聶琨，汪陽

(華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬武漢中心醫(yī)院，武漢430014)

骨肉瘤起源于間充質細胞，好發(fā)生于股骨、脛骨、肱骨等部位，是嚴重影響青少年和老年人的骨科常見惡性腫瘤[1]。微小RNA(miRNA)是一類長度20～23 nt的單鏈RNA分子，在多種腫瘤生物學過程中調控基因表達[2]。研究[3,4]顯示，miRNA在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中，如細胞周期、炎癥、應激反應、增殖、轉移、凋亡等過程中起重要調控作用。研究[5～7]發(fā)現，miR-20b在乳腺癌、結直腸癌、黑色素瘤等腫瘤中異常表達。但是，關于miR-20b在骨肉瘤中的表達及其功能的研究較少。2018年1月～2019年3月，我們觀察了miR-20b在不同人骨肉瘤細胞系和正常成骨細胞系中的表達變化及沉默miR-20b對人骨肉瘤細胞系Saos-2增殖、侵襲能力的影響，并探討其可能的機制。

1 材料與方法

1.1 細胞、試劑及儀器 人骨肉瘤細胞系Saos-2、U20S、143B及人正常成骨細胞系hFOB1.19均購自中國醫(yī)學科學院細胞庫，PTEN及GAPDH一抗均購自美國Invitrogen公司，二抗購自美國BD公司，LipofectamineTM2000 reagent購自美國Invitrogen公司，RT-PCR儀購自美國BD公司，HBS-1096B酶標儀購自南京德鐵實驗設備有限公司，蛋白免疫印跡電泳設備購自美國Bio-Rad公司。miR-20b干擾序列miR-20b inhibitor和陰性對照序列scramble均由廣州銳博生物科技有限公司設計合成。

1.2 人骨肉瘤細胞系及人正常成骨細胞系中miR-20b的檢測 采用qRT-PCR法。Saos-2、U20S、143B細胞及hFOB1.19細胞均種植于RPMI1640培養(yǎng)基,在37 ℃、5%CO2條件下于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待48 h后消化傳代，取生長狀態(tài)良好的細胞用于實驗。采用All-in-One miRNA抽提試劑盒和All-in-One miRNA qRT-PCR檢測試劑盒提取并分離RNA，采用Nano Drop 1000分光光度計對RNA的濃度進行測定，以U6為內參，進行熒光定量PCR反應。引物序列如下：miR-20b上游引物為5′-CUCCUAGAGCAGGUAG-3’，下游引物為5′-CUGCACUAGA-3′；U6上游引物為5′-ACTCCAGACATT-3′，下游引物為5′-CCCCTCACTT-3′。PCR反應條件：95 ℃預變性30 s，95 ℃退火5 s，60 ℃延伸20 s，40個循環(huán)。以2-ΔΔCt表示細胞中miR-20b的相對表達量。

1.3 Saos-2細胞的miR-20b干擾序列轉染及轉染后細胞增殖能力觀察、侵襲能力觀察、磷酸酶張力蛋白同源物(PTEN)蛋白檢測

1.3.1 Saos-2細胞的miR-20b干擾序列轉染及分組 將Saos-2細胞接種于12孔板上，分成miR-20b沉默組和陰性對照組，利用LipofectamineTM2000分別轉染miR-20b干擾序列miR-20b inhibitor和陰性對照序列scramble，轉染濃度為300 nmol/孔。兩組細胞轉染24h后，參照“1.2”檢測轉染后兩組細胞中miR-20b的相對表達量。

1.3.2 轉染后兩組Saos-2細胞增殖能力觀察 采用MTT法。將兩組細胞消化成單細胞懸液后，以2×103個/孔將細胞種植于96孔板上，每孔按200 μL的體積上樣，于培養(yǎng)0、24、48、72、96、120 h時，在每孔中加入20 μL MTT溶液，培養(yǎng)1 h后，采用酶標儀測定450 nm波長下的各孔的光密度值(OD值)，以OD值表示細胞增殖能力。

1.3.3 轉染后兩組Saos-2細胞侵襲能力觀察 采用Transwell實驗。按2×104個細胞的標準將兩組細胞接種在碳酸磷脂表面，培養(yǎng)條件為37 ℃，培養(yǎng)時間為24 h，用1%多聚甲醛固定膜下的細胞，采用0.2%結晶紫溶液染色，在200倍鏡視野下隨機取10個視野，計算穿膜細胞數，以穿膜細胞數表示細胞侵襲能力。實驗重復3次，取平均值。

1.3.4 轉染后兩組Saos-2細胞PTEN蛋白檢測 采用Western Blotting法。將兩組細胞裂解、變性后上樣，上樣量為每孔30 μg蛋白，濃縮膠條件為80 V 50 min，分離膠條件為100 V 100min，常規(guī)轉膜，加入PTEN及GAPDH一抗，抗體濃度為1∶200，于4 ℃孵育過夜，加入二抗(1∶500)，37 ℃條件下孵育4 h后，漂洗3次，并經ECL液顯影，采用Quantity One 1-D軟件計算目標蛋白灰度值。目標蛋白相對表達量=目標蛋白灰度值/GAPDH灰度值。實驗重復3次，取平均值。

2 結果

2.1 人骨肉瘤細胞系及人正常成骨細胞系中miR-20b相對表達量比較 人骨肉瘤細胞系Saos-2、U20S、143B及人正常成骨細胞系hFOB1.19中miR-20b的相對表達量分別為3.31±0.26、2.57±0.23、2.03±0.21和1.00±0.02，人骨肉瘤細胞系Saos-2、U20S、143B中miR-20b的相對表達量與正常成骨細胞系hFOB1.19相比，P均<0.01。

2.2 轉染后兩組Saos-2細胞中miR-20b相對表達量比較 miR-20b沉默組Saos-2細胞中miR-20b相對表達量為0.12±0.01，陰性對照組為1.00±0.03，兩組相比，P<0.01，提示沉默miR-20b的Saos-2細胞模型成功建立。

2.3 轉染后兩組Saos-2細胞增殖能力比較 miR-20b沉默組培養(yǎng)0、24、48、72、96、120 h時的OD值分別為0.29±0.02、0.39±0.03、0.62±0.06、0.89±0.07、1.34±0.11、2.02±0.17，陰性對照組培養(yǎng)0、24、48、72、96、120 h時的OD值分別為0.28±0.02、0.49±0.05、1.05±0.08、1.63±0.12、2.57±0.19、3.69±0.25，兩組細胞培養(yǎng)48、72、96、120 h時的OD值相比，P均<0.05。

2.4 轉染后兩組Saos-2細胞侵襲能力比較 miR-20b沉默組穿膜細胞數為(32.5±3.7)個，陰性對照組穿膜細胞數為(73.6±6.8)個，兩組相比，P<0.01。

2.5 轉染后兩組Saos-2細胞中PTEN蛋白相對表達量比較 miR-20b沉默組細胞PTEN蛋白相對表達量為2.37±0.15，陰性對照組細胞PTEN蛋白相對表達量為1.00±0.02，兩組相比，P<0.01。

3 討論

研究[8]顯示，骨肉瘤好發(fā)于兒童和青少年，極易轉移至骨骼、肺部等，預后較差。近年來，由于化療及手術技術的發(fā)展，骨肉瘤患者5年生存率提高至60%～70%[9]。然而，目前對于轉移和復發(fā)的骨肉瘤療效仍不理想。研究[10]表明，miRNAs在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中起重要作用。miRNAs可靶向結合目標基因，并調控下游信號通路，從而影響腫瘤生物學行為[11]。miRNA對靶基因的調控一般是通過其5′末端與靶基因mRNA 3′端UTR部分堿基互補配對實現的，如果靶基因是抑癌或致癌因子，那么miRNA很可能影響癌變[12]。目前，miRNA與骨肉瘤發(fā)生發(fā)展關系的已有相關研究，如miR-143靶向MMP-13調控骨肉瘤轉移[13]，miR-199a-3p低表達于骨肉瘤組織且影響骨肉瘤細胞增殖和遷移[14]，miR-221通過影響PI3K/Akt信號通路影響骨肉瘤細胞凋亡和順鉑耐藥性[15]。

目前，miR-20b已被發(fā)現在多種腫瘤類型中高表達，如乳腺癌[16]、肝癌[17]等，但是在膀胱癌[18]、腎癌[19]中低表達，表明miR-20b表達具有組織特異性，可能在不同腫瘤中發(fā)揮抑癌或促癌功能。Zhou等[16]指出miR-20b過表達促進乳腺癌細胞增殖、克隆形成、DNA合成，而敲除后則抑制腫瘤細胞生長。Wang等[20]發(fā)現，miR-20b表達上調促進食管癌Eca-109細胞遷移、侵襲和增殖，同時抑制細胞凋亡，其機制可能與下調PTEN表達有關。在膀胱癌中，miR-20b靶向調控Sp-1介導的MMP-2表達，抑制EJ細胞生長和致瘤性[18]。本研究中，通過qRT-PCR檢測發(fā)現，人骨肉瘤細胞系Saos-2、U20S、143B中miR-20b異常高表達，提示miR-20b可能在骨肉瘤發(fā)生發(fā)展中起促癌基因的作用。本研究隨后的功能缺失研究表明，miR-20b沉默顯著抑制骨肉瘤Saos-2細胞的增殖和侵襲能力，與相關研究結果一致。

PTEN基因定位于染色體10q23，是蛋白酪氨酸磷酸酶(PTP)家族成員，影響細胞生長、黏附、轉移、侵襲、凋亡等多種生物學過程，目前已被證實與骨肉瘤、前列腺癌等多種惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展相關[21]。研究[22]顯示，在細胞水平，PTEN蛋白具有雙特異性(蛋白質和脂肪)磷酸酶活性，能夠將三磷酸磷脂酰肌醇去磷酸化至二磷酸磷脂酰肌醇，以維持三磷酸磷脂酰肌醇處于低水平狀態(tài)，進而抑制PI3K/Akt信號途徑及維持正常的細胞周期。PI3K/Akt信號途徑在腫瘤細胞中往往處于激活狀態(tài)，通過激活與細胞免疫、增殖、凋亡、存活等基因的轉錄過程，促進腫瘤發(fā)展[23]。此外，PTEN蛋白缺失還可促進TGF-β誘導的細胞運動和侵襲[24]。另外，多個miRNAs被發(fā)現直接或間接參與了PTEN表達的調控，干擾腫瘤生長、進展和轉移，如miR-21過表達靶向PTEN有利于肝癌細胞生長、轉移和侵襲[25]，miR-214靶向PTEN誘導卵巢癌細胞存活及順鉑耐藥性[26]，miR-216a/217通過靶向PTEN和SMAD7激活PI3K/AKT和TGF-β信號途徑，導致肝癌形成和復發(fā)[27]。本研究中miR-20b沉默后PTEN蛋白表達水平升高，推測在骨肉瘤細胞中miR-20b沉默后結合PTEN mRNA 3′端UTR能力下降，PTEN翻譯水平增高，表達增加，進而抑制骨肉瘤細胞增殖和侵襲。

綜上所述，miR-20b在人骨肉瘤細胞系中高表達；沉默miR-20b可抑制人骨肉瘤細胞系Saos-2的增殖和侵襲能力，其機制可能與上調PTEN蛋白表達有關，這為深入闡明和理解骨肉瘤的發(fā)生機制提供一定的參考，并可能成為新的治療靶點。