陳浩楠 劉群 王菁 徐赟霞 王宇 吳艷輝 耿緒云 孫金生 薛淑霞

摘?要：根據(jù)偷死野田村病毒（CMNV）的保守基因序列，設(shè)計(jì)篩選出1對特異性引物CMN279，利用已公布的凡納濱對蝦白斑綜合征病毒（WSSV）和傳染性皮下及造血器官壞死病毒（IHHNV） 特異性引物WSS235和IHHN356，建立了一種同時(shí)檢測WSSV、IHHNV和CMNV的多重 PCR 檢測方法。收集18種病原、健康對蝦組織及WSSV、IHHNV、CMNV陽性病料，開展特異性測試，該方法可以特異性擴(kuò)增出WSSV、IHHNV、CMNV基因片段，健康對蝦肌肉組織、其他18種病原均未擴(kuò)增出任何片段，特異性強(qiáng)。應(yīng)用克隆方法制備目的基因質(zhì)粒，應(yīng)用連續(xù)稀釋質(zhì)粒方法開展靈敏度測試，測定該方法檢測靈敏度分別為WSSV 9.74 fg、IHHNV 7.65 fg、CMNV 10 fg;與已報(bào)道的多重PCR檢測靈敏度相比較，檢測靈敏度提高10倍。應(yīng)用本研究建立的多重PCR檢測方法與實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)方法同時(shí)進(jìn)行22個(gè)樣品檢驗(yàn)，多重PCR檢驗(yàn)方法的檢驗(yàn)結(jié)果與實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)方法檢驗(yàn)結(jié)果符合率為100%。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：本研究建立的多重PCR檢驗(yàn)方法具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、檢驗(yàn)時(shí)間短、檢驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確度高的特點(diǎn)，可用于WSSV、IHHNV和CMNV三種病原的快速檢測診斷。

關(guān)鍵詞：多重PCR;白斑綜合征病毒;傳染性皮下及造血器官壞死病毒;偷死野田村病毒

白斑綜合征病毒 （WSSV）和傳染性皮下和造血器官壞死病毒（IHHNV）是當(dāng)前危害全球?qū)ξr養(yǎng)殖業(yè)的兩種主要病原[1]，其引起的對蝦疾病被世界動(dòng)物衛(wèi)生組織（World Organisation for Animal Health， OIE）《水生動(dòng)物衛(wèi)生法典》收錄，被列為需要報(bào)告的水生動(dòng)物病毒性疫病。2009年，上述兩種疾病被農(nóng)業(yè)部《一、二、三類動(dòng)物疫病病種名錄》列為水生生物一、二類動(dòng)物疫病病原[2]，并被農(nóng)業(yè)部列入《水生動(dòng)物疫病監(jiān)測計(jì)劃》，在重要養(yǎng)殖區(qū)域進(jìn)行定時(shí)、定點(diǎn)監(jiān)測。而偷死野田村病毒（CMNV）是導(dǎo)致對蝦病毒性偷死病的病原，是近年來新發(fā)現(xiàn)的一種病毒，成為危害對蝦養(yǎng)殖的又一個(gè)重要病原[3]。這三種病毒的存在，嚴(yán)重影響到對蝦養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展，每年造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。

目前，檢測對蝦病毒的方法有很多種。其中，組織病理學(xué)方法和電鏡技術(shù)存在耗時(shí)費(fèi)力、操作繁瑣的問題，實(shí)用性較差。而免疫學(xué)方法存在抗體不易獲得和成本過高的問題，很難在生產(chǎn)中進(jìn)行推廣應(yīng)用。隨著分子生物技術(shù)的發(fā)展而出現(xiàn)的常規(guī)PCR檢測技術(shù)，因其具有特異性強(qiáng)、反應(yīng)迅速、靈敏度高的特點(diǎn)，而被廣泛應(yīng)用于對蝦病毒檢測。但是，常規(guī)PCR和RT-PCR也具有局限性，一次PCR反應(yīng)只能檢測一種病原。多重PCR技術(shù)的誕生剛好彌補(bǔ)了上述缺點(diǎn)，其突出特點(diǎn)是一次PCR反應(yīng)可同時(shí)檢測多種病原，在對蝦病原檢測中具有很高的實(shí)用價(jià)值[4]。

本研究在前人的研究基礎(chǔ)上，以北方對蝦養(yǎng)殖過程中的常見病毒為研究對象，依據(jù)現(xiàn)有序列，建立WSSV、IHHNV、CMNV 多重PCR檢測技術(shù)。在常規(guī)病原檢測中使用該方法，可以一次檢測WSSV、IHHNV、CMNV 三種病原的攜帶情況，大大降低工作量，節(jié)約檢測時(shí)間和檢測成本，在對蝦健康養(yǎng)殖和產(chǎn)業(yè)發(fā)展的生物安全監(jiān)控中具有重要意義[5]。

1?材料與方法

1.1?實(shí)驗(yàn)材料

試驗(yàn)所需的攜帶WSSV、IHHNV和CMNV陽性樣品材料由天津市水生動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心實(shí)驗(yàn)室提供，樣品編號分別為ZX2015-JY62、ZX2015-JY1656和ZX2015-JY1636。

TOP10感受態(tài)細(xì)胞（CB104）、瓊脂糖凝膠回收試劑盒（TIANGEN， DP209-03）、TIANprep Mini Plasmid Kit質(zhì)粒小提試劑盒（TIANGEN， DP103）、TIANamp Genomic DNA Kit血液/細(xì)胞/組織基因組DNA提取試劑盒均購于天根生化科技（北京）有限公司。

pMD18-T Vector （TaKaRa， D101A）購于寶生物工程（大連）有限公司。

1.2?主要試劑

Ex Taq DNA 聚合酶，10×Ex Taq Buffer （Mg2+ free），MgCl2 （25 mmol/L），dNTP mixture （10 mmol/L），DL2000 DNA Marker，均購于寶生物工程（大連）有限公司。RNase-Free H2O，TRIzol Reagent，購于北京索萊寶科技有限公司。PCR引物由金唯智生物科技有限公司（北京）合成。LB培養(yǎng)基購于北京陸橋有限公司。

1.3?試驗(yàn)方法1.3.1?引物設(shè)計(jì)與合成?依據(jù)NCBI提供的偷死野田村病毒（CMNV）序列（Gene Bank NO.： KM112247），利用Primer Premier 5軟件，設(shè)計(jì)篩選特異性引物CMN279。選取我單位設(shè)計(jì)的引物序列WSS235（CN 1944666A）為對蝦白斑綜合征病毒特異性引物。查閱OIE水生動(dòng)物疾病診斷手冊，選擇IHHN356為傳染性皮下及造血器官壞死病毒特異性引物。引物由金唯智生物科技有限公司（北京）合成，引物序列見表1。

1.3.2?核酸提取及cDNA合成?取100 mg鰓絲、肝胰腺，放入1.5 mL離心管中，用小剪刀剪碎。樣品的DNA模板按照TIANamp Genomic DNA Kit血液/細(xì)胞/組織基因組DNA提取試劑盒說明書進(jìn)行提取，將提取后的模板-20 ℃保存?zhèn)溆谩悠返腞NA模板按照TRIzol Reagent說明書進(jìn)行提取，利用隨機(jī)引物，將提取的RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，并保存于-80 ℃?zhèn)溆谩?

1.3.3?單重PCR擴(kuò)增及質(zhì)粒構(gòu)建?參照Ex Taq DNA聚合酶（TaKaRa， RR01AM）說明書，配置25 μL PCR反應(yīng)體系：10× Ex Taq Buffer （Mg2+ free） 2.5 μL，MgCl2 （25 mmol/L） 1.5 μL，dNTPs （10 mmol/L） 2 μL，F(xiàn) （20 μmol/L） 0.5 μL，R （20 μmol/L） 0.5 μL，Ex Taq DNA聚合酶（5 U/μL） 0.125 μL，RNase-Free H2O 16.875 μL，模板1 μL。PCR程序：95 ℃預(yù)變性4 min，95 ℃變性20 s，56 ℃復(fù)性30 s，72 ℃延伸25 s，40個(gè)循環(huán)，最后72 ℃延伸7 min，4 ℃保溫。進(jìn)行PCR擴(kuò)增后，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，并觀察結(jié)果。將PCR產(chǎn)物送往金唯智生物科技有限公司（北京）進(jìn)行測序。

利用連接、轉(zhuǎn)化、克隆等技術(shù)手段，獲得濃度和純度較高的含有目的基因片段的重組質(zhì)粒。用TIANprep Mini Plasmid Kit質(zhì)粒小提試劑盒（TIANGEN， DP103）進(jìn)行質(zhì)粒提取，并使用超微量核酸測定儀（IMPLEN， P330）測定其濃度及純度，于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.4?多重PCR檢測方法的建立和優(yōu)化?以Ex Taq DNA聚合酶提供的體系為基礎(chǔ)，建立多重PCR反應(yīng)體系和PCR反應(yīng)程序。以建立的多重PCR反應(yīng)體系和PCR反應(yīng)程序?yàn)榛A(chǔ)，依次進(jìn)行Mg2+濃度、dNTPs濃度、引物濃度、Ex Taq DNA聚合酶濃度和退火溫度的優(yōu)化。

設(shè)計(jì)Mg2+在體系中的終濃度為1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5 mmol/L等六個(gè)濃度梯度，進(jìn)行體系中Mg2+濃度的優(yōu)化。

設(shè)計(jì)dNTPs在體系中的終濃度為0.1、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mmol/L等六個(gè)濃度梯度，進(jìn)行體系中dNTPs濃度的優(yōu)化。

設(shè)計(jì)引物在體系中的終濃度為0.1、0.25、0.5、1.0、1.5 μmol/L等六個(gè)濃度梯度，進(jìn)行體系中引物濃度的優(yōu)化。

設(shè)計(jì)Ex Taq DNA聚合酶在體系中的終濃度為0.04、0.08、0.12、0.16、0.2、0.24 U/μL等六個(gè)梯度，進(jìn)行體系中Ex Taq DNA聚合酶濃度的優(yōu)化。

以單重PCR反應(yīng)程序?yàn)榛A(chǔ)進(jìn)行反應(yīng)程序的優(yōu)化，退火溫度共設(shè)置6個(gè)梯度，分別為49.5、52.5、55.5、58.5、61.5和64.5 ℃。

1.3.5?多重PCR反應(yīng)的特異性測試

以凡納濱對蝦基因組為模板，引物分別為對蝦18S rDNA引物和多重PCR反應(yīng)引物，利用優(yōu)化后的體系和程序，進(jìn)行基因組特異性測試。

利用目前實(shí)驗(yàn)室掌握的病原（寄生蟲、細(xì)菌、病毒），進(jìn)行該方法的特異性測試。病原主要包括：病毒性神經(jīng)壞死病病毒（Viral Nervous Necrosis Virus，VNNV）、大鯢虹彩病毒（Andrias davidianus iridovirus，ADIV）、中華鱉虹彩病毒（Soft shelled turtle iridovirus，STIV）、草魚呼腸孤病毒（Grass carp reovirus-873，GCRV-873）、鯉春病毒（Spring viraemia of carp virus，SVCV）、傳染性造血器官壞死病毒（Infectious hematopoietic necrosis virus ， IHNV）、錦鯉皰疹病毒（Koi hepesvirus，KHV）、草魚呼腸孤病毒（Grass carp reovirus-9014，GCRV-9014）、壞鰓指環(huán)蟲（Dactylogyrus vastator）、鳙指環(huán)蟲（Dactylogyrus aristichthy）、小鞘指環(huán)蟲（Dactylogyrus vaginulatus）、頁形指環(huán)蟲（Dactylogyrus lamellatus）、嗜水氣單胞菌（Aeromonas hydrophila）、溫和氣單胞菌（Aeromonas sobria）、創(chuàng)傷弧菌（Vibrio vulnificus）、霍亂弧菌（Vibrio cholerae）、溶藻弧菌（Vibrio alginolyticus）、副溶血弧菌（Vibrio paraheamolyticus）、肝腸胞蟲（Enterocytozoon hepatopenaei，EHP）、副溶血弧菌高致病性基因（PirA、PirB）等。

1.3.6?多重PCR反應(yīng)的靈敏性測試?以10倍比梯度稀釋的質(zhì)粒（E+0～E+10）作為模板，利用優(yōu)化后的體系和程序，進(jìn)行靈敏性測試。測試過程中，以電泳條帶明晰可辨為檢測臨界線，從而測試該方法的靈敏性。

1.3.7?多重PCR反應(yīng)的準(zhǔn)確性測試?隨機(jī)抽取2015年實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)樣品22個(gè)，同時(shí)進(jìn)行多重PCR檢測和標(biāo)準(zhǔn)方法檢測，以標(biāo)準(zhǔn)方法PCR檢測結(jié)果為準(zhǔn)，對多重PCR檢測結(jié)果進(jìn)行比較，從而評價(jià)多重PCR檢測方法的準(zhǔn)確性。標(biāo)準(zhǔn)方法見表2。

2?結(jié)果

2.1?單重PCR擴(kuò)增結(jié)果

采用合成的引物WSS235、IHHN356和CMN279，分別對相應(yīng)的病毒進(jìn)行擴(kuò)增，將PCR產(chǎn)物送往金唯智生物科技有限公司（北京）進(jìn)行測序。結(jié)果顯示，三對引物均能擴(kuò)增出相應(yīng)病毒的單一目的條帶（圖1），測序后經(jīng)比對發(fā)現(xiàn)，擴(kuò)增序列為相應(yīng)病毒的特異性目的基因。

2.2?多重PCR檢測方法的確定

通過對Mg2+濃度（圖2）、dNTPs濃度（圖3）、引物濃度（圖4）和Ex Taq DNA聚合酶濃度（圖5）進(jìn)行優(yōu)化，得出多重PCR反應(yīng)體系為：10×Ex Taq Buffer （Mg2+ free） 2.5 μL，MgCl2 （25 mmol/L） 2.0 μL，dNTPs （10 mmol/L） 2.5 μL，WSSV、IHHNV和CMNV上下游引物 （20 μmol/L） 分別1.25 μL，Ex Taq DNA聚合酶（5 U/μL） 1.0 μL，RNase Free H2 O 6.5 μL，模板3.0 μL。

通過對退火溫度（圖6）進(jìn)行優(yōu)化，得到PCR反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性4 min，95 ℃變性20 s，61.5 ℃復(fù)性30 s，72 ℃延伸25 s，40個(gè)循環(huán)，最后72 ℃延伸7 min，4 ℃保溫。

2.3?多重PCR反應(yīng)的特異性

以凡納濱對蝦基因組為模板，引物分別為對蝦18S rDNA引物和多重PCR反應(yīng)引物，利用優(yōu)化后的體系和程序，進(jìn)行基因組特異性測試，結(jié)果見圖7。擴(kuò)增結(jié)果顯示，當(dāng)模板為對蝦基因組時(shí)，進(jìn)行多重PCR反應(yīng)，無擴(kuò)增條帶出現(xiàn)，說明建立的多重PCR反應(yīng)不能擴(kuò)增凡納濱對蝦基因組。

以20種病原的DNA或cDNA為模板進(jìn)行多重PCR反應(yīng)，結(jié)果見圖7。電泳圖顯示，陽性對照在235 bp、279 bp、356 bp處出現(xiàn)擴(kuò)增條帶，且條帶清晰，無拖尾，也未發(fā)現(xiàn)由于引物二聚體或引物錯(cuò)配而出現(xiàn)的非特異性擴(kuò)增條帶;同時(shí)，其他非目標(biāo)病原DNA或cDNA均無擴(kuò)增條帶出現(xiàn)。由此說明該方法特異性強(qiáng)，引物之間無干擾。

2.4?多重PCR反應(yīng)的靈敏性

多重PCR反應(yīng)的靈敏性測試結(jié)果如圖8所示，當(dāng)稀釋度為105copies/μL即模板中WSSV含量為0.974 pg、CMNV含量為1 pg、IHHNV含量為0.765 pg時(shí)，擴(kuò)增效率明顯減弱，目的條帶變暗;當(dāng)稀釋度到103copies/μL及模板中WSSV含量為9.74 fg、CMNV含量為10 fg、IHHNV含量為7.65 fg時(shí)，能夠清晰看到電泳條帶;當(dāng)稀釋度到102copies/μL及模板中WSSV含量為0.974 fg、CMNV含量為1 fg、IHHNV含量為0.765 fg時(shí)，目的片段模糊。因此，本實(shí)驗(yàn)建立的多重PCR的檢出限為103copies/μL，即模板中WSSV含量為9.74 fg、CMNV含量為10 fg、IHHNV含量為7.65 fg。

2.5?多重PCR反應(yīng)的準(zhǔn)確性測試

抽取實(shí)驗(yàn)室保存的檢驗(yàn)樣品22個(gè)，同時(shí)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)方法檢測和多重PCR檢測，以標(biāo)準(zhǔn)方法PCR檢測結(jié)果為準(zhǔn)，對多重PCR檢測結(jié)果進(jìn)行比較，從而評價(jià)多重PCR方法的準(zhǔn)確性。對比結(jié)果統(tǒng)計(jì)見表3。

注：B： 空白對照;M： DL 2000Marker;+： 陽性對照;1泳道： 1010copies/μL ;2泳道： 109copies/μL;3泳道： 108copies/μL ;4泳道： 107copies/μL;5泳道： 106copies/μL ;6泳道： 105copies/μL ;7泳道： 104copies/μL ;8泳道： 103copies/μL;9泳道： 102copies/μL ;10泳道： 101copies/μL;11泳道： 100copies/μL圖8?靈敏度測試結(jié)果

應(yīng)用建立的多重PCR方法進(jìn)行對蝦樣品檢驗(yàn)，檢測單一病毒的準(zhǔn)確率為100%，檢測混合病毒的準(zhǔn)確率為100%，表明該方法準(zhǔn)確可靠。

3?討論

多重PCR（multiplex PCR，又稱多重引物PCR或復(fù)合PCR），是在常規(guī)PCR基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一種DNA擴(kuò)增技術(shù)，其反應(yīng)原理、試劑、操作、儀器設(shè)備等與常規(guī)PCR反應(yīng)相同，其突出特點(diǎn)是一次 PCR 反應(yīng)即可同時(shí)檢測、鑒別出多種病原體，在臨床診斷病毒的混合感染中具有很高的實(shí)用價(jià)值[4]。該理論最早被Chamberian提出[6]，到2002年該技術(shù)被用于檢測凡納濱對蝦同時(shí)攜帶WSSV、TSV的情況[7]，隨后該方法在臨床檢驗(yàn)中發(fā)揮重要作用。

隨著蝦類病毒混合感染的情況越來越嚴(yán)重，在進(jìn)行蝦病診斷和親蝦篩選過程中，常規(guī)PCR和RT-PCR技術(shù)雖然較傳統(tǒng)檢驗(yàn)方法縮短了檢驗(yàn)時(shí)間，提高了準(zhǔn)確性，但是仍然要消耗大量的檢測試劑、需要足夠多的儀器設(shè)備以及完成大量的重復(fù)工作，這些問題給實(shí)驗(yàn)室造成了巨大的壓力[5]。本研究建立的多重PCR檢測方法，只需一次PCR反應(yīng)，就能檢測3種病毒，節(jié)約了2/3的檢測成本。另外，該方法可以在8 h內(nèi)同時(shí)完成凡納濱對蝦攜帶WSSV、IHHNV和CMNV的快速檢測，較常規(guī)PCR方法節(jié)省時(shí)間5 d，大大提高了檢測效率，縮短了檢測周期，能夠滿足臨床快速檢測的要求，可用于凡納濱對蝦病毒混合感染的臨床檢測和親蝦篩選等工作。

本研究通過Primer Premier 5軟件進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，并嚴(yán)格遵守引物設(shè)計(jì)原則，最終獲得多對特異性引物;結(jié)合現(xiàn)有PCR條件，篩選出符合要求的特異性引物。通過上述方法獲得的引物序列，具有擴(kuò)增片段短、擴(kuò)增效率高、特異性強(qiáng)等特點(diǎn)。這是多重PCR檢測方法靈敏度高的一個(gè)重要原因，而另一個(gè)原因是DNA聚合酶的改變。Ex Taq DNA 聚合酶與r Taq DNA 聚合酶相比，具有擴(kuò)增效率更高、錯(cuò)配率更低的特點(diǎn)。因此，本研究選擇擴(kuò)增效果更好的Ex Taq DNA 聚合酶作為多重PCR反應(yīng)的催化劑，能夠更好的完成多重PCR反應(yīng)，保證PCR結(jié)果的準(zhǔn)確性，從而提高了多重PCR檢測方法的靈敏度。

在我國，楊冰等首次研究了養(yǎng)殖對蝦同時(shí)攜帶WSSV、IHHNV的情況，并利用多重PCR技術(shù)檢出兩種病毒，該體系對WSSV DNA的檢測靈敏度為2.6 pg，對IHHNV DNA檢測靈敏度為99.25 fg[8]。吳思思等用多重PCR同時(shí)檢測WSSV和TSV，其靈敏度分別為5 pg和0.5 pg。此后，很對學(xué)者開展了利用多重PCR技術(shù)檢測蝦類病原的研究，其靈敏度一般在0.1～10 pg范圍內(nèi)。而本研究建立的多重PCR檢測方法，能夠最低檢測出WSSV 9.74 fg、CMNV 10 fg、IHHNV 7.65 fg，比其他多重PCR反應(yīng)靈敏度提高10倍。

利用多重PCR檢測方法與實(shí)驗(yàn)室現(xiàn)有檢測方法分別對實(shí)驗(yàn)室樣品進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)兩種方法的檢測結(jié)果完全一致，說明該方法的準(zhǔn)確性高。因此，本研究建立的多重PCR檢測方法，具有檢驗(yàn)時(shí)間短、特異性強(qiáng)、靈敏度高、結(jié)果準(zhǔn)確的特點(diǎn)。

WSSV、IHHNV和CMNV作為目前對蝦養(yǎng)殖生產(chǎn)中重要的病毒病原，不僅能夠單獨(dú)感染養(yǎng)殖對蝦，還能夠混合感染。在對上一年度檢驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)時(shí)，發(fā)現(xiàn)混合感染樣品占樣品總數(shù)的10%，這說明多種病毒混合感染的現(xiàn)象日趨嚴(yán)重。本研究建立的多重PCR檢測方法具有快速、準(zhǔn)確的特點(diǎn)，滿足生產(chǎn)的需要。在親蝦篩選、苗種檢疫中應(yīng)用，能保證養(yǎng)殖者投放的蝦苗安全、可靠;在養(yǎng)殖過程中定期檢測病原攜帶情況，可以及早發(fā)現(xiàn)疾病，防止疾病的爆發(fā)流行，最大限度地減少經(jīng)濟(jì)損失，保證對蝦健康養(yǎng)殖和產(chǎn)業(yè)發(fā)展。

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（收稿日期：2018-10-15）