趙芮 王亮

1南方醫(yī)科大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院（廣州 510282）；2南方醫(yī)科大學(xué)珠江醫(yī)院血液內(nèi)科（廣州 510282）

急性髓系白血?。╝cute myeloid leukemia，AML）是髓系造血干/祖細(xì)胞惡性疾病，是成人白血病最常見(jiàn)的形式。過(guò)去30年來(lái)AML治療僅有輕微改變，預(yù)后仍然較差[1]。因AML的高度異質(zhì)性，臨床已采用針對(duì)特定基因突變的分子靶向藥物與化療藥物聯(lián)合的治療方案：如FMS樣酪氨酸激酶3（fms-like tyrosine kinase 3，F(xiàn)LT3）、BCL2抑制劑、異檸檬酸脫 氫 酶 1/2（isocitrate dehydrogenase1/2，IDH1/2）抑制劑、NMD2抑制劑等分子靶向藥物聯(lián)合化療藥物治療AML，表明了靶向治療的可行性與有效性[2-4]。臨床仍需新型且具有成本效益的前期治療以誘導(dǎo)AML緩解及預(yù)防其復(fù)發(fā)，還需適用于患者復(fù)發(fā)和等待移植期間的橋接療法以改善其預(yù)后。

T細(xì)胞介導(dǎo)的適應(yīng)性免疫是通過(guò)CD4+和CD8+T細(xì)胞的T細(xì)胞受體與抗原遞呈細(xì)胞提呈的肽-主要組織相容性復(fù)合物（major histocompatibility complex，MHC）配體結(jié)合從而激活多種信號(hào)傳導(dǎo)途徑和轉(zhuǎn)錄因子，使T細(xì)胞增殖并發(fā)揮殺傷腫瘤細(xì)胞功能[5]。但隨著參與抗原遞呈的MHC類基因表達(dá)下調(diào)，可導(dǎo)致免疫逃逸致使AML進(jìn)展或復(fù)發(fā)[6]。嵌合抗原受體修飾的T細(xì)胞（chimeric antigen receptor engineered T cell，CAR-T）治療是將一種或多種特異性CAR表達(dá)于患者的T細(xì)胞使其可靶向消滅腫瘤細(xì)胞的過(guò)繼免疫療法。植入CARs的T細(xì)胞可進(jìn)行非MHC依賴性抗原識(shí)別，從而有效地繞過(guò)腫瘤的主要免疫逃逸機(jī)制，如蛋白酶體抗原加工和MHC分子的下調(diào)等，從而特異性殺傷腫瘤細(xì)胞[7]。

目前CAR-T在治療多發(fā)性骨髓瘤、外周T細(xì)胞淋巴瘤、AML的臨床前評(píng)估中被證實(shí)有效，臨床常用的CD19 CAR-T細(xì)胞在治療急性B淋巴細(xì)胞性白血?。˙-cell acute lymphoblastic leukemia，B-ALL）及B細(xì)胞惡性淋巴瘤的臨床試驗(yàn)中也已取得較滿意的療效，從而激起研究者將CAR-T治療應(yīng)用于更多血液腫瘤臨床試驗(yàn)的興趣[8-10]。本文重點(diǎn)介紹近5年內(nèi)CAR-T治療AML的臨床研究進(jìn)展。

1 CAR的結(jié)構(gòu)

典型CAR受體包括胞外區(qū)、跨膜結(jié)構(gòu)域及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)域。胞外區(qū)由信號(hào)肽、抗原識(shí)別區(qū)及鉸鏈區(qū)組成。目前常用跨膜結(jié)構(gòu)域通常來(lái)源于Ⅰ型膜結(jié)合蛋白，如 CD4、CD8、CD28、CD3ζ或 FcεRIγ等。胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域含有第二活化信號(hào)，目前常用的結(jié)構(gòu)域包括具有刺激CD8+中央記憶型T細(xì)胞生長(zhǎng)、增強(qiáng)糖酵解代謝作用的CD28、CD137（4-1BB）、CD134（OX40）、ICOS和CD27等[11]。根據(jù)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域的不同可將CAR分為4代：一代CARs由單鏈抗體（single-chain antibodies，scFv）與包含3個(gè)免疫受體酪氨酸活化基序（immunoreceptor tyrosine-Based activation motif，ITAM）的CD3ζ連接構(gòu)成[12]；為了提高信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的強(qiáng)度，二代CARs的胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域包含一個(gè)共刺激因子；三代CARs的胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域則包含兩個(gè)共刺激因子；最新的四代CAR-T細(xì)胞（T cells redirected for universal cytokine killing，TRUCKs）在二代CARs的基礎(chǔ)上增加了可激活T細(xì)胞表達(dá)轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物如IL-12等細(xì)胞因子的核因子以增強(qiáng)T細(xì)胞活化，調(diào)節(jié)腫瘤血管和免疫微環(huán)境，但TRUCKs目前仍處于測(cè)試階段，臨床試驗(yàn)記錄不足[13]。由于CAR細(xì)胞的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，CAR-T細(xì)胞可介導(dǎo)細(xì)胞毒性T細(xì)胞（cytotoxic T-lymphocytes，CTLs）特異性殺傷腫瘤細(xì)胞。

2 CAR-T細(xì)胞的采集及制備

對(duì)于大多數(shù)患者來(lái)說(shuō)，從外周靜脈血分離單個(gè)核細(xì)胞（peripheral blood mononuclear cells，PBMCs）為CAR-T細(xì)胞制備收集足夠數(shù)量的CD3+細(xì)胞（＞ 0.6× 109）是安全可行的[14]。為提高CAR-T細(xì)胞濃度，在PBMCs分離過(guò)程中可加入磁性顆粒聯(lián)合單克隆抗體靶向選擇CD4+和CD8+細(xì)胞，減少外周血單核細(xì)胞和粒細(xì)胞含量；或采用流式細(xì)胞術(shù)分選出AML原幼細(xì)胞從而提高富集PBMCs濃縮物的T細(xì)胞產(chǎn)量[15-16]。待得到足夠數(shù)量的T細(xì)胞后，可在體外應(yīng)用慢病毒、SB轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)或電穿孔將編碼CAR的DNA或mRNA轉(zhuǎn)染入T細(xì)胞內(nèi)從而獲得細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞（cytokine-induced killer cells，CIK）[17]。待得到足量CAR-T細(xì)胞后，可將其分一次或多次回輸至患者體內(nèi)，CAR-T細(xì)胞的效能并不隨其劑量增加而遞增，回輸入患者體內(nèi)的CAR-T細(xì)胞數(shù)量可參考美國(guó)重組DNA咨詢委員會(huì)的推薦劑量[18]，通?？稍贑AR-T回輸前1～3 d應(yīng)用環(huán)磷酰胺和氟達(dá)拉濱進(jìn)行預(yù)處理以消耗體內(nèi)其淋巴細(xì)胞，提高CAR-T的有效性和持久性，并減少其毒性反應(yīng)[19]。回輸后可通過(guò)定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)檢測(cè)骨髓或外周血中細(xì)胞復(fù)制數(shù)、單光子發(fā)射計(jì)算機(jī)斷層成像術(shù)（single-photon emission computed tomography，SPECT）以檢測(cè)體內(nèi)In111標(biāo)記的CAR-T細(xì)胞等方法評(píng)估其體內(nèi)運(yùn)輸和持久性[20]。

3 CAR-T細(xì)胞在AML的臨床應(yīng)用

目前針對(duì)B-ALL的CAR-T細(xì)胞治療臨床上應(yīng)用最廣泛的靶點(diǎn)為CD19，在CAR-CD19 T細(xì)胞治療難治復(fù)發(fā)性B-ALL的隨訪中，83%的患者可達(dá)到完全緩解，受試患者的中位總生存期可達(dá)12.9個(gè)月（8.7～23.4個(gè)月）[21]。因CAR-T細(xì)胞在治療B-ALL中已證實(shí)其有效性、安全性，因此CAR-T細(xì)胞也被用于治療AML的臨床研究中。

因AML起源于白血病干細(xì)胞（leukemia stem cells，LSCs），因此消除LSC細(xì)胞是治療AML的重要目標(biāo)[22]。LSCs表面表達(dá)與正常骨髓造血干細(xì)胞（hematopoietic stem cells，HSC）相 似 的 抗 原 如CD34++CD38--，除此之外LSCs表面還表達(dá)CD33、CD123、CD44、CD13、CLL-1、CD96、TIM3、CD47、CD32和CD25等抗原，并不是每一個(gè)LSC細(xì)胞均可同時(shí)表達(dá)上述所有抗原，且某些抗原也表達(dá)于正常HSC表面[23]。EHNINGER等[24]通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)了319例AML患者LSC表面抗原，發(fā)現(xiàn)87.8%的AML表達(dá)CD33，9.4%的AML患者表達(dá)CD123而沒(méi)有表達(dá)CD33，69.5%的患者中觀察到同時(shí)存在兩種抗原。

3.1 CD33CD33主要表達(dá)于骨髓多能前體細(xì)胞、單能集落形成細(xì)胞、Kupfer細(xì)胞和肝細(xì)胞等細(xì)胞表面，且87.8%的AML患者骨髓細(xì)胞表面表達(dá)CD33[24]。臨床上已證實(shí)由靶向CD33的單克隆抗體與calicheamicin組成的吉妥珠單抗-奧唑米星（gemtuzumab ozogamicin，GO）可改善AML患者生存率，且對(duì)于誘導(dǎo)化療失敗的患者而言，含GO的化療方案的有效率達(dá)50%，因此CD33可作為治療AML的有效靶點(diǎn)之一[25]。體外的臨床前研究已證實(shí)了CD33 CAR-T細(xì)胞治療AML的可行性，因此CD33 CAR-T細(xì)胞也被應(yīng)用于治療AML的臨床研究中[26]。WANG等[27]臨床試驗(yàn)表明 CD33 CAR-T細(xì)胞治療AML的持久有效性及安全性仍需進(jìn)一步提高以應(yīng)用于治療AML的臨床試驗(yàn)。

3.2 路易斯抗原（Lewis Y antigen，LeY）LeY是核心由四個(gè)己糖單元組成識(shí)別元件的胚胎抗原，在AML患者骨髓中表達(dá)率達(dá)46%且在正常組織中很少表達(dá)，因此LeY抗原可作為CAR-T細(xì)胞治療的靶點(diǎn)[28]。有研究者等[20]將純度為14%～38%的總計(jì)5×108～1.3×109結(jié)構(gòu)為L(zhǎng)eY-scFv-CD28-CD3ζ的CAR-抗LeY T細(xì)胞回輸至4位試驗(yàn)前已接受氟達(dá)拉濱和阿糖胞苷治療的難治復(fù)發(fā)AML患者體內(nèi)。接受CAR-T細(xì)胞輸注患者患者在治療期間均未發(fā)生3～4級(jí)細(xì)胞因子釋放綜合征（cytokine release syndrome，CRS），但CAR-T細(xì)胞回輸48 h后部分病例血清中IFN-γ和IL-2升高后下降，甚至出現(xiàn)病理組織學(xué)顯示有CD8+和AML原始細(xì)胞浸潤(rùn)的皮疹（CD4+CD8+）、發(fā)燒及寒戰(zhàn)反應(yīng)?；颊唠m復(fù)發(fā)但骨髓LeY抗體表達(dá)并未下降，因此推測(cè)AML復(fù)發(fā)與CAR-T細(xì)胞轉(zhuǎn)基因表達(dá)下調(diào)或患者產(chǎn)生免疫抑制環(huán)境有關(guān)。

3.3 NKG2DNKG2D是一種在NK細(xì)胞和活化的CD8+細(xì)胞表面表達(dá)的激活性受體，其識(shí)別配體為MICA/B和UL-16結(jié)合蛋白家族（ULBP1-6）。HILPERT等[29]證實(shí)MICA/B或ULBP1-3存在于74%AML患者的骨髓原始細(xì)胞上，且試驗(yàn)表明采集和生產(chǎn)自體NKG2D CAR-T細(xì)胞的可行性，因此臨床開(kāi)始進(jìn)行NKG2DL CAR-T細(xì)胞治療AML的嘗試[30]。

SALLMAN 等[31]和 BAUMEISTER 等[32]的臨床試驗(yàn)結(jié)果證明了NKG2DL CAR-T細(xì)胞治療AML安全有效，無(wú)CRS、神經(jīng)毒性及脫靶效應(yīng)等毒性作用發(fā)生。但BARAGA?O等[33]研究表明隨著AML患者病情進(jìn)展，NKG2DL可能被DNA甲基化導(dǎo)致表達(dá)沉默致使免疫逃逸。因此未來(lái)仍需更多臨床試驗(yàn)去驗(yàn)證NKG2DL是否可作為合適的CAR-T細(xì)胞治療靶點(diǎn)。

3.4 C型凝集素樣分子-1（c-typelectin-like molecule-1，CLL-1） CLL-1是Ⅱ型跨膜糖蛋白抑制性受體，92%的AML樣本CLL為陽(yáng)性同時(shí)CLL-1不在HSC上表達(dá)，僅在粒細(xì)胞和前體單核細(xì)胞表面高表達(dá)，且CLL-1和CD33共同表達(dá)于95%AML樣品表面，因此CLL-1和CD33可聯(lián)合作為治療AML的靶點(diǎn)[34]。在臨床前試驗(yàn)中，CLL-1 CAR-T細(xì)胞可殺傷AML細(xì)胞同時(shí)對(duì)HSC細(xì)胞無(wú)毒性作用，證實(shí)了CLL-1作為治療AML靶點(diǎn)的可行性與安全性[35]。LIU[36]在第60屆ASH年會(huì)上口頭報(bào)道了1例CLL1-CD33 cCAR-T細(xì)胞治療AML的一期臨床試驗(yàn)結(jié)果，該患者為6歲兒童，曾患有范可尼貧血并最終進(jìn)展為FLT3-ITD基因突變的AML，該患者接受氟達(dá)拉濱和環(huán)磷酰胺的預(yù)處理方案后連續(xù)2 d輸注1×106/（kg·d）CLL1-CD33 cCAR-T細(xì)胞。輸注12 d后該患者骨髓原始細(xì)胞比例由81%升至98%，但于第19天，該患者骨髓原始細(xì)胞消失并達(dá)到微小殘留病變完全緩解。該報(bào)道證明了CLL1-CD33 cCAR-T的安全性及有效性，為進(jìn)一步開(kāi)展CAR-T細(xì)胞治療AML的臨床試驗(yàn)提供了理論依據(jù)。

細(xì)胞及動(dòng)物臨床前實(shí)驗(yàn)中也證實(shí)了CD123[37]、Wilms Tumor 1[38]、CD44v6[39]、folate receptor beta[40]、CD117[41]、CD38[42]、FLT3[43]及 PR1[44]可作為治療AML的靶點(diǎn)，未來(lái)有望在臨床試驗(yàn)中開(kāi)展嵌合上述靶點(diǎn)的CAR-T細(xì)胞治療AML的臨床試驗(yàn)以獲得更有效的治療方案。

4 結(jié)語(yǔ)

綜上，在治療AML的臨床試驗(yàn)中已證實(shí)CAR-T細(xì)胞具有體內(nèi)擴(kuò)增快、持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)等優(yōu)勢(shì)。CAR-T細(xì)胞已成為治療B-ALL及B細(xì)胞惡性淋巴瘤的主要方法之一，但在治療AML的臨床應(yīng)用中仍存在效能不足、特異性低等問(wèn)題。截止目前clinicaltrials.gov所登記的CAR-T細(xì)胞治療AML臨床試驗(yàn)共有21項(xiàng)且已含有UCAR-T 123細(xì)胞。CAR-T細(xì)胞治療AML的臨床試驗(yàn)樣本量仍較少，療效仍不確切，目前需要開(kāi)發(fā)治療AML的有效靶點(diǎn)及更多的臨床試驗(yàn)來(lái)提高CAR-T細(xì)胞對(duì)AML殺傷活性及特異性，相信未來(lái)克服了細(xì)胞毒性作用及提高療效的CAR-T細(xì)胞有望成為誘導(dǎo)AML緩解、預(yù)防AML復(fù)發(fā)并可用于復(fù)發(fā)型AML患者等待移植期間的有效橋接方法。