周祺祺，孫倩，王先火，張會來

(1 天津醫(yī)科大學(xué)腫瘤醫(yī)院/國家腫瘤臨床醫(yī)學(xué)研究中心/天津市“腫瘤防治”重點實驗室/天津市惡性腫瘤臨床醫(yī)學(xué)研究中心/中美淋巴瘤診治中心，天津300060；2 天津醫(yī)科大學(xué)腫瘤醫(yī)院生物技術(shù)研究室/天津市腫瘤免疫與生物治療重點實驗室)

嵌合抗原受體T(CAR-T)細胞移植療法是當(dāng)下腫瘤免疫治療的熱點之一。自2012年起，CAR-T細胞移植療法先后在急性淋巴細胞白血病(ALL)、慢性淋巴細胞白血病(CLL)、B細胞淋巴瘤包括濾泡性淋巴瘤(FL)和彌漫性大B細胞淋巴瘤(DLBCL)的治療中取得前所未有的成功，隨后被美國FDA批準為B細胞ALL和復(fù)發(fā)難治性大B細胞淋巴瘤的三線治療。目前全球有超過100項針對不同靶點的CAR-T細胞的臨床實驗[1]正在進行。盡管CAR-T細胞移植療法能使眾多復(fù)發(fā)難治性腫瘤患者再次獲得緩解，但仍有30%～50%的腫瘤患者在接受CAR-T細胞移植療法治療后1年內(nèi)出現(xiàn)疾病進展或復(fù)發(fā)[2,3]，有10%～20%的患者在接受CAR-T細胞移植療法治療后未得到緩解[2～4]。這些研究結(jié)果提示，應(yīng)用CAR-T細胞移植療法治療腫瘤仍然存在諸多挑戰(zhàn)，其中CAR-T細胞的成功制備、成功移植都會影響其治療效果，而CAR-T細胞的成功制備、成功移植受許多因素的影響?，F(xiàn)將CAR-T細胞制備及臨床應(yīng)用的影響因素研究進展情況綜述如下。

1 CAR-T細胞制備的影響因素

CAR-T細胞制備的影響因素眾多，其中患者T細胞采集數(shù)、患者T細胞質(zhì)量、CAR-T細胞的體外擴增、CD4+/CD8+T細胞、起始T細胞表型、嵌合抗原受體(CAR)結(jié)構(gòu)的構(gòu)建等影響因素的研究較受關(guān)注。

1.1 患者T細胞采集數(shù) 考慮到惡性腫瘤的高侵襲性，成功制備和及時回輸CAR-T細胞是確保該療法有效實施的重要決定因素。CAR-T細胞制備的首要步驟就是采集患者的T細胞。由于多數(shù)患者曾接受具有細胞毒性反應(yīng)的治療，常常導(dǎo)致患者達不到CAR-T細胞移植療法治療前所要求的T細胞數(shù)，而不得不放棄該治療。而一些患者即使能夠采集足夠數(shù)量的T細胞，如果沒有成功制備出相應(yīng)CAR-T細胞，也無法接受治療。在一項針對CD19 CAR-T細胞移植療法治療的Ⅰ期臨床實驗中[4]，兒童的篩選標準規(guī)定中位基線絕對淋巴細胞計數(shù)(ALCs)為1 288/μL(168～4 488/μL)，該標準表明目前CAR-T細胞移植療法治療相關(guān)臨床實驗傾向于選擇ALCs處于正常生理范圍的患者，以此篩除T細胞采集數(shù)不足的患者。而在另一項CAR-T細胞相關(guān)臨床實驗[5]中，入組患者的中位CD3+細胞計數(shù)為567/μL(145～2 144/μL)，中位ALCs為775/μL(230～4 620/μL)。因此，采集足夠數(shù)量的T細胞是接受CAR-T細胞移植療法治療的重要因素之一，而統(tǒng)一標準的篩選條件還需要參考更多的試驗數(shù)據(jù)來明確。

1.2 患者T細胞質(zhì)量 采集的T細胞質(zhì)量也會影響CAR-T細胞的制備。報道[6]顯示，采用接受過化療(如含氯法拉濱、多柔比星的方案)的患者T細胞制備出的CAR-T細胞數(shù)量較少或質(zhì)量較差。此外，在曾接受環(huán)磷酰胺和阿糖胞苷治療的患者中觀察到，T細胞亞群出現(xiàn)選擇性減少[7]。所以盡量在患者接受化療前采集足量健康的T細胞來制備CAR-T細胞，可以提升其質(zhì)量。為解決上述問題，研究者們試圖利用健康供體的T細胞作為替代來制備通用型CAR-T細胞，目前采用異體干細胞[8]制備CAR-T細胞的臨床前研究[9]以及針對移植后復(fù)發(fā)腫瘤患者的臨床實驗正在進行中。研究[8]顯示，采用異體干細胞制備CAR-T細胞的患者出現(xiàn)高級移植物抗宿主病(GVHD)的概率很低，證明了這種方法的可行性。第三方供體制備CAR-T細胞技術(shù)能夠促進通用型CAR-T細胞產(chǎn)品的開發(fā)，從而使更多患者能夠從中獲益[10]。雖然制備這類細胞產(chǎn)品需要額外修飾基因來避免CAR-T細胞的排斥反應(yīng)和GVHD的發(fā)生，但同時提供了克服CAR-T細胞移植療法治療耐藥性機制的契機。

1.3 CAR-T細胞的體外擴增 CAR-T細胞需在體外進行擴增，以達到治療所需細胞數(shù)量。目前有兩種擴增方案用于制備FDA批準的CAR-T細胞產(chǎn)品[11,12]。一種是將CD3單克隆抗體加入培養(yǎng)液來刺激CAR-T細胞活化增殖；另一種是采用CD3/CD28抗體偶聯(lián)磁珠直接對CAR-T細胞進行分離富集后，通過磁珠上的抗CD3和抗CD28抗體介導(dǎo)CAR-T細胞活化增殖。研究[13]發(fā)現(xiàn)，加入細胞因子(如IL-2、IL-7、IL-15)能夠促進CAR-T細胞的體外擴增過程，而不同的細胞因子可能導(dǎo)致CAR-T細胞質(zhì)量不同進而影響療效，但目前尚未知何種細胞因子更具備優(yōu)越性。

1.4 CD4+/CD8+T細胞 幾乎所有CAR-T細胞產(chǎn)品都是由CD4+和CD8+T細胞共同產(chǎn)生，這兩種細胞亞群可能都發(fā)揮著治療作用。不同患者的CD4+/CD8+T細胞存在較大差異，這也可能影響CAR-T細胞的療效。一些臨床前研究[4,14]將CD4+T細胞和CD8+T細胞分別單獨制備的CAR-T細胞以固定的比例回輸給患者，結(jié)果發(fā)現(xiàn)患者的療效提高。但目前有關(guān)不同CD4+/CD8+T細胞的CAR-T細胞療效差異的研究尚未見報道。

1.5 起始T細胞表型 起始T細胞表型也是決定CAR-T細胞臨床療效的重要因素之一。在一項CD19 CAR-T治療CLL患者的臨床實驗[15]中，研究者在治療有效的患者體內(nèi)發(fā)現(xiàn)了富含表達記憶相關(guān)基因的CAR-T細胞群，他們相較無應(yīng)答者具有數(shù)量更多的高表達IL-6受體的CD27+PD-1-CD8+CAR-T細胞。因此篩選具有特定表型的起始T細胞有可能提高CAR-T細胞制備成功率和療效[16]。

1.6 CAR結(jié)構(gòu)的構(gòu)建 構(gòu)建CAR結(jié)構(gòu)的方法不同也會影響CAR-T細胞特性，如擴增動力學(xué)、持續(xù)時間以及后續(xù)療效。目前大多數(shù)臨床實驗采用的是第二代CAR-T細胞，它在第一代CAR-T細胞CD3ζ鏈的基礎(chǔ)上增加了單一共刺激結(jié)構(gòu)域CD28或4-1BB[17]。采用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體或慢病毒載體構(gòu)建出的不同CAR結(jié)構(gòu)會影響其基因轉(zhuǎn)染效率進而影響CAR-T細胞的活性。在FDA已批準的CAR-T細胞產(chǎn)品以及大多數(shù)臨床實驗中均采用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體將CAR基因片段插入T細胞基因組中來構(gòu)建CAR結(jié)構(gòu)。目前在一些臨床實驗[18]中，采用轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)實現(xiàn)了不依賴載體將CAR基因插入T細胞基因組并得到有活性的CAR-T細胞，證明了該方法的安全性和可行性[19]。

2 CAR-T細胞臨床應(yīng)用的影響因素

許多因素對CAR-T細胞的臨床應(yīng)用產(chǎn)生影響，其中對CAR-T細胞移植、CAR-T細胞的體內(nèi)活化和擴增、CAR-T細胞治療適應(yīng)人群、腫瘤細胞抗原丟失或缺失、細胞因子釋放綜合征(CRS)等的研究較多。

2.1 CAR-T細胞移植 如果在患者發(fā)生疾病進展或嚴重并發(fā)癥之前未能及時移植CAR-T細胞，會影響治療的成功率。一項CD19 CAR-T細胞相關(guān)臨床研究[3]中，92例患者采集了T細胞，有17例患者最終沒有接受CAR-T細胞移植，有7例患者在CAR-T細胞移植前死亡，部分患者在治療中出現(xiàn)不良事件(真菌疾病或GVHD)導(dǎo)致患者終止移植CAR-T細胞。在另一項研究[2]中，共有78例患者采集了T細胞，在67例進行CAR-T細胞制備的患者中有13例沒有接受移植，原因包括部分CAR-T細胞制備失敗以及部分患者病情加重而失去治療機會。因此，縮短CAR-T細胞移植延遲就能使部分患者在發(fā)生疾病進展或嚴重并發(fā)癥之前接受CAR-T細胞移植療法治療，從而增加CAR-T細胞移植療法獲益的人數(shù)。未來CAR-T細胞療法的商業(yè)化以及更簡化的制備方法有望降低因CAR-T細胞移植時間延遲、錯失治療時機導(dǎo)致治療失敗的概率。

2.2 CAR-T細胞的體內(nèi)活化和擴增 臨床研究[2～4]報道，CAR-T細胞移植療法治療所需的有效劑量非常小，目前的方案為患者每千克體質(zhì)量輸注(0.2～5.0)×106個CAR-T細胞或每次輸注(0.1～2.5)×108個CAR-T細胞，因此回輸后的體內(nèi)細胞活化和指數(shù)擴增是至關(guān)重要的。其中，CAR-T細胞質(zhì)量、初始T細胞表型、細胞因子等在CAR-T細胞體內(nèi)擴增中起著重要作用，疾病負荷及[4]淋巴細胞清除率對CAR-T細胞的體內(nèi)擴增也起到關(guān)鍵作用。臨床通常采用氟達拉濱為主的藥物清除淋巴細胞[14]來促進CAR-T細胞的體內(nèi)擴增，然而氟達拉濱卻可能引發(fā)CAR-T細胞相關(guān)神經(jīng)毒性[20]，能否不依賴細胞毒性化學(xué)療法來實現(xiàn)CAR-T細胞體內(nèi)擴增仍有待研究。

2.3 CAR-T細胞移植療法治療適應(yīng)人群 盡管CD19 CAR-T細胞治療療效較高，但能夠接受這種療法的患者十分有限。獲取CAR-T細胞產(chǎn)品的治療授權(quán)，要求機構(gòu)必須具備遵守產(chǎn)品生產(chǎn)和管理規(guī)程并安全管理患者的能力，中國缺乏CAR-T細胞產(chǎn)品授權(quán)的癌癥中心，大量患者沒有機會接受相關(guān)治療。此外，高昂的費用也嚴重阻礙了患者接受CAR-T細胞移植療法治療[21]。未來優(yōu)化制備方法、降低成本將有助于解決費用和保險覆蓋范圍方面的問題，使更多的患者不再由于經(jīng)濟問題而無緣接受CAR-T細胞移植療法治療。雖然CAR-T細胞在治療血液系統(tǒng)腫瘤時取得了較好的成績，但在治療實體瘤時還面臨諸多挑戰(zhàn)，例如實體瘤特異性靶點選擇困難、腫瘤微環(huán)境等因素，會抑制CAR-T細胞的活化擴增、效能以及致死等嚴重不良反應(yīng)[22]等，這些因素導(dǎo)致實體瘤患者群體目前難以從CAR-T細胞移植療法治療中獲益。

2.4 腫瘤細胞抗原丟失或缺失 靶抗原丟失是引起CAR-T細胞移植療法治療后疾病復(fù)發(fā)的潛在因素之一。目前已知的CD19抗原丟失的機制是，基因選擇性剪接導(dǎo)致細胞表面CD19表達降低或翻譯出異型CD19蛋白破壞靶表位[23]。當(dāng)腫瘤細胞表面抗原表達量減少或密度下降至一定程度時，腫瘤細胞即可逃避CAR-T細胞攻擊而引起腫瘤復(fù)發(fā)，而個體間最低抗原密度閾值差異則是導(dǎo)致部分患者出現(xiàn)復(fù)發(fā)或耐藥的原因之一[24]。雖然有研究[25]報道，部分患者存在CD19陰性的惡性B細胞的祖細胞，但實際只有很少的患者在診斷時檢測出CD19陰性或少量表達CD19的惡性B細胞[26]，而在KMT2A(MLL)基因重排的ALL嬰兒患者中常檢測到CD22陰性的細胞亞群[27]，因此患者在接受CAR-T治療前還應(yīng)進行更加詳細的抗原表達分析檢測。目前流式細胞術(shù)在監(jiān)測最小殘留病灶、預(yù)測患者預(yù)后中扮演重要角色，當(dāng)腫瘤負擔(dān)較輕時則需要更復(fù)雜的流式細胞術(shù)門控方法及其他檢測單細胞免疫表型特征的技術(shù)，來預(yù)測患者發(fā)生抗原丟失性腫瘤復(fù)發(fā)的風(fēng)險。而對于那些CAR-T細胞療法未完全消除但流式細胞術(shù)難以檢測的惡性細胞群引起的腫瘤復(fù)發(fā)，可以通過采用輔助PCR技術(shù)以及免疫球蛋白重鏈(IgH)VDJ重排分子評估技術(shù)隨時間追蹤腫瘤細胞來預(yù)測。鑒于抗原丟失是導(dǎo)致腫瘤細胞逃逸CAR-T細胞移植療法治療的重要機制之一，研究者們嘗試構(gòu)建多抗原靶向的CAR結(jié)構(gòu)以應(yīng)對腫瘤的固有異質(zhì)性并試圖以此降低疾病復(fù)發(fā)的可能?，F(xiàn)已有證明多靶點CAR結(jié)構(gòu)有效性的臨床前數(shù)據(jù)發(fā)表[28]，同時相關(guān)臨床實驗也正在進行中。

2.5 細胞因子釋放綜合征(CRS) CRS是CAR-T細胞移植療法治療最常見的相關(guān)毒性反應(yīng)[24,29,30]。目前CRS臨床管理指南的制定主要參考了CD19 CAR-T細胞的臨床實驗結(jié)果，但不同靶向抗原的CAR-T細胞引起的CRS相關(guān)臨床特征不盡相同，例如在接受CD22 CAR-T細胞移植療法治療的患者中觀察到的CRS反應(yīng)不似在CD19 CAR-T細胞移植療法治療中嚴重[24]，但CD22 CAR-T細胞移植療法治療會引發(fā)如凝血病等其他毒性反應(yīng)，因此應(yīng)對CAR-T細胞移植療法治療的毒性反應(yīng)的干預(yù)策略應(yīng)更具有針對性。目前數(shù)據(jù)表明早期干預(yù)可以在有效地降低CRS的嚴重程度的同時不破壞CAR-T細胞擴增峰值及療效的持久性，但是這一數(shù)據(jù)僅來自采用一種CAR結(jié)構(gòu)的單一試驗，因此可能需要開展更多的研究來證實。未來，如何在發(fā)揮CAR-T細胞療效最大化的前提下，尋找最佳干預(yù)措施及最佳干預(yù)時機來減輕或避免CRS等毒性反應(yīng)將是一個極具挑戰(zhàn)性的研究課題。目前一項關(guān)于研究托珠單抗聯(lián)合抗IL-6療法治療CD19 CAR-T細胞相關(guān)CRS最佳時機的臨床實驗正在進行中。

綜上所述，CAR-T細胞移植療法治療是目前極具前景的腫瘤免疫療法之一，在篩選患者、采集T細胞、制備CAR-T細胞、CAR-T細胞體外擴增、移植CAR-T細胞、CAR-T細胞體內(nèi)活化與擴增等實施CAR-T細胞移植療法治療的每一個步驟中都存在著能夠影響最終治療效果的因素。許多臨床實驗的結(jié)果顯示，仍存在部分患者在接受CAR-T細胞移植療法治療后未能獲得長期緩解，且CAR-T細胞移植療法對于部分因腫瘤細胞抗原丟失而致復(fù)發(fā)的患者療效甚微。與此同時，CAR-T細胞的毒性反應(yīng)也限制了其廣泛應(yīng)用。但正是這些影響因素提示人們更加有方向性地探索CAR-T細胞移植療法所面臨的問題。在這個快速發(fā)展的研究領(lǐng)域，人們更加應(yīng)該將研究重點落在克服已發(fā)現(xiàn)的問題上，這樣在不久的將來CAR-T細胞移植療法將會得到更廣泛地應(yīng)用。