(zhǎng)因子會(huì)導(dǎo)致特異性細(xì)胞系產(chǎn)生，可以表現(xiàn)為BMP2上調(diào)Mash-1的表達(dá)促進(jìn)自主類(lèi)神經(jīng)發(fā)生[21]。近年有大量研究指出[22-23]，Mash-1過(guò)表達(dá)有助于神經(jīng)再生修復(fù)。采用鼠干細(xì)胞病毒將Mash-1基因轉(zhuǎn)染CE3小鼠胚胎干細(xì)胞穩(wěn)轉(zhuǎn)株的實(shí)驗(yàn)證明了過(guò)表達(dá)Mash-1基因可促進(jìn)CE3細(xì)胞在脊髓損傷部位分化成神經(jīng)元，可促進(jìn)脊髓損傷的修復(fù)[22]。

5 展 望

臨床層面上，研究[24]指明Mash-1也在腫瘤和中樞疾病中有影響。而這些機(jī)制有待進(jìn)一步詳細(xì)考證。中樞低通氣綜合征(CCHS)和哈達(dá)德(Haddad)綜合征已被證實(shí)與Mash-1相關(guān)[25]。作為新生兒，Mash-1 (+/-)雜合子小鼠表現(xiàn)出對(duì)高碳酸血癥的呼吸機(jī)反應(yīng)受損。Mash-1的人直系同源基因已被作為CCHS的候選基因進(jìn)行了研究[26]。2例CCHS患者(10.5%，2/19)和1例Haddad綜合征患者(9.1%，1/11)發(fā)現(xiàn)HASH-1突變[27]。這與神經(jīng)發(fā)生的過(guò)程是否具有聯(lián)系還尚無(wú)定論?！禖ell》雜志的一篇文章指出：“Achaete-scute復(fù)合體1(Ascl1/Mash1)作為啟動(dòng)神經(jīng)重新編程的轉(zhuǎn)錄因子。它促使神經(jīng)祖細(xì)胞和非神經(jīng)元細(xì)胞退出細(xì)胞周期，并通過(guò)激活神經(jīng)靶基因促進(jìn)神經(jīng)分化，即使是那些通常被抑制的基因[28]。”雖然有很多值得注意的地方，但Ascl1的外源性過(guò)表達(dá)，單獨(dú)或結(jié)合其他因素，作為一種治療腦損傷和癌癥的方法，可能值得進(jìn)一步考慮。而在神經(jīng)退行性疾病中bHLH家族的神經(jīng)再生意義也是未來(lái)的探討方向之一[29]。

神經(jīng)組織再生能力的研究已超過(guò)一個(gè)世紀(jì)。在神經(jīng)生物學(xué)中，對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞自我更新和分化調(diào)控機(jī)制的研究更有意義。目前已經(jīng)了解包括Mash-1在內(nèi)的有多種分子機(jī)制參與神經(jīng)干細(xì)胞的自我更新和分化調(diào)控，包括轉(zhuǎn)錄因子、表觀遺傳、miRNA調(diào)控子和細(xì)胞外信號(hào)等[21]。這些細(xì)胞內(nèi)在基因表達(dá)和外界環(huán)境因素構(gòu)成復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，共同調(diào)節(jié)神經(jīng)干細(xì)胞的自我更新和分化。現(xiàn)在神經(jīng)干細(xì)胞的臨床研究還處于起步階段，對(duì)于其基因分子水平的研究以及對(duì)再生醫(yī)學(xué)臨床化還存在很多問(wèn)題[21]。Mash-1基因表達(dá)水平在干細(xì)胞分化與維持波動(dòng)和其意義還有待詳細(xì)探討。