段 慧，李弈仙，魏永勝，康靖全

(西北農(nóng)林科技大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，陜西楊凌 712100)

植物根系的活力是植株吸收、合成和生長(zhǎng)的綜合表現(xiàn)，影響整株植物的生長(zhǎng)發(fā)育和產(chǎn)量形成。根系不僅起到固定與支持作用，同時(shí)也為整個(gè)植株尤其是地上部分提供生長(zhǎng)發(fā)育所必需的水、礦質(zhì)、氨基酸和激素(如脫落酸和細(xì)胞分裂素)等物質(zhì)。因此，在植物相關(guān)研究中，無(wú)論是農(nóng)林草[1-6]、園林植物[7]還是生態(tài)學(xué)領(lǐng)域[8-9]，根系活力都是常用的反映植株生活力的重要生理指標(biāo)。根系活力與呼吸密切相關(guān)，因此可采用甲烯藍(lán)吸附、α-萘胺氧化和TTC(2,3,5-三苯基氯化四氮唑，2,3,5-Triphenyltetrazolium chloride，C19H15N4Cl，相對(duì)分子質(zhì)量為334.81)還原法，或傷流液質(zhì)量[10-11]和同位素示蹤[12]等方法。其中TTC法因?yàn)闇?zhǔn)確、重現(xiàn)性好而被廣泛使用[13]。TTC是標(biāo)準(zhǔn)氧化還原電位為80 mV的氧化還原物質(zhì)，被還原后即生成紅色而不溶于水的三苯基甲月替 (1,3,5-triphenylformazan， TPF) 。利用比色法，在485 nm檢測(cè)乙酸乙酯中TPF含量，以單位時(shí)間根質(zhì)量還原的TTC量反映根系活力(μg 或mg·g-1·h-1)。作為一種定量評(píng)價(jià)根系活力的指標(biāo)，測(cè)定過(guò)程需要建立TPF標(biāo)準(zhǔn)曲線。其原理是利用保險(xiǎn)粉(連二亞硫酸鈉，Sodium hydrosulfite，Na2S2O4，相對(duì)分子質(zhì)量為174.10)還原TTC生成紅色的TPF，再利用乙酸乙酯萃取TPF，進(jìn)而制作成含有不同量的TPF乙酸乙酯溶液建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。其中保險(xiǎn)粉的加入量在理論上應(yīng)該是過(guò)量的[14]，不足則顯色淡，導(dǎo)致根系活力測(cè)定結(jié)果被高估，但保險(xiǎn)粉加入過(guò)多，與TTC反應(yīng)所剩余的部分會(huì)在乙酸乙酯中形成不溶黏性物影響最終的比色結(jié)果。那么，保險(xiǎn)粉的適宜用量應(yīng)該是多少呢？為此，筆者查閱了高等教育出版社和科學(xué)出版社等9家出版單位的23部植物生理學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)(或教程)。TPF標(biāo)準(zhǔn)梯度溶液建立的方法可歸納為2種，一種是分別在裝有不同濃度的TTC溶液的6～7個(gè)試管中加入少量保險(xiǎn)粉，每個(gè)試管約2 mg，并保持一致[15-16]；另一種是先在已知濃度的TTC溶液中加“少許”(沒(méi)有給出具體質(zhì)量)保險(xiǎn)粉，產(chǎn)生TPF并用乙酸乙酯定容后形成TPF母液，再分別吸取不同體積的TPF母液用乙酸乙酯定容至10 mL建立TPF標(biāo)準(zhǔn)梯度溶液[17-18]。對(duì)于第1種，在實(shí)際操作過(guò)程中稱取保險(xiǎn)粉2 mg需要使用百萬(wàn)之一天平，而多數(shù)科研實(shí)驗(yàn)室和普通教學(xué)實(shí)驗(yàn)不具備條件，即使具備條件，操作中也很困難，2 mg的保險(xiǎn)粉是否達(dá)到過(guò)量的要求也不明確。如果不稱量則和第2種方法一樣，無(wú)法確定具體質(zhì)量，更無(wú)法保持各試管中加入量的一致性。生理學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)(或教程)是實(shí)驗(yàn)教學(xué)和科學(xué)研究中相關(guān)指標(biāo)測(cè)定的方法來(lái)源，指導(dǎo)書中的錯(cuò)誤會(huì)導(dǎo)致錯(cuò)誤的實(shí)驗(yàn)或測(cè)量結(jié)果，在實(shí)驗(yàn)教學(xué)中則誤導(dǎo)學(xué)生，在科學(xué)研究中得到錯(cuò)誤的結(jié)論。因此，需要對(duì)已經(jīng)公開(kāi)發(fā)表的科學(xué)文獻(xiàn)進(jìn)行檢測(cè)，以確定是否因方法不正確產(chǎn)生了錯(cuò)誤的結(jié)果，并通過(guò)試驗(yàn)，確定保險(xiǎn)粉的適宜用量，以期為根系活力相關(guān)的研究和教學(xué)提供科學(xué)的理論支持。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

主要試劑有保險(xiǎn)粉(天津市標(biāo)準(zhǔn)科技有限公司)、TTC(上海遠(yuǎn)帆助劑廠)和乙酸乙酯(浙江雙林化工廠)，均為分析純。稱量采用瑞士普利賽斯Precisa 十萬(wàn)分之一電子天平(EP225SM-DR)，比色采用日立紫外分光光度計(jì)(U-3900H)，15 mL具塞刻度試管及100 mL 容量瓶。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與數(shù)據(jù)采集

試驗(yàn)設(shè)計(jì)的保險(xiǎn)粉目標(biāo)用量分別為0.02、0.04、0.06、0.1、0.12、0.15和0.20 g，每個(gè)目標(biāo)量稱取2份(重復(fù))，記錄實(shí)際值(保留5位小數(shù))。分別放入14 支試管中，各加5 mg·mL-1TTC溶液(0.499 64 g TTC蒸餾水定容至100 mL， 0.5 g·mL-1) 5 mL[15]，搖動(dòng)，生成TPF后各加乙酸乙酯10 mL，充分振蕩后避光靜置4 h后比色。為避免比色杯的影響，比色過(guò)程中只使用2支比色杯，一支用于純乙酸乙酯為對(duì)照，另一支用于樣品液，每次比色時(shí)用1 mL樣品液潤(rùn)洗比色杯2次。

2 結(jié)果與分析

2.1 根系活力研究的文獻(xiàn)計(jì)量結(jié)果

由于所查閱的實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)書介紹的標(biāo)準(zhǔn)曲線均難以操作，因此推測(cè)以TTC法測(cè)定根系活力的研究結(jié)果會(huì)有很大的偏差。為了驗(yàn)證推測(cè)，進(jìn)行文獻(xiàn)計(jì)量分析。在中國(guó)知網(wǎng)(CNKI)中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù)農(nóng)業(yè)科技和生物學(xué)專輯中，以(摘要=根系活力)(精確匹配)為檢索條件共檢索到5 699 篇文獻(xiàn)，其中標(biāo)題=根系活力的共319篇，采用TTC法(全文=TTC)的55篇，α-萘胺法25篇，傷流液法29篇。抽樣提取了中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)、農(nóng)業(yè)工程學(xué)報(bào)、林業(yè)科學(xué)、園藝學(xué)報(bào)、草業(yè)學(xué)報(bào)和生態(tài)學(xué)報(bào)等雜志中25篇研究文獻(xiàn)根系活力結(jié)果(表1)，涉及小麥、玉米、水稻等作物。數(shù)據(jù)顯示，根系活力平均值最高為350 mg·g-1·h-1[6]，而最低的僅為4.4 × 10-4mg·g-1·h-1[19]，最高平均值是最低平均值的約80萬(wàn)倍。同種作物根系活力的平均值在不同文獻(xiàn)之間差異較大，如小麥6 699倍，苜蓿93倍，水稻11倍。這種差異是植物種和試驗(yàn)處理所無(wú)法達(dá)到的。因此，不適合的分析方法會(huì)導(dǎo)致分析結(jié)果的嚴(yán)重失真，誤導(dǎo)理論研究和生產(chǎn)實(shí)踐。

2.2 TPF溶液吸收曲線

為了確保后續(xù)試驗(yàn)中比色的可靠性，對(duì)TPF乙酸乙酯溶液比色的最適波長(zhǎng)進(jìn)行檢測(cè)。起始波長(zhǎng)700 nm，終止波長(zhǎng)380 nm，掃描速度1 200 nm·min-1。結(jié)果(圖1)顯示，在483、484、485和486 nm處有單一吸收峰，吸光值分別為1.115、1.114、1.114和1.113。因此，選擇485 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)是合理的。

2.3 保險(xiǎn)粉用量與TPF溶液吸光值的關(guān)系

本試驗(yàn)是在5 mL 5 mg·mL-1TTC溶液中加入保險(xiǎn)粉，生成TPF后再溶于10 mL乙酸乙酯，萃取后比色。理論上保險(xiǎn)粉還原TTC過(guò)程中，與TTC的摩爾比為1∶1，因此5 mL 5 mg·mL-1TTC溶液中含有25 mg TTC與保險(xiǎn)粉反應(yīng)時(shí)，需要保險(xiǎn)粉為13 mg。但試驗(yàn)結(jié)果(圖2)顯示，保險(xiǎn)粉的用量在150 mg 以下時(shí)，保險(xiǎn)粉用量與吸光值呈線性相關(guān)(R2=0.996 2，n=6,P<0.000 1)，超過(guò)150 mg后，吸光值不再增加。因此，保險(xiǎn)粉的最低量應(yīng)為150 mg (約為理論值的11倍)。部分實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)[15]中，標(biāo)準(zhǔn)曲線制作時(shí)，先加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.04%、0.03%、0.02%、0.01%、和0.005%的TTC溶液5 mL，然后各加約2 mg保險(xiǎn)粉，并且要求各試管中保險(xiǎn)粉用量一致。這一操作是不合理的，因?yàn)門TC含量不同，所以保險(xiǎn)粉用量可以不同。對(duì)應(yīng)于5 mL 0.04% TTC溶液需要保險(xiǎn)粉1.04 mg。原指導(dǎo)書中的用量是超過(guò)理論需要量，但實(shí)際操作中還達(dá)不到需要量(約11 mg)，仍然會(huì)導(dǎo)致結(jié)果高估。文獻(xiàn)分析部分可證明這一點(diǎn)。

表1 基于文獻(xiàn)計(jì)量的TTC法測(cè)定的常見(jiàn)作物及林、草的根系活力Table 1 The roots viability of common crop, tree and grass species tested use of 2,3,5-triphenyltetrazolium chloride(TTC) based on bibliometric method mg·g-1·h-1

注：原文數(shù)據(jù)為多個(gè)生育期的，選擇均值最高的生育期數(shù)據(jù)。

Note:The original paper data is of mutiple growth stages, highest mean value of growth stage is selected.

圖2 保險(xiǎn)粉用量對(duì)TPF 乙酸乙酯溶液吸光值的影響(5 mL 5 mg·mL-1 TTC，10 mL乙酸乙酯)Fig.2 The effect of Na2S2O4 on ethyl acetate solution with TPF(5 mL TTC 5 mg·mL-1, dissolved in 10 mL ethyl acetate)

3 結(jié)論及建議方案

現(xiàn)有的植物生理學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)中關(guān)于TTC還原法測(cè)定根系活力的方法不妥，無(wú)論是保險(xiǎn)粉2 mg還是“少許”均難以操作。建議標(biāo)準(zhǔn)曲線制作時(shí)，在5 mL 5 mg·mL-1TTC溶液中加入0.150～0.200 g保險(xiǎn)粉，生成TPF后加乙酸乙酯10 mL，充分振蕩后避光靜置4 h后制成母液。然后吸取4 mL TPF乙酸乙酯溶液定容至10 mL，得到對(duì)應(yīng)于1 mg·mL-1TTC的TPF溶液，最后分別吸取0.25、0.5、1.0、1.5和2.0 mL 置于10 mL 容量瓶中，用乙酸乙酯定容至10 mL，獲得分別對(duì)應(yīng)于0.025、0.05、0.10、0.15和0.20 mg TTC的TPF溶液，485 nm下比色，以對(duì)應(yīng)的TTC質(zhì)量為因變量，吸光值為自變量建立標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程。