楊駿杰 張 巖 李晨光 王 晶 趙永見 趙東峰 張 浩 王擁軍 施 杞 舒 冰

1959年，Hirschfeld等[1]首次在人體血漿中發(fā)現(xiàn)了一種新的蛋白質(zhì)，根據(jù)其免疫學(xué)特性命名為簇特異性成分(group-specific component)，簡稱為GC蛋白；同年，Thomas等也在人體血漿中發(fā)現(xiàn)了一種新的蛋白質(zhì)，因其能與維生素D相結(jié)合而被稱為維生素D結(jié)合蛋白(DBP)。直至1974年，經(jīng)Daiger等[2]驗證GC蛋白也能特異性結(jié)合維生素D，從而認定兩者為同一蛋白。DBP作為多基因簇家族的成員之一，具有多種生理功能，包括維生素D及其代謝產(chǎn)物的轉(zhuǎn)運、巨噬細胞活化、肌動蛋白清除和脂肪酸的結(jié)合等[3]。隨著對DBP基因多態(tài)性的研究不斷深入，DBP在多種疾病的發(fā)生和發(fā)展中的意義越來越受到關(guān)注。

1 DBP的一般特性

1.1 DBP的結(jié)構(gòu) 人類DBP基因位于4號染色體(4q12-q13)的長臂上，其DNA長度>35 kb，包含13個外顯子和12個內(nèi)含子。DBP是一種相對分子質(zhì)量為52 000～59 000的血清α2-球蛋白[4]，其氨基酸序列由458個氨基酸組成，包含3個區(qū)域，在屬性上相互重疊[5]。第1個區(qū)域(成熟肽aa.1-191)包含了與維生素D(aa.35-49)、細胞和肌動蛋白結(jié)合的序列；第2個區(qū)域(aa.192-378)負責(zé)與肌動蛋白結(jié)合，以及介導(dǎo)大多數(shù)的相互作用；第3個區(qū)域的作用類似于第1個區(qū)域，與細胞、肌動蛋白分子相互結(jié)合，但不能直接與維生素D相互作用[6]。

1.2 DBP的同源性 DBP屬于多基因簇家族，其家族成員包括白蛋白(albumin，ALB)、甲胎蛋白(α-fetoprotein，AFP)和α白蛋白(α-albumin)[7]，它們具有一系列高度保守的半胱氨酸殘基和相似的二級折疊結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)有3個內(nèi)部同源區(qū)域。DBP蛋白結(jié)構(gòu)與其他家族成員的差異在于第3個區(qū)域被124個氨基酸截斷，并且在編碼區(qū)域內(nèi)有1個固定的內(nèi)含子[8]，使DBP的基因轉(zhuǎn)錄方向與其他家族成員相反。

1.3 DBP的多態(tài)性 采用不同的電泳方法[9]檢測證實，人類和靈長類動物體內(nèi)的DBP具有高度的基因多態(tài)性。DBP蛋白最為常見的3種類型為GC1F、GC1S、GC2，GC1F和GC1S由位于GC1上的等位基因編碼而來，兩者的一級結(jié)構(gòu)相同，但GC1F 416位上的天冬氨酸被谷氨酸代替，成為GC1S。GC1F與GC2的區(qū)別為單個氨基酸(分別為蘇氨酸和賴氨酸)位點的變化，GC1S與GC2的區(qū)別僅為兩個氨基酸(第416和420號位)位置互換[10]。這些氨基酸的區(qū)別說明這3個蛋白的編碼基因結(jié)構(gòu)差異僅由單個堿基的轉(zhuǎn)換或顛換所致，即單核苷酸多態(tài)性(SNP)。中國人群中最常見的DBP基因單核苷酸位點為rs4588和rs7041，已有相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)這兩個位點與DBP水平和結(jié)合活性均具有高度的相關(guān)性。rs4588和rs7041基因的獨特組合會產(chǎn)生氨基酸變化，從而導(dǎo)致DBP蛋白結(jié)構(gòu)發(fā)生變化[1]。此外，SNP位點rs2282679與骨代謝疾病、肥胖、心肺疾病等相關(guān)。

1.4 DBP多態(tài)性的影響因素 Dowdy等[11]的早期研究發(fā)現(xiàn)，在紫外線照射下，DBP能結(jié)合皮膚合成的維生素D3，并轉(zhuǎn)運至其他組織，以此推斷DBP基因分布特征與日照強度、皮膚色素沉著和緯度差異等因素相關(guān)。Kamboh等[12]的研究結(jié)果顯示，黑種人和黃種人的GC1F等位基因的分布頻率較高，而白種人中GC1S等位基因的分布頻率更高。Powe等[13]的研究進一步證實，DBP基因型存在種族間差異，黑種人血清總25羥維生素D[25(OH)D]和DBP水平均顯著低于白種人。黑種人GC1F等位基因的分布頻率為92.7%，GC1S、GC2等位基因的分布頻率分別為5.2%和2.1%；白種人GC1S等位基因的分布頻率為76.0%，GC1F、GC2等位基因的分布頻率分別為6.0%和18.0%[13]。中國人群中3種常見的DBP基因分布頻率的差異不明顯，南方人GC1F等位基因的分布頻率略高于北方人，如臺灣人為58%，華東和北京地區(qū)人群分別為39%和48%；南方人GC1F、GC1S、GC2等位基因和變異基因分布頻率分別為44.06%、29.65%、24.53%和1.76%，北方人分別為33.55%、37.49%、28.60%和0.36%[14]。

2 DBP的功能

2.1 結(jié)合和轉(zhuǎn)運維生素D的作用 DBP的主要功能是與維生素D及其代謝物相結(jié)合，使其溶解度升高，從而進行體內(nèi)轉(zhuǎn)運。血清中的維生素D在肝臟被羥基化形成25(OH)D，這是血液中維生素D的主要形式，25(OH)D被運送至腎臟，經(jīng)過第2次羥基化形成1，25羥維生素D[1,25(OH)2D]，即維生素D的生物活性形式[15]。

血循環(huán)中85%～90%的25(OH)D和1,25(OH)2D與DBP緊密結(jié)合，其結(jié)合位點在DBP第1結(jié)構(gòu)域的N末端，其余的25(OH)D和1,25(OH)2D與ALB結(jié)合，完成在體內(nèi)的運輸[16]。與DBP結(jié)合的25(OH)D和1,25(OH)2D均無生物活性，不能被靶細胞利用；DBP基因多態(tài)性(rs4588和rs7041)對血循環(huán)中DBP水平和DBP與維生素D的結(jié)合力產(chǎn)生不同程度的影響，且DBP水平與總25(OH)D水平呈正相關(guān)，與活性25(OH)D水平呈負相關(guān)[1]。

2.2 肌動蛋白的清除作用 肌動蛋白是一種高度保守的細胞骨架成分，有兩種分子形式，即球狀單體(G-actin)和絲狀聚合形式(F-actin)[17]。當組織損傷或細胞死亡時，細胞膜被破壞，大量的肌動蛋白釋放入血液中。在細胞外，G-actin與凝血因子Ⅴa聚合成F-actin，如不能及時清除就會導(dǎo)致血管阻塞和器官功能障礙的發(fā)生。

在血管中有復(fù)雜的肌動蛋白清除系統(tǒng)，DBP和凝膠球蛋白也有參與。首先凝膠球蛋白解離F-actin形成G-actin，DBP與G-actin具有高度親和力，兩者結(jié)合形成GC∶G-actin復(fù)合物，從而將G-actin隔離，防止F-actin在血循環(huán)中大量積聚[18]。嚴重的細胞或組織壞死會降低血清DBP水平，其程度與器官功能障礙、呼吸功能衰竭、血循環(huán)衰竭、膿毒癥的發(fā)生有關(guān)，這時觀察DBP水平可有助于識別患者細胞或組織壞死損傷后的死亡風(fēng)險。

2.3 脂肪酸轉(zhuǎn)運 DBP的第3個重要功能是結(jié)合不飽和脂肪酸與飽和脂肪酸。DBP與ALB之間存在顯著的結(jié)構(gòu)同源性，對脂肪酸具有高度的親和力，但相較于ALB，DBP對脂肪酸的結(jié)合能力相對較弱[19]。體內(nèi)與DBP結(jié)合的脂肪酸少于其總量的5%，且多以不飽和形式存在[20]。此外，單不飽和脂肪酸和不飽和脂肪酸可降低25(OH)D和1,25(OH)2D與DBP的親和力，但飽和脂肪酸卻沒有影響。

2.4 DBP-巨噬細胞活化因子(MAF) DBP具有巨噬細胞活化作用，經(jīng)過T淋巴細胞的唾液酸酶脫糖基化和B淋巴細胞的β-半乳糖苷酶的脫糖基化后，DBP可轉(zhuǎn)變成為強大的巨噬細胞活化分子，即DBP-MAF。DBP-MAF具有多種復(fù)雜的功能,在不同活化條件下,可與細胞表面不同受體結(jié)合，發(fā)揮不同的功能。Kanda等[21]對不同物種(人、豬、鼠)和組織來源(腦、主動脈、臍帶和角膜)的內(nèi)皮細胞進行體內(nèi)、體外培養(yǎng)和刺激，并觀察DBP-MAF對其的增殖作用；結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在成纖維細胞生長因子(FGF)-2或血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)-A的刺激下，DBP-MAF具有抗內(nèi)皮細胞增殖和抗血管生成的作用。Gumireddy等[22]研究了DBP-MAF對RAW 264.7巨噬細胞及其細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在巨噬細胞系炎性反應(yīng)中，DBP-MAF能通過激活p38和c-Jun氨基末端激酶1/2(JNK1/2)信號通路增加促凋亡酶的活性，誘導(dǎo)細胞凋亡，而DBP-MAF的前體DBP并不能誘導(dǎo)細胞凋亡。Nonaka等[23]研究了DBP-MAF對于肝癌生長的影響，將肝腫瘤細胞移植到嚴重聯(lián)合免疫缺陷(SCID)小鼠的背部，給予小鼠DBP-MAF皮下注射，治療21 d后，小鼠腫瘤生長明顯受到抑制。此外，Schneider等[24]的研究證實，DBP-MAF能通過上調(diào)變異細胞中的氧化代謝水平，增加破骨細胞的數(shù)量和改善細胞結(jié)構(gòu)，從而部分改善骨質(zhì)疏松癥中的骨結(jié)構(gòu)缺陷。

3 DBP與疾病

3.1 骨組織疾病 DBP的基因多態(tài)性會影響維生素D及其代謝產(chǎn)物水平，從而與骨代謝密切相關(guān)。王月儉等[25]對中國人群中267例類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(RA)患者和160名健康對照人群的DBP基因的SNP位點進行分析，發(fā)現(xiàn)RA患者滑膜中DBP表達量顯著降低；研究還進一步對389例RA患者和371名健康對照者進行驗證，發(fā)現(xiàn)RA患者與健康對照者DBP的SNP位點rs2282679的等位基因分布頻率的差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，提示SNP位點rs2282679與RA的發(fā)病相關(guān)。

Ezura等[26]對384名絕經(jīng)后日本女性的DBP基因中13個SNP位點進行分析的結(jié)果顯示，GC1S與另一SNP位點(IVS1+827C>T)的組合與骨密度(BMD)的相關(guān)性最強。該研究結(jié)果表明，DBP基因中多個SNP位點的不同組合可產(chǎn)生不同的效應(yīng)，從而可能導(dǎo)致機體對骨量減少和骨質(zhì)疏松癥的易感性不同。

Rapado等[27]對140名老年男性的BMD和DBP水平進行分析，結(jié)果顯示，血清DBP水平與老年男性腰椎BMD呈正相關(guān)。Al-Oanzi等[28]對170名男性受試者的DBP基因多態(tài)性的研究結(jié)果表明，DBP基因中的(TAAA)n-Alu重復(fù)序列與BMD下降、腰椎骨折有關(guān)。而一項針對211名70歲以上男性的研究[29]結(jié)果顯示，無論是傳統(tǒng)的DBP基因型還是含(TAAA)n-Alu重復(fù)序列的DBP基因型，均與BMD或骨轉(zhuǎn)換指標無關(guān)。因此，DBP基因多態(tài)性與男性BMD之間的相關(guān)性仍有待進一步研究闡明。

3.2 甲狀腺自身免疫 維生素D具有免疫調(diào)節(jié)功能，單核細胞、樹突狀細胞、T和B淋巴細胞中均存在1,25(OH)2D的受體。維生素D對免疫系統(tǒng)的影響在于調(diào)節(jié)免疫細胞的增殖和分化，從而導(dǎo)致淋巴細胞，特別是輔助性T淋巴細胞(Th)1活性下降，并導(dǎo)致促炎細胞因子表達減少。此外，維生素D缺乏與甲狀腺自身免疫風(fēng)險的增加密切相關(guān)，如毒性彌漫性甲狀腺腫(Graves病)患者體內(nèi)的維生素D水平顯著低于非自身免疫甲狀腺功能亢進患者，補充1,25(OH)2D可預(yù)防Graves病、甲狀腺炎等免疫性甲狀腺疾病[30]。Pani等[31]進一步對95例Graves病患者的家系和92例橋本甲狀腺炎患者的家系中共計561名白種人進行研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，DBP基因多態(tài)性與Graves的疾病易感性相關(guān)，但與橋本甲狀腺炎的易感性無關(guān)。

3.3 糖尿病 DBP基因多態(tài)性與糖尿病相關(guān)性的研究目前仍存在爭議。1型糖尿病是一種自身免疫性疾病，其病理機制與T淋巴細胞錯誤地破壞胰島內(nèi)產(chǎn)生胰島素的β細胞(細胞免疫應(yīng)答)有關(guān)。Kodama等[32]對331例1型糖尿病患者和77名健康者進行研究，結(jié)果顯示，1型糖尿病患者血清抗-DBP自身抗體(DBP-Abs)水平和陽性頻率均顯著高于健康者，且1型糖尿病患者血清維生素D水平與DBP-Abs水平呈負相關(guān)。免疫組織化學(xué)定位顯示，DBP在胰島細胞中有特異性表達，DBP與1型糖尿病的自身抗原有關(guān)。Khodier等[33]探討了尿維生素D結(jié)合蛋白(UVDBP)作為糖尿病腎病(DN)新的生物標志物的價值，研究采用ELISA法測定45例DN患者和15名健康者的UVDBP水平，結(jié)果顯示，DN患者的UVDBP水平顯著升高。有學(xué)者對2型糖尿病患者血清維生素D水平與DBP基因多態(tài)性間的關(guān)系進行研究。Rahman等[34]采集104例2型糖尿病患者和107名健康志愿者的血樣，結(jié)果顯示，2型糖尿病患者血清維生素D水平顯著低于健康志愿者，2型糖尿病患者維生素D水平與其空腹血糖水平呈負相關(guān)；2型糖尿病患者血清DBP中rs7041的谷氨酸和rs4588的賴氨酸水平均顯著高于健康志愿者。因此，2型糖尿病患者谷氨酸和賴氨酸水平升高與DBP中rs7041和rs4588基因型密切相關(guān)。

而國內(nèi)研究結(jié)果顯示，DBP基因多態(tài)性與糖尿病間的關(guān)系并不顯著。王艷波等[35]依據(jù)美國糖尿病學(xué)會(ADA)1997年糖尿病診斷標準將上海地區(qū)采樣對象分為糖代謝異常組和健康對照組，糖代謝異常組為2型糖尿病患者166例，其中糖耐量受損18例；健康對照組為糖代謝異常組的非糖尿病親屬130名，均為口服葡萄糖耐量試驗正常者，分析DBP基因多態(tài)性與2型糖尿病的關(guān)系。結(jié)果顯示，DBP基因多態(tài)性與上海地區(qū)2型糖尿病不相關(guān)。邵雪景等[36]采用PCR-限制性片段長度多態(tài)分析技術(shù)(RFLP)技術(shù)檢測105例2型糖尿病患者和105名健康者的DBP基因型，采用ELISA法測定血清1,25(OH)2D水平，并檢測相關(guān)臨床和生化指標，比較兩組DBP基因型及其等位基因分布頻率的差異和不同基因型血清1,25(OH)2D等相關(guān)指標的差異；結(jié)果顯示，兩組間DBP受體基因Asp416Glu、Thr420Lys多態(tài)性位點基因型和等位基因分布頻率的差異均無統(tǒng)計學(xué)意義，不同基因型間血清1,25(OH)2D水平的差異無統(tǒng)計學(xué)意義。而王媛等[37]采用ELISA法檢測34例2型糖尿病患者和11名健康者血漿DBP和晨UVDBP水平，同時檢測相關(guān)生化指標。結(jié)果顯示，2型糖尿病患者的血清DBP、UVDBP、UVDBP/肌酐(Cr)水平均顯著高于健康者；UVDBP水平與尿白蛋白(UALB)、血尿素(UREA)、血Cr均呈正相關(guān)，與ALB呈負相關(guān)，但與其他生化指標均不相關(guān)。

3.4 肥胖 脂肪組織是維生素D代謝的相關(guān)組織，也是維生素D的儲存組織。1,25(OH)2D能夠通過維生素D受體(VDR)改變脂肪細胞和脂肪組織生理狀態(tài)，減少脂肪組織中促炎性細胞因子的表達[38]。Almesri等[39]對406名BMI不同的受試者進行研究的結(jié)果顯示，rs7041等位基因(G)和罕見基因型(GG)均與BMI升高相關(guān)，但并不影響25(OH)D水平；而rs2282679和rs4588等位基因(G)則與血漿25(OH)D水平降低有關(guān)，與BMI無關(guān)。將研究對象按性別分組后進行的研究結(jié)果顯示，rs7041的GG基因型和rs4588的CC基因型均與女性BMI升高相關(guān)，rs4588的CC基因型與男性25(OH)D水平降低相關(guān)。值得注意的是，常見的單倍型與BMI無關(guān)。因此，DBP(rs2282679、rs7041、rs4588)的基因多態(tài)性與肥胖和25(OH)D水平相關(guān)。

王重建等[40]檢測211名肥胖者和213名體重正常者的DBP基因rs7041位點基因型，結(jié)果顯示，肥胖者與體重正常者間DBP基因rs7041位點TG+GG和TT基因型分布頻率的差異均有統(tǒng)計學(xué)意義，肥胖者rs7041位點等位基因G分布頻率顯著高于體重正常者，且DBP基因rs7041位點TG基因型攜帶者的肥胖危險性升高。

3.5 肺病 肺病相關(guān)DBP的基因多態(tài)性已有廣泛研究，已證實DBP作為肺結(jié)核病生物標志物具有潛力。王美芹等[41]比較了120例男性慢性阻塞性肺疾病(COPD)患者和112名健康男性志愿者的血清25(OH)D水平、DBP rs2282679位點的基因型和分布頻率，結(jié)果顯示，健康男性志愿者的25(OH)D水平顯著高于COPD患者，兩者間rs2282679位點的基因型和分布頻率的差異均有統(tǒng)計學(xué)意義，CC基因型的COPD患病率分別較AA和AC基因型高35.8%和16.7%。由此可見，DBP基因rs2282679多態(tài)性與COPD的發(fā)生相關(guān)，其中CC基因型與COPD易患性、25(OH)D水平關(guān)系密切，或可作為COPD易患性篩選的突變位點。

Al-azzawi等[42]也對80例COPD患者[根據(jù)1秒鐘用力呼氣容積與肺活量或用力肺活量的比值(FEV1%)分為輕、中、重組]和80名健康對照者的血清25(OH)D和DBP基因多態(tài)性進行分析，結(jié)果顯示，COPD患者血清25(OH)D水平顯著低于健康對照者，DBP中GC1F-1S基因型和GC1F基因型變異頻率均顯著高于健康對照者，且重度COPD患者中GC1F-1S基因型變異頻率顯著高于輕度COPD患者。

3.6 肝病 DBP是一種合成于肝臟的多功能血漿球蛋白，在細胞外肌動蛋白和內(nèi)毒素清除過程中發(fā)揮重要作用。1985年，有學(xué)者[43]首次發(fā)現(xiàn)急性肝衰竭患者的血漿游離DBP水平顯著降低。對肝移植患者進行的研究發(fā)現(xiàn)，移植后血清總游離25(OH)D和DBP水平均顯著升高。由此可見，肝臟的損害能影響維生素D和DBP的代謝。Peng等[44]研究了肝細胞癌易感性與中國人口中VDR和DBP基因多態(tài)性的相關(guān)性，結(jié)果顯示，VDR rs2228570和DBP rs7041的多態(tài)性可能會增加中國人群對肝細胞癌的易感性。

4 結(jié) 論

DBP作為一個群特異性蛋白家族的成員具有多種重要的生物學(xué)功能，且常常作為骨代謝的相關(guān)指標反映相關(guān)疾病。隨著對DBP基因多態(tài)性的研究，DBP與骨代謝以外疾病的關(guān)系日益受到重視。由于不同位點的作用機制不盡相同，相同位點的研究結(jié)果存在差異，還有一些未被深入探討的位點，這些問題都亟待進一步研究加以闡明。國內(nèi)外對同一位點研究的結(jié)論存在差異，考慮可能是由人種、地域和生活環(huán)境的差別等多方面因素的影響所致。因此，需要針對不同地域的人群進行獨立分析，通過分析各因素之間的相互作用得出客觀的結(jié)論。相信隨著對DBP基因多態(tài)性研究的不斷深入，必將提高其相關(guān)疾病的預(yù)防、診斷和治療水平。