袁慧慧, 涂藝聲, 黃倩, 余曉

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液體培養(yǎng)的蛇足石杉離體葉狀體生產(chǎn)石杉堿甲和生化特征研究

袁慧慧, 涂藝聲*, 黃倩, 余曉

(江西師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，南昌 330022)

為了解淺層液體培養(yǎng)對蛇足石杉[(Thunb.) Trev.]葉狀體的影響，采用不同用量培養(yǎng)液進行培養(yǎng)，對葉狀體的生長、石杉堿甲(HupA)積累、抗氧化酶活性和內(nèi)源激素的變化進行了研究。結(jié)果表明，培養(yǎng)液用量不同，葉狀體產(chǎn)生的HupA含量有顯著差異，15 mL淺層培養(yǎng)的HupA生產(chǎn)率可達3 115.159g L–1，是對照的2.20倍。淺層液體培養(yǎng)的葉狀體的超氧化物歧化酶活性始終高于對照，過氧化物酶活性在培養(yǎng)前期比對照提高，過氧化氫酶活性在培養(yǎng)后期比對照提高；內(nèi)源激素IAA與GA含量低于對照，而ABA含量高于對照。因此，淺層液體培養(yǎng)的蛇足石杉離體葉狀體生產(chǎn)HupA的能力更高，且HupA含量與內(nèi)源激素ABA水平相關(guān)，葉狀體生長期的3種抗氧化酶活性具有協(xié)作增強抗氧化作用。

蛇足石杉；離體葉狀體；石杉堿甲；液體培養(yǎng)；抗氧化酶；內(nèi)源激素

蛇足石杉[(Thunb.) Trev.]隸屬于石杉科(Huperziaceae)石杉屬，系多年生蕨類植物[1]。蛇足石杉的次生代謝產(chǎn)物石杉堿甲(Huperzine A, HupA)是一種高效、可逆的乙酰膽堿酯酶抑制劑, 能有效改善記憶力衰退，對阿爾茲海默癥有顯著療效[2]。目前，HupA制劑來源以野生蛇足石杉為主，但其生長周期長達15~20 a之久[3]，且對生長環(huán)境要求苛刻，加之被過度采收，加劇了野生資源的枯竭。因此，除人工繁殖外，探尋HupA新資源的生物技術(shù)已成為本領(lǐng)域研究熱點，且取得了可喜的成果。Szypu?a等[4]通過組織培養(yǎng)小杉蘭()獲得了HupA。本實驗室通過組織培養(yǎng)技術(shù)誘導(dǎo)蛇足石杉莖段得到了離體葉狀體[5]，添加天冬氨酸培養(yǎng)葉狀體，其生物量與HupA含量均有提高[6],葉麗婻等[7]用H2O2誘變?nèi)~狀體，獲得了產(chǎn)HupA的離體葉狀體高產(chǎn)株系。

有研究表明，液體培養(yǎng)能更大限度地擴大培養(yǎng)效率，對珍稀植物自動化工業(yè)生產(chǎn)經(jīng)濟次生代謝產(chǎn)物的應(yīng)用具有良好前景。去除助凝劑的液體培養(yǎng)方式可節(jié)約培養(yǎng)基成本，且能打破傳統(tǒng)固體組培技術(shù)的局限，節(jié)省大量運行與勞動成本[8]。為此，有關(guān)液體培養(yǎng)對培養(yǎng)物的生長和次生代謝產(chǎn)物變化的研究已有較多報道。高先富[9]的研究表明，液體培養(yǎng)對三七()不定根具有增殖效應(yīng), 并建立了三七不定根體外液體培養(yǎng)體系。胡之壁[10]采用液體培養(yǎng)方式對三尖杉()細胞進行培養(yǎng)，其生長速率是固體培養(yǎng)的3倍，且總生物堿增加了近1倍。淺層液體培養(yǎng)過程中無需震蕩即可解決通氣問題，然而淺層液體培養(yǎng)蛇足石杉離體葉狀體的研究尚未見報道。本研究采用前期建立的具有累積HupA能力的蛇足石杉離體葉狀體[11],以不同用量培養(yǎng)液培養(yǎng)，探究淺層液體培養(yǎng)對葉狀體生長效應(yīng)和HupA含量的影響，以期為蛇足石杉離體培養(yǎng)工廠化生產(chǎn)奠定應(yīng)用技術(shù)基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

研究材料取自本實驗室建立的蛇足石杉[(Thunb.) Trev.]離體培養(yǎng)36世代(經(jīng)多次分割并連續(xù)繼代培養(yǎng))的無菌葉狀體繁殖系[5]。當代的葉狀體培養(yǎng)50 d，在無菌條件下取出分割成小塊進行接種。誘導(dǎo)和增殖培養(yǎng)按涂藝聲等[5]的方法進行。

石杉堿甲標準品購自中國食品藥品檢定研究院(產(chǎn)品批號為100243-201603)。

1.2 液體培養(yǎng)基的配制與葉狀體的培養(yǎng)

固體培養(yǎng)基為1/4MS，參照吉枝單[11]的方法配制，液體培養(yǎng)基則去除瓊脂成分。

葉狀體的培養(yǎng)：在100 mL錐形瓶中分別裝入10、15、20、25、50 mL培養(yǎng)液，以50 mL固體培養(yǎng)基為對照。每瓶接種量相同，各處理設(shè)9次重復(fù)。接種后置于(22±1)℃培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)，光照強度為377mol m–2s–1，光照時間為15 h d–1。

培養(yǎng)40、50、60、70、80 d時分別取樣測定3種抗氧化酶的活性；培養(yǎng)至50、60、70、80 d時分別取樣測定內(nèi)源激素ABA、IAA、GA和HupA的含量。

1.3 葉狀體生長指標測定

葉狀體培養(yǎng)80 d后從培養(yǎng)基中取出，洗凈吸干水分，稱量鮮質(zhì)量。在40℃烘箱中烘至恒重，稱量干質(zhì)量。葉狀體生長量(g L–1)=(收獲量-接種量)/1 L; 葉狀體相對增長率(%)=(收獲量-接種量)/接種量×100%; 折干率(%)=干燥后葉狀體質(zhì)量/干燥前葉狀體鮮質(zhì)量×100%; 石杉堿甲生產(chǎn)率(g L–1)=培養(yǎng)80 d后1 L培養(yǎng)基的葉狀體干質(zhì)量(g)×每克干葉狀體的石杉堿甲含量(g g–1)。

1.4 葉狀體生化指標的測定

用氮藍四唑(NBT)法測定超氧化物歧化酶(SOD)活性[12]，愈創(chuàng)木酚比色法測定過氧化物酶(POD)活性[13]，紫外光光度法測定過氧化氫酶(CAT)活性[14]；采用雙抗體一步夾心法酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)測定內(nèi)源激素ABA、IAA、GA含量，試劑盒由上海酶聯(lián)生物科技有限公司提供。

1.5 石杉堿甲的檢測

石杉堿甲的提取 參考陳曼等[6]的方法提取。葉狀體干燥后磨成細粉，用2%酒石酸浸泡過夜后超聲提取3次，離心并收集上清液合并，上清液pH調(diào)至9后蒸干，經(jīng)甲醇洗脫得石杉堿甲混合液，定容，以0.22m濾嘴抽濾后采用高效液相色譜(high performance liquid chromatography fluore-scence, HPLC)檢測。

色譜分析 (1) 色譜條件：高效液相色譜儀采用島津(LC-20 AT), 色譜柱為Waters C18柱(4.6 mm×250 mm, 5m)。流動相為甲醇∶醋酸銨溶液(0.08 mol L–1, pH 6.00)=3∶7 (/)；流速0.8 mL min–1; 檢測器：紫外光，波長308 nm；柱溫25℃；進樣量為20L，記錄石杉堿甲色譜圖(圖1)。(2) 線性關(guān)系分析：取配制好的20、40、60和80g mL–1石杉堿甲溶液分別注入液相色譜儀檢測，記錄面積積分值，以質(zhì)量濃度(g mL–1)為橫坐標，峰面積積分值為縱坐標，回歸方程為=53300.5–166916 (=0.999 695 5)。(3) 系統(tǒng)適用性實驗：從圖1可見，標準品石杉堿甲的保留時間為13.600 min，樣品保留時間為13.588 min，并且與其它成分分離良好，理論塔板數(shù)按石杉堿甲峰計不低于3 000。(4) 精密度實驗：取配制的80g mL–1石杉堿甲標準品溶液進行HPLC檢測。重復(fù)進樣6次，記錄峰面積, 相對標準偏差(RSD)為1.00%。(5) 回收率實驗：取已知石杉堿甲含量的蛇足石杉提取樣品200L, 精確加入40g mL–1標準品溶液200L，進樣量20L, 計算回收率為(98.54±2.8)%。(6) 樣品測定：取制備的石杉堿甲提取液測定蛇足石杉石杉堿甲的含量。

1.6 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)采用Excel 2013和SPSS 19.0軟件進行統(tǒng)計分析并作圖，數(shù)據(jù)以平均值±標準誤差表示，采用單因素方差分析(ANOVA)進行差異分析，根據(jù)Duncan新復(fù)極差法在0.05水平上比較處理間的差異性，并采用皮爾森(Pearson)法進行相關(guān)性分析。

2 結(jié)果和分析

2.1 葉狀體生物量的變化

與固體培養(yǎng)基(對照)相比，各液體培養(yǎng)的葉狀體生長量均明顯提高(表1)，10、15、20和25 mL培養(yǎng)液處理的分別提高了49.13%、73.37%、16.30%和5.22% (<0.05)；僅50 mL培養(yǎng)液與對照的葉狀體生長量相當，無顯著差異。隨著培養(yǎng)液量的增加，葉狀體相對增長量呈上升趨勢，但1 L培養(yǎng)液的生長量呈下降趨勢，以15 mL淺層液體培養(yǎng)的生長量最高，是對照的1.73倍。

不同用量培養(yǎng)液處理葉狀體折干率也存在差異(表1)。折干率反映了干物質(zhì)的累積量，干物質(zhì)量與石杉堿甲產(chǎn)量成正比。隨著培養(yǎng)液用量的增加, 折干率呈先增后減的變化趨勢，其中15 mL培養(yǎng)液培養(yǎng)時，折干率最大，達16.35%，是對照的1.25倍，說明深層液體培養(yǎng)基并不適合葉狀體積累干物質(zhì)，以15 mL的淺層液體培養(yǎng)基對干物質(zhì)積累效果最好。

2.2 葉狀體HupA生產(chǎn)率的變化

石杉堿甲生產(chǎn)率是指收獲時每升培養(yǎng)基中葉狀體的總石杉堿甲含量。采用HPLC檢測，不同用量培養(yǎng)液培養(yǎng)80 d的葉狀體石杉堿甲生產(chǎn)率具有顯著差異(<0.05)(圖2)。當培養(yǎng)液為15 mL時，石杉堿甲生產(chǎn)率最高，達3 115.159g L–1, 是對照的2.20倍。培養(yǎng)液用量增加，石杉堿甲生產(chǎn)率驟減, 顯著低于對照，50 mL培養(yǎng)液的石杉堿甲生產(chǎn)率為369.037g L–1。因此，以培養(yǎng)液為15 mL的淺層培養(yǎng)的效果最佳，液體過深或過淺都不利于葉狀體的生長與石杉堿甲的積累。

表1 不同用量培養(yǎng)液培養(yǎng)蛇足石杉葉狀體生物量的變化

CK: 固體培養(yǎng)；同列數(shù)據(jù)后不同字母表示差異顯著(<0.05)。下同。

CK: Solid medium; Data followed different letters indicate significant differences at 0.05 level. The same is following Figures.

2.3 葉狀體的抗氧化酶活性

從圖3可見，液體和固體培養(yǎng)的葉狀體SOD活性的變化趨勢基本一致，淺層液體培養(yǎng)各時期的SOD活性均高于對照，但差異不明顯，且均在培養(yǎng)60 d時達最高。培養(yǎng)40~60 d時，淺層液體培養(yǎng)的葉狀體POD活性顯著高于對照，但CAT活性顯著低于對照；而培養(yǎng)60~80 d則相反，淺層液體培養(yǎng)的葉狀體POD活性逐漸下降，而CAT活性不斷增強，表現(xiàn)出酶活性交互調(diào)節(jié)的特性，即淺層液體培養(yǎng)的葉狀體POD活性先增強，而CAT活性后增強，協(xié)同清除體內(nèi)活性氧(ROS)來維持葉狀體的內(nèi)生境，這可能為葉狀體生長和累積高含量石杉堿甲具備了良好的生化特征基礎(chǔ)。

2.4 葉狀體內(nèi)源激素含量的變化

培養(yǎng)60 d時，固體培養(yǎng)的IAA/ABA與GA/ABA分別為73.07和0.70, 均高于液體培養(yǎng)的31.83與0.32，結(jié)合表1可知，固體培養(yǎng)的葉狀體比液體培養(yǎng)的鮮質(zhì)量大，但干物質(zhì)累積卻顯著低于液體培養(yǎng)的。從圖4可見，培養(yǎng)50~60 d，液體培養(yǎng)的葉狀體ABA含量顯著高于固體培養(yǎng)的，此時期液體培養(yǎng)的HupA含量變化相似(<0.05), 相關(guān)分析表明，全培養(yǎng)期HupA含量與ABA含量呈極顯著相關(guān)(= 0.748,=0.000<0.01)。這說明內(nèi)源激素水平對離體培養(yǎng)的葉狀體的生長及代謝具有重要影響, 較高的IAA與GA含量有利于葉狀體生長勢的增強，但主要增長為含水量，而較高的內(nèi)源ABA含量對葉狀體干物質(zhì)提高和HupA的累積作用明顯。

圖4 ABA和HupA含量的變化

3 討論

改進培養(yǎng)方式是調(diào)節(jié)植物生長和次生代謝產(chǎn)物產(chǎn)量的重要手段。液體培養(yǎng)基能為培養(yǎng)物提供均衡的營養(yǎng)物質(zhì)，且其可流動性使之易于實現(xiàn)自動化控制，可在不更換培養(yǎng)容器的情況下實現(xiàn)培養(yǎng)基的更新，有望配置較大的培養(yǎng)容器[15]。本研究結(jié)果表明，蛇足石杉離體葉狀體在液體培養(yǎng)下的效果優(yōu)于固體培養(yǎng)，其中15 mL淺層液體培養(yǎng)的葉狀體HupA生產(chǎn)率是50 mL深層培養(yǎng)的8.441倍。在15~ 50 mL液體培養(yǎng)下，隨著液體培養(yǎng)基的增多，葉狀體浸沒程度加深，可能因溶氧量變少，收獲葉狀體干重與HupA含量均呈下降趨勢，而更淺層的10 mL處理，因培養(yǎng)后期培養(yǎng)液枯竭，葉狀體生長緩慢?？梢?，適當?shù)目諝饨佑|與必須的營養(yǎng)供應(yīng)是淺層培養(yǎng)的關(guān)鍵。

有研究表明，植物受到脅迫時，會導(dǎo)致活性氧(ROS)積累，此時抗氧化酶系統(tǒng)和非酶系統(tǒng)也會發(fā)生響應(yīng)[16]。本研究結(jié)果表明，15 mL淺層液體培養(yǎng)的葉狀體SOD活性高于對照固體培養(yǎng)，POD活性在培養(yǎng)前期比對照提高，CAT活性在培養(yǎng)后期比對照提高。同時，15 mL淺層液體培養(yǎng)的葉狀體內(nèi)源激素ABA含量一直維持在較高水平，且次生代謝產(chǎn)物HupA產(chǎn)率亦明顯增加。這說明淺層液體培養(yǎng)時，葉狀體因一部分浸沒于液體中受到了一定的低氧脅迫，導(dǎo)致體內(nèi)ROS累積增多，激發(fā)了3種抗氧化酶活性，協(xié)同清除ROS分子，以維持葉狀體內(nèi)生境的穩(wěn)態(tài)，有助于葉狀體的生長；與此同時，特異性成分HupA累積增多，可能是逆境內(nèi)源激素ABA與ROS分子作為信號調(diào)節(jié)了葉狀體次生代謝HupA途徑的響應(yīng)，這與相關(guān)報道的生物響應(yīng)類似[16]。

本研究結(jié)果顯示，淺層液體培養(yǎng)使蛇足石杉離體葉狀體受到低氧脅迫，而這種適度的脅迫有利于其干物質(zhì)和有效成分HupA的累積。本技術(shù)亦為其他植物離體培養(yǎng)提高次生代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量研究提供了借鑒。

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Studies on Huperzine A Accumulation and Biochemical Characteristics in Thallus ofby Liquid Culture

YUAN Hui-hui, TU Yi-sheng*, HUANG Qian, YU Xiao

(College of Life Sciences, Jiangxi Normal University, Nanchang 330022, China)

In order to understand the effect of liquid cultures on thallus of(Thunb.) Trev., the changes in thallus growth, huperzine A accumulation, antioxidant enzymes activities and endogenous hormones were studied cultured on different dosage of liquid medium. The results showed that the huperzine A contents had significant differences among different dosages of liquid medium. The huperzine A content could reach up to 3 115.159g L–1with 15 mL medium, which was 2.20 times more than the control. The superoxide dismutase activity of thallus cultured in shallow liquid was higher thanthat of the control, the activity of peroxidase was higher than that of the control at early stage, while did the activity of catalase at later stage. The contents of endogenous hormones IAA and GA were lower than the control, while ABA content was higher than the control. Therefore, it was suggested that the ability to produce HupA was high in thallusofcultured with shallow liquid medium, the HupA content had relation with the content of endogenous hormone ABA, and the activities of three antioxidant enzymes in thallus had collaborative enhancement effect during growth stage.

; Thallus; Huperzine A; Liquid culture; Antioxidant enzyme; Endogenous hormone

10.11926/jtsb.3901

2018-03-08

2018-05-14

國家自然科學(xué)基金項目(81360614, 81660597)；江西省自然科學(xué)基金項目(20132BAB204023)資助

This work was supported by the National Natural Science Foundation of China (Grant No. 81360614, 81660597), and the Natural Science Foundation in Jiangxi Province (Grant No. 20132BAB204023).

袁慧慧(1993~ )，女，碩士研究生，主要研究方向為植物生物技術(shù)。E-mail: yuanhhui@126.com

E-mail: ysttz2012@163.com