閆思宇, 朱鵬, 龔偉*, 王景燕, 吳開(kāi)志, 吳春艷, 李海平, 龔毅紅, 段瓊

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基于RAD-SNPs分析的四川核桃良種資源的遺傳多樣性研究

閆思宇1*, 朱鵬1*, 龔偉1**, 王景燕1, 吳開(kāi)志2, 吳春艷2, 李海平2, 龔毅紅2, 段瓊2

(1. 四川農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)院, 成都 611130; 2. 四川省林木種苗站, 成都 610081)

為了解四川核桃()種質(zhì)資源的遺傳多樣性，利用RAD二代測(cè)序技術(shù)對(duì)42份核桃良種資源進(jìn)行測(cè)序，分析其遺傳結(jié)構(gòu)和遺傳多樣性。結(jié)果表明，共獲得70G clean data，Q30平均為96.3%，并獲得160 309個(gè)多態(tài)性SNPs。聚類(lèi)、遺傳結(jié)構(gòu)和主成分分析結(jié)果高度一致，42份種質(zhì)資源聚為兩大類(lèi)，基本反映了兩個(gè)原始祖先血統(tǒng)，即普通核桃類(lèi)(AJR，33份)和泡核桃類(lèi)(AJS，9份)，兩類(lèi)群具較高的遺傳分化(ST=0.285)，且分類(lèi)與地理位置分布和種群相關(guān)；且修正了‘威薄01’、‘白龍1號(hào)’和‘石棉巨核’3個(gè)品種的類(lèi)群認(rèn)定。AJS和AJR類(lèi)群中分別有9和14個(gè)良種為純血統(tǒng)且親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，而其余的良種均為兩個(gè)血統(tǒng)的混雜。42個(gè)核桃良種資源的核苷酸多樣性[P()]和期望雜合度()分別為0.029和0.286，表明這些資源具有豐富的遺傳多樣性，相對(duì)于AJR類(lèi)群，AJS類(lèi)群的雜合率()與核苷酸多態(tài)性更大，而SNP數(shù)更少，AJS遺傳多樣性更豐富。這些為四川的核桃種質(zhì)資源保存和雜交育種研究奠定了基礎(chǔ)。

RAD-SNP；普通核桃；泡核桃；遺傳多樣性

植物種質(zhì)資源是生產(chǎn)發(fā)展的基礎(chǔ)性、戰(zhàn)略性資源，是良種選育的原始材料、品種改良的物質(zhì)基礎(chǔ)，種質(zhì)資源擁有的數(shù)量和研究的深入程度是決定育種效果的關(guān)鍵[1]。種質(zhì)資源保護(hù)和保存的本質(zhì)是遺傳多樣性的保護(hù)和保存，因此種質(zhì)資源保護(hù)與保存是否有效，關(guān)鍵在于對(duì)種質(zhì)資源的遺傳類(lèi)群、遺傳關(guān)系、遺傳多樣性等遺傳背景信息的研究和評(píng)估。核桃為胡桃科(Juglandaceae)核桃屬()植物,具有用途多樣、營(yíng)養(yǎng)豐富、口味獨(dú)特的特點(diǎn)，是世界著名的堅(jiān)果類(lèi)和木本油料樹(shù)種之一[2–3]，在人類(lèi)健康和世界經(jīng)濟(jì)貿(mào)易發(fā)展中有著重要的作用[4]。核桃屬含4組約21種，其中普通核桃()與泡核桃()為核桃組中的兩姐妹種，是目前栽培最為廣泛的兩種核桃(作為干果食用)[5–7]。中國(guó)的核桃遺傳資源十分豐富，各種類(lèi)型和品種多達(dá)4 000多個(gè)，而經(jīng)選育形成的優(yōu)良品種或無(wú)性系就達(dá)到500余個(gè)[2]。四川是中國(guó)主要的核桃遺傳資源分布和栽培省份之一，也是泡核桃和普通核桃共存的適生區(qū)域，蘊(yùn)藏著豐富的核桃遺傳資源[2,6]。近年來(lái)，隨著一大批引進(jìn)和本地選育優(yōu)良核桃品種在生產(chǎn)中的使用，四川的核桃產(chǎn)業(yè)得到了快速的發(fā)展。為了更好地發(fā)揮核桃良種資源在生產(chǎn)和育種上的潛力，四川省林業(yè)廳組織全省相關(guān)的核桃研究和生產(chǎn)單位對(duì)目前四川范圍內(nèi)引進(jìn)和選育的核桃良種資源進(jìn)行了收集和保存，建立了四川省的核桃良種種質(zhì)資源庫(kù)，但要真正有效地利用和發(fā)揮這些核桃良種種質(zhì)資源的遺傳潛力，就需要對(duì)種質(zhì)資源的遺傳類(lèi)群、遺傳關(guān)系、遺傳多樣性等在內(nèi)的遺傳背景信息開(kāi)展系統(tǒng)的研究和評(píng)估。

利用分子標(biāo)記評(píng)價(jià)核桃遺傳多樣性，如限制性內(nèi)切酶片段長(zhǎng)度多態(tài)性標(biāo)記[8](restriction fragment length polymorphism, RFLP)、隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA標(biāo)記[9](random amplified polymorphic DNA, RAPD)、擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性標(biāo)記(amplified fragment length polymorphism, AFLP)[10]和微衛(wèi)星DNA標(biāo)記(micro- satellite DNA, SSR)[11]，已得到廣泛的使用。然而這些傳統(tǒng)分子標(biāo)記的位點(diǎn)數(shù)量普遍偏少，獲得的遺傳結(jié)構(gòu)和遺傳多樣性信息有限[12]。單核苷酸多態(tài)性標(biāo)記(single nucleotide polymorphisms, SNP)是二等位基因，代表基因組中最小的遺傳變異單元，在基因組中密度高、分布均勻，數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)簡(jiǎn)單、準(zhǔn)確，不存在數(shù)據(jù)兼容性問(wèn)題[13]，被國(guó)際植物新品種保護(hù)聯(lián)盟用于對(duì)農(nóng)作物進(jìn)行DUS (distinctness, uniformity and stability)測(cè)試。尤其是近年來(lái)測(cè)序技術(shù)的快速進(jìn)步使得獲取大量SNPs變得高效而低廉，限制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)DNA測(cè)序(restriction-site associated DNA sequencing, RAD-seq)技術(shù)就是其中之一，操作簡(jiǎn)單，性價(jià)比高，可獲得數(shù)以萬(wàn)計(jì)的SNP標(biāo)記，已廣泛用于對(duì)非模式物種的研究[14–15]。為此，本研究采用RAD-seq技術(shù)對(duì)核桃良種種質(zhì)資源進(jìn)行測(cè)序，同時(shí)以NCBI上全長(zhǎng)700 Mb的‘Chandler’為參考基因組序列(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/? term=Juglans%20regia)進(jìn)行比對(duì)分析，通過(guò)獲取多態(tài)性SNPs對(duì)四川省收集的42份核桃良種種質(zhì)資源進(jìn)行遺傳背景信息分析和研究，期望驗(yàn)證種質(zhì)資源庫(kù)對(duì)核桃種類(lèi)的認(rèn)定，了解核桃種質(zhì)資源的遺傳構(gòu)成、遺傳關(guān)系和遺傳多樣性。通過(guò)確定品種準(zhǔn)確的遺傳分群，揭示品種間的遺傳關(guān)系，為篩選并保存優(yōu)良種質(zhì)資源奠定基礎(chǔ)，也為未來(lái)進(jìn)一步的雜交育種減少盲目性，同時(shí)為四川地區(qū)核桃種質(zhì)資源的遺傳多樣性及遺傳背景的分析提供重要的參考價(jià)值, 對(duì)四川的核桃育種工作提供重要的理論指導(dǎo)。

1 材料和方法

1.1 材料

試驗(yàn)材料為經(jīng)四川省林木品種審定委員會(huì)審(認(rèn))定的42個(gè)核桃良種(表1)，其中6個(gè)為北方引進(jìn)品種、3個(gè)為云南引進(jìn)品種、4個(gè)為本地雜交品種，其余都是通過(guò)對(duì)四川野生或長(zhǎng)期栽培的核桃進(jìn)行選育的品種(http://www.sclmzm.com:88/sczmz/linmuliangzhong/index.jhtml)。北方品種是利用北方核桃直接選育或雜交后選育出的[16–17]，云南品系為新疆核桃與云南的漾濞核桃(泡核桃)、三臺(tái)核桃和華寧核桃等雜交選育出的云新系列[18–19]，本地雜交核桃是云新系列與四川盆地本地核桃的雜交品種[20–22]。于2016年5月上旬在四川農(nóng)業(yè)大學(xué)崇州基地分別采集各品種的嫩葉，采集前用100%酒精消毒、清洗，采集后放入冰盒保鮮，立即帶回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行DNA提取。

表1 42個(gè)供試核桃良種

1.2 基因組DNA的提取

加入4%~6%聚乙烯吡咯烷酮(polyvinyl pyrro- lidone, PVP)和液氮研磨嫩葉，采用寶生物植物DNA提取試劑盒(TaKaRa, Dalian)提取核桃基因組DNA。提取的DNA采用瓊脂糖凝膠電泳和ND- 2000分光光度計(jì)檢驗(yàn)DNA的質(zhì)量和濃度，將合格的樣品送于上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司進(jìn)行RAD-seq簡(jiǎn)化基因組測(cè)序。

1.3 文庫(kù)構(gòu)建和測(cè)序

利用酶切預(yù)測(cè)軟件對(duì)參考基因組進(jìn)行酶切預(yù)測(cè)，選擇酶切效果最佳的內(nèi)切酶I(TCGA Thermo- fisher)進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。對(duì)檢測(cè)合格的樣品基因組DNA以總量800 ng參照Baird等[23]進(jìn)行酶切文庫(kù)構(gòu)建，文庫(kù)質(zhì)檢合格后用Illumina HiseqTM平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序策略為Illumina PE150。為評(píng)估建庫(kù)實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性，選用水稻()作為對(duì)照參與建庫(kù)和測(cè)序。為了保證測(cè)序質(zhì)量，對(duì)‘涼林119’與‘白龍1號(hào)’進(jìn)行了兩次測(cè)序，通過(guò)比對(duì)結(jié)果分析進(jìn)行內(nèi)部控制數(shù)據(jù)質(zhì)量，因此共進(jìn)行了44份材料的測(cè)序。測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)量過(guò)濾，并對(duì)過(guò)濾前后的測(cè)序reads數(shù)、總堿基數(shù)、Q30和平均測(cè)序深度進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。

1.4 SNP標(biāo)記開(kāi)發(fā)

運(yùn)用BWA 軟件[24]將質(zhì)控后的reads與參考基因組序列進(jìn)行比對(duì)，再利用GATK軟件[25]消除假陽(yáng)性SNP和Samtools軟件[26]提供的vcfutils工具過(guò)濾掉測(cè)序深度和比對(duì)質(zhì)量值較低的位點(diǎn)，過(guò)濾標(biāo)準(zhǔn)為：① 選取基因組中的非重復(fù)區(qū)(避免轉(zhuǎn)座元件),并映射在參考基因組上的reads (避免非特異性擴(kuò)增)；② 只保留雙等位基因頻率范圍在40%~60%的SNPs；③ 相鄰的SNPs至少相隔50 kb；④ 篩選掉樣品分型結(jié)果中次要等位基因頻率MAF<0.05的位點(diǎn)；⑤ 篩選基因型至少覆蓋所有樣本60%以上個(gè)體的標(biāo)記 (該標(biāo)準(zhǔn)根據(jù)實(shí)際標(biāo)記數(shù)據(jù)量進(jìn)行適當(dāng)調(diào)整)，即對(duì)于單個(gè)多態(tài)性標(biāo)記位點(diǎn)，100個(gè)樣本中至少有60個(gè)樣本有確定基因型。通過(guò)對(duì)基因型完整性覆蓋情況差的標(biāo)記進(jìn)行過(guò)濾，最終得到的SNP標(biāo)記用于后續(xù)分析。

1.5 遺傳結(jié)構(gòu)分析

通過(guò)RAxML軟件[27]的maximum likelihood算法構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)，使用模型為GTRGAMMA, bootstrap 1 000次；通過(guò)STRUCTURE v2.3.4[28]軟件，分析遺傳結(jié)構(gòu)，假設(shè)樣本的分群數(shù)(K值)為1~10，使用貝葉斯算法推算在具體分群數(shù)下每個(gè)個(gè)體的血統(tǒng)構(gòu)成情況。根據(jù)CV error (cross validation error)最低點(diǎn)對(duì)應(yīng)的K值來(lái)確定最佳分群數(shù)。通過(guò)GCTA軟件[29]進(jìn)行主成分分析(principal components analysis, PCA)分析，得到樣本的主成分聚類(lèi)情況，用于輔助遺傳結(jié)構(gòu)分析。

1.6 遺傳多樣性分析

根據(jù)對(duì)42個(gè)樣本的遺傳結(jié)構(gòu)分析結(jié)果，對(duì)類(lèi)群的遺傳多樣性進(jìn)行分析，包括核苷酸多樣性[P()]、群體期望雜合度()等。核苷酸多樣性采用PopGenome軟件[30]進(jìn)行計(jì)算，期望雜合度為每個(gè)位點(diǎn)雜合樣數(shù)目與所有樣本數(shù)目之比，然后將所有位點(diǎn)的雜合率相加，取平均值。

2 結(jié)果和分析

2.1 測(cè)序結(jié)果和SNP開(kāi)發(fā)

對(duì)44份材料進(jìn)行測(cè)序，共獲得70G clean data，Q30平均為96.3%，GC含量平均為43.0% (數(shù)據(jù)集1)，樣本測(cè)序深度為23×~64×(數(shù)據(jù)集3)。所有樣本定位到參考基因組上的clean reads數(shù)占所有去重復(fù)clean reads數(shù)的88.6%，同時(shí)符合測(cè)序片段長(zhǎng)度的reads數(shù)占所有clean reads的74.7% (數(shù)據(jù)集1)。

以核桃‘Chandler’品種為參考基因組序列進(jìn)行比對(duì)，共獲得7 360 659個(gè)SNPs (數(shù)據(jù)集2)。經(jīng)過(guò)假陽(yáng)性消除和基因型完整性覆蓋過(guò)濾后，共獲得160 309個(gè)高一致性的群體SNPs，其中有6 357個(gè)測(cè)序深度在所有樣品中都超過(guò)10×。160 309個(gè)SNPs被定位到“Chandler”基因組序列(105811個(gè))的4743個(gè)片段上，其中有1 116個(gè)SNPs定位到LIHL01055144片段，為含量最多的片段?；蜷g隔區(qū)、外顯子、下游、上游和ncRNA外顯子(ncRNA-exonic)分別含有的SNPs為158 049 (98.6%)、928 (0.6%)、479 (0.3%)、764 (0.5%)和89 (0.1%)。其中外顯子含有的928個(gè)SNPs中，同義SNV (single-nucleotide variant)和非同義SNV分別為319 (34.4%)和375 (40.4%)(數(shù)據(jù)集4)。

2.2 遺傳結(jié)構(gòu)分析

聚類(lèi)分析(圖1)表明，42個(gè)品種和‘Chandler’品種比較明顯地聚為兩大類(lèi)群：第一類(lèi)群包含9個(gè)品種(標(biāo)為AJS)，除‘威薄01’外，其余品種均隸屬于泡核桃[(JS)]；‘Chandler’和另外33個(gè)品種聚為第二類(lèi)群(標(biāo)為AJR)，除‘白龍1號(hào)’和‘石棉巨核’外，其余品種均隸屬于普通核桃[(JR)]?；赟tructure軟件分析的遺傳結(jié)構(gòu)結(jié)果表明，當(dāng)分類(lèi)群數(shù)K=2時(shí)的CV-error最小(圖2), 表明42個(gè)樣品可能主要存在兩類(lèi)血統(tǒng)來(lái)源[18]。具體分析分類(lèi)群數(shù)K=2時(shí)42個(gè)品種的血統(tǒng)來(lái)源(圖3)，AJS類(lèi)群中的‘香酥’、‘康烏1號(hào)’、‘雷溪’、‘涼林119’和‘冕漾’等5個(gè)品種為完全的純藍(lán)色血統(tǒng)(標(biāo)為AJS-2)，其余4個(gè)品種混雜有部分紫色血統(tǒng)(標(biāo)為AJS-1)；AJR類(lèi)群中有14個(gè)品種為完全的純紫色血統(tǒng)(標(biāo)為AJR-2)，其余品種均為紫色和藍(lán)色血統(tǒng)的混雜(標(biāo)為AJR-1)。PCA分析結(jié)果與聚類(lèi)分析、Structure分析結(jié)果具有相當(dāng)?shù)钠ヅ湫裕?2個(gè)品種也可分為兩大類(lèi)群4個(gè)亞群(圖4)，同時(shí)根據(jù)解釋比例最高(占19.2%)的主成分PC1，4個(gè)亞群呈一定的梯度排列，依次為AJS-2、AJS-1、AJR-1和AJR-2，即表現(xiàn)出從純正的祖先血統(tǒng)I→雜合血統(tǒng)→祖先血統(tǒng)II的梯度關(guān)系，AJS-2和AJR-2兩亞群相距最遠(yuǎn)，遺傳結(jié)構(gòu)差異性最大，親緣關(guān)系最遠(yuǎn)。

2.3 遺傳多樣性分析

遺傳多樣性分析表明，AJS類(lèi)群的品種數(shù)雖然要少于AJR類(lèi)群，但AJS類(lèi)群的核苷酸多樣性[P()]和期望雜合度(He)都高于AJR類(lèi)群，AJS類(lèi)群分別為0.030和0.308，AJR類(lèi)群分別為0.027和0.278，而42份核桃種質(zhì)的核苷酸多樣性和期望雜合度介于兩個(gè)類(lèi)群之間，分別為0.029和0.286，具較高的遺傳多樣性。

3 討論和結(jié)論

隨著植物全基因組序列研究工作的廣泛開(kāi)展, SNP標(biāo)記已開(kāi)始廣泛地應(yīng)用于植物的遺傳分析[31–32]。有研究表明，低等到中等RAD測(cè)序均可應(yīng)用于非模式物種種群基因組的探索[4,23]。核桃是雌雄同株異花，多異交，可天然雜交，在種群內(nèi)保持著多樣化的基因型[2–3]。通過(guò)群體DNA池開(kāi)發(fā)的SNP較從單個(gè)個(gè)體開(kāi)發(fā)的標(biāo)記對(duì)于研究遺傳多樣性的效果更佳[33]。本研究中，普通核桃與泡核桃通過(guò)共同使用RAD策略進(jìn)行基因組測(cè)序，并對(duì)‘涼林119’和‘白龍1號(hào)’重復(fù)測(cè)序，從內(nèi)外部進(jìn)行數(shù)據(jù)質(zhì)量控制,排除物種或限制酶干擾，從而保證測(cè)序質(zhì)量?！疀隽?19’和‘白龍1號(hào)’兩次測(cè)序個(gè)體間的遺傳距離存在邊際效應(yīng)(<0.005)，這可能與分析處理中數(shù)據(jù)(不包括冗余數(shù)據(jù))非對(duì)稱(chēng)丟失有關(guān)[14]。本研究中，每個(gè)樣本測(cè)序數(shù)據(jù)量均較高(測(cè)序深度為23×~64×), 而160 309個(gè)高一致性的群體SNPs中有6 357個(gè)測(cè)序深度在所有樣本中都超過(guò)了10×，高于Xu等[14]報(bào)道葫蘆()的RAD-seq平均測(cè)序深度，因此對(duì)42個(gè)品種開(kāi)展的遺傳分析具有較好的可信度。

聚類(lèi)分析結(jié)果表明，42個(gè)核桃品種和‘Chandler’品種聚為兩大類(lèi)群，結(jié)構(gòu)分析也表明兩個(gè)類(lèi)群是最優(yōu)的分類(lèi)群數(shù)，且除內(nèi)江威遠(yuǎn)的‘威薄1號(hào)’、雅安石棉的‘石棉巨核’和涼山會(huì)理的‘白龍1號(hào)’外，各品種也基本符合原有認(rèn)定的普通核桃和泡核桃的分類(lèi)。根據(jù)STRUCTURE和PCA的分析結(jié)果，兩大類(lèi)群又可分別分為兩個(gè)亞群，即純血統(tǒng)和混雜血統(tǒng)兩個(gè)亞群，其中純血統(tǒng)普通核桃為6個(gè)北方引進(jìn)品種、2個(gè)阿壩黑水優(yōu)選品種和其他一些盆地優(yōu)選品種，純血統(tǒng)泡核桃都是川西山地品種?？梢钥吹?四川盆地的優(yōu)選核桃除‘威薄1號(hào)’外均與此前的分類(lèi)一致，更多的是屬于北方核桃的普通核桃類(lèi)群或血統(tǒng)。根據(jù)核桃的地理起源考證，普通核桃可能起源于西亞和我國(guó)北方地區(qū)(尤其是新疆地區(qū))，而后主要由于人為活動(dòng)而被傳播到現(xiàn)在的主要栽培區(qū)[3,34],四川盆地至少早在漢代以前就與北方地區(qū)有著十分頻繁的交流，普通核桃也因此很可能作為優(yōu)良的堅(jiān)果經(jīng)濟(jì)林而被引入栽培，根據(jù)四川的地形地貌和生態(tài)氣候條件，四川核桃傳統(tǒng)上被分為東部盆地區(qū)的川東亞群和西部山地區(qū)的川西亞群[2]，但本研究結(jié)果中阿壩黑水和廣元青川核桃并沒(méi)有和其他川西核桃聚為一個(gè)類(lèi)群，而是與川東亞群和北方核桃等聚為一個(gè)類(lèi)群。Wang等[35]在對(duì)我國(guó)8個(gè)野生核桃種群進(jìn)行遺傳分析時(shí)，也認(rèn)為黑水的核桃種群與華北地區(qū)的核桃種群聚為一類(lèi)，顯示其與北方核桃有更近的血緣關(guān)系，這很可能也是因?yàn)闅v史上該地區(qū)與盆地地區(qū)比涼山地區(qū)有更為頻繁的交流有關(guān)。雅安市南部大相嶺以南的涼山地區(qū)是泡核桃的原產(chǎn)分布區(qū)之一[3,36]，該地區(qū)優(yōu)選的核桃除‘鹽源早’、‘石棉巨核’和‘白龍1號(hào)’都?xì)w屬于泡核桃類(lèi)群，也基本符合此前的分類(lèi)。‘鹽源早’雖然優(yōu)選于泡核桃原產(chǎn)分布區(qū)的涼山鹽源縣，但根據(jù)其形態(tài)特征以及鹽源縣近年的核桃栽培和發(fā)展歷史，曾被認(rèn)定為普通核桃[37]，本研究予以證實(shí)。雅安石棉優(yōu)選的‘石棉巨核’和涼山會(huì)理優(yōu)選的‘白龍1號(hào)’此前雖然被認(rèn)定為泡核桃，但它們的形態(tài)特征偏向于普通核桃而一直被懷疑[38]，本研究無(wú)論是聚類(lèi)還是血統(tǒng)分析結(jié)果表明，它們更應(yīng)該屬于普通核桃而非認(rèn)定的泡核桃。在此前認(rèn)定為普通核桃的品種中，內(nèi)江威遠(yuǎn)優(yōu)選的‘威薄1號(hào)’是唯一1個(gè)被歸為泡核桃的品種,根據(jù)Structure的血統(tǒng)分析，其泡核桃血統(tǒng)超過(guò)了60%，因此該品系歸于泡核桃比較合理[39]。

核苷酸多樣性是反映物種種內(nèi)DNA序列變異程度的重要參數(shù)[40–43]。模式植物擬南芥()基于334個(gè)SNP位點(diǎn)和水稻()基于111個(gè)SNP位點(diǎn)的核苷酸多樣性指數(shù)分別為0.007和0.003 2[43–44]，木本植物的核苷酸多樣性指數(shù)多為0.001 86~0.016[45]，挪威云杉()基于22個(gè)位點(diǎn)的核苷酸多樣性指數(shù)為0.003 99[46],毛果楊()基于全基因組SNPs的核苷酸多樣性指數(shù)為0.016[47]，凹葉木蘭()基于7個(gè)SNP位點(diǎn)的核苷酸多樣性指數(shù)為0.017 8[41]。在本研究中，42個(gè)核桃品系基于簡(jiǎn)化基因組SNPs的核苷酸多樣性指數(shù)達(dá)0.029，遠(yuǎn)高于許多木本植物，顯示這42份核桃種質(zhì)資源具有較為豐富的遺傳多樣性。在期望雜合度方面，本研究42個(gè)品種的總體期望雜合度()為0.278，與多種物種基于SNP的期望雜合度相比處于中上水平, 如短花針茅(, 0.131)、(0.269~0.303)[48]、葡萄(, 0.340)[49]等。對(duì)比Han[50]的研究結(jié)果，本研究中核桃群體期望雜合度相對(duì)更低，可能由于SNP的等位基因一般遠(yuǎn)少于SSR標(biāo)記，因此基于SNP的期望雜合度也低于基于SSR標(biāo)記的群體期望雜合度，與葡萄的研究結(jié)果相似[49]。泡核桃類(lèi)群的樣本數(shù)遠(yuǎn)低于普通核桃類(lèi)群，但其核苷酸多樣性(0.030)和期望雜合度(0.308)都要略高于普通核桃類(lèi)群(0.027和0.278), 顯示出更高的遺傳多樣性。相對(duì)于普通核桃，泡核桃的原產(chǎn)地區(qū)地理?xiàng)l件險(xiǎn)峻惡劣，歷史上經(jīng)濟(jì)發(fā)展也十分滯后，且泡核桃本身的食用品質(zhì)較差，因此一般都是以野生方式存在，很少經(jīng)歷人為的馴化和選育，可能是導(dǎo)致泡核桃類(lèi)群在個(gè)體數(shù)較少的情況下仍然具有較高遺傳多樣性的原因[51–52]。

本研究采用RAD-seq技術(shù)對(duì)42份核桃良種種質(zhì)資源進(jìn)行測(cè)序，獲得160 309個(gè)高一致性的SNPs，遺傳分析表明，42個(gè)核桃良種基本符合此前的分類(lèi)認(rèn)定，分為普通核桃和泡核桃兩大類(lèi)群，且兩大類(lèi)群又可細(xì)分為血統(tǒng)較純和較混雜的兩個(gè)亞群，其中普通核桃純血統(tǒng)亞群主要包括北方引進(jìn)品種和阿壩黑水品種等，泡核桃純血統(tǒng)亞群都是涼山地區(qū)選育品種，而云南引進(jìn)的雜交品種和本地雜交品種都屬于普通核桃混雜血統(tǒng)亞群。根據(jù)遺傳類(lèi)群劃分對(duì)3個(gè)核桃品種‘威薄01’、‘石棉巨核’和‘白龍1號(hào)’之前的類(lèi)群認(rèn)定進(jìn)行了修正，‘威薄01’修正為泡核桃，而‘石棉巨核’和‘白龍1號(hào)’修正為普通核桃。從核苷酸多樣性指數(shù)和期望雜合度來(lái)看，42份核桃種質(zhì)資源具有較為豐富的遺傳多樣性，且泡核桃類(lèi)群的遺傳多樣性略高于普通核桃類(lèi)群。因此，該批良種種質(zhì)資源可以為開(kāi)展四川核桃育種提供良好的遺傳資源和物質(zhì)基礎(chǔ)，同時(shí)也為四川省核桃種質(zhì)資源的區(qū)劃、保護(hù)及利用提供理論依據(jù)。

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Studies on Genetic Diversity ofCultivar Germplasms in Sichuan Based on RAD-SNPs Analysis

YAN Si-yu1*, ZHU Peng1*, GONG Wei1**, WANG Jing-yan1, WU Kai-zhi2, WU Chun-yan2, LI Hai-ping2, GONG Yi-hong2, DUAN Qiong2

(1. College of Forestry, Sichuan Agricultural University, Chengdu 611130, China; 2. Forest Seedling Station of Sichuan Province,Chengdu 610081, China)

In order to understand the genetic diversity of walnut () in Sichuan, the genetic diversity and genetic structure of 42 walnut germplasms were analyzed by RAD-SNPs method. The results showed that a total of 70G clean data and 160 309 high consistent SNPs were obtained, and the average Q30 was 96.3%. Forty-two walnut genotypes could be divided into two main groups, such as AJR (group,=33) and AJS (group,=9). The high genetic differentiation (ST=0.285) between two groups had correlation with their geographic distribution. Meanwhile, the groups of three varieties of ‘Weibo No. 1’, ‘Bailong No. 1’ and ‘Shimianjuhe’ were adjusted. There were 9 and 14 varieties in AJS and AJR groups with pure blood, respectively, while the rests in AJS and AJR groups were mixed blood. There were high genetic diversity among 42 walnut germplasms with nucleotide diversity [P()] of0.029and expected heterozygosity () of0.286, and thegroup has higher genetic diversity thangroup. So, these would provide basis for the preservation and cross breeding of walnut germplasm resources in Sichuan.

RAD-SNP;;; Genetic diversity

10.11926/jtsb.3906

2018-03-15

2018-05-09

四川省林業(yè)廳種苗站項(xiàng)目(20140312)；四川省科技廳項(xiàng)目(2016NYZ0035, 2017NFP0051, 2017NFP0126)；四川省農(nóng)業(yè)科技成果轉(zhuǎn)化項(xiàng)目(16NZ0067); 四川農(nóng)業(yè)大學(xué)新農(nóng)村發(fā)展研究院雅安服務(wù)總站項(xiàng)目(2017-05)資助

This work was supported by the Projects of Tree Seedling Station of Sichuan Forestry Department (Grant No. 20140312), and the Projects of Science and Technology Department of Sichuan Province (Grant No. 2016NYZ0035, 2017NFP0051, 2017NFP0126), the Project for Agricultural Science and Technology Achievements Transformation in Sichuan (Grant No. 16NZ0067), and the Project of Yaan Service Station of the Institute for New Rural Development, Sichuan Agriculture University (Grant No. 2017-05).

閆思宇(1993~ ), 女, 碩士研究生, 主要從事經(jīng)濟(jì)林方面研究。E-mail: ysy4017@126.com

* 對(duì)本文有同等貢獻(xiàn)，并列第一作者

E-mail: gongwei@sicau.edu.cn