趙 敏 王玥萱 徐運(yùn)飛 趙啟安 劉 博 楊 寧*

(1.西北師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，蘭州 730070； 2.信陽(yáng)農(nóng)林學(xué)院農(nóng)學(xué)院，信陽(yáng) 464000)

干旱已成為世界范圍內(nèi)嚴(yán)重限制農(nóng)作物生產(chǎn)的主要因素之一，干旱對(duì)其各個(gè)生長(zhǎng)發(fā)育階段具有廣泛的影響，包括種子萌發(fā)、營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)、開(kāi)花結(jié)實(shí)等。在干旱條件下，所有植物，無(wú)論它們的耐受性水平如何，都會(huì)激活相似的基本反應(yīng)，如控制離子轉(zhuǎn)運(yùn)、特定滲透物質(zhì)的積累或激活抗氧化系統(tǒng)。同時(shí)干旱對(duì)光合作用、呼吸代謝、水分和營(yíng)養(yǎng)的吸收轉(zhuǎn)運(yùn)、有機(jī)物質(zhì)的轉(zhuǎn)化、運(yùn)輸、積累等都有著重要的影響[1]。有研究表明，干旱造成的作物減產(chǎn)超過(guò)所有自然災(zāi)害的總和，并且由于干旱缺水造成地表水源補(bǔ)給不足，只能依靠大量超采地下水來(lái)維持居民生活和工農(nóng)業(yè)發(fā)展，進(jìn)而導(dǎo)致植被嚴(yán)重退化、地下水位下降等一系列問(wèn)題，使生態(tài)環(huán)境日益惡化[2]。因此，研究植物抗旱機(jī)制以提高作物的耐受性，將會(huì)為現(xiàn)代農(nóng)業(yè)發(fā)展提供一定的理論基礎(chǔ)。

H2S是一種無(wú)色易燃有臭雞蛋氣味的氣體，長(zhǎng)期以來(lái)，人們對(duì)H2S的認(rèn)識(shí)僅局限于其毒性和環(huán)境污染等方面[3]。直到30年前，有研究證實(shí)，在大鼠腦中以及人腦中檢測(cè)到有內(nèi)源H2S含量的存在，推測(cè)H2S可能存在一定的生理作用[4]。近年來(lái)對(duì)H2S的研究成為醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的熱點(diǎn)之一，研究表明H2S在調(diào)控神經(jīng)系統(tǒng)和心血管系統(tǒng)方面具有重要的生理功能，被確認(rèn)為是繼一氧化氮(NO)和一氧化碳(CO)之后的第三種氣體信號(hào)分子[5]。相對(duì)而言，H2S在植物中的研究較少。植物體內(nèi)源H2S的產(chǎn)生主要是以L/D-半胱氨酸脫巰基酶(L/D-CDes)催化分解L/D-半胱氨酸(L/D-Cys)產(chǎn)生，L-CDes與D-CDes相比，L-CDes的催化活力更高[6]。外界的脅迫信號(hào)通過(guò)植物體內(nèi)自身的信號(hào)傳導(dǎo)途徑傳遞到細(xì)胞內(nèi)會(huì)激活抗逆基因的表達(dá)，使植物響應(yīng)外界環(huán)境條件的變化，H2S的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑會(huì)參與這一復(fù)雜的應(yīng)答機(jī)制[7]。硫氫化鈉(NaHS)作為H2S的外源供體，參與植物種子發(fā)芽、根的形態(tài)建成[8～9]、提高多種植物抵御非生物脅迫，如干旱[10]、重金屬脅迫[11]等。

植物激素是調(diào)節(jié)非生物脅迫下植物生長(zhǎng)的關(guān)鍵因子，它們參與植物對(duì)環(huán)境脅迫的響應(yīng)，其中脫落酸(ABA)是調(diào)節(jié)植物非生物脅迫耐受性中最關(guān)鍵的激素[12]。ABA屬于類異戊二烯基團(tuán)，是由質(zhì)體2-甲基-赤蘚糖醇-4-磷酸途徑形成的副產(chǎn)物。ABA影響不同的生理過(guò)程，特別是在發(fā)育階段如氣孔開(kāi)放、種子休眠、胚胎形態(tài)發(fā)生、貯藏蛋白質(zhì)和脂質(zhì)的合成[13]。ABA參與多種非生物脅迫，并觸發(fā)各種信號(hào)傳導(dǎo)途徑。有研究證實(shí)，土壤干旱時(shí)，失水的根系首先會(huì)產(chǎn)生根源信號(hào)ABA，隨木質(zhì)部蒸騰流到達(dá)葉片的保衛(wèi)細(xì)胞，從而抑制K+內(nèi)流通道的活性，蘋(píng)果酸滲出，保衛(wèi)細(xì)胞膨壓下降，最終促進(jìn)氣孔關(guān)閉[14]。在缺氮和干旱脅迫的情況下，ABA使植物產(chǎn)生各種適應(yīng)性變化，例如促進(jìn)根的生長(zhǎng)[15]。除此之外，ABA還參與種子萌發(fā)、影響抗氧化酶和其他滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的合成來(lái)提高其對(duì)干旱的耐受性[16]。干旱脅迫下ABA對(duì)植物耐受性的作用是顯著的，但是ABA影響植物抗旱性的機(jī)制目前還不是特別清楚，有待進(jìn)一步研究。

有研究表明H2S誘導(dǎo)氣孔關(guān)閉具有濃度依賴性(<100 μmol·L-1)，濃度太高(≥500 μmol·L-1)時(shí)氣孔孔徑反而會(huì)變大，并影響細(xì)胞的生活力；并且H2S也會(huì)影響ABA誘導(dǎo)氣孔關(guān)閉的能力，影響ABA受體的表達(dá)，從而證實(shí)了H2S與ABA共同作用調(diào)節(jié)氣孔，增強(qiáng)植物應(yīng)對(duì)環(huán)境脅迫的能力[17]。有關(guān)信號(hào)分子H2S與ABA響應(yīng)干旱脅迫中的信號(hào)關(guān)系鮮有報(bào)道。本文以野生型擬南芥WT、H2S合成酶缺失型突變體lcd和ABA1缺失突變體aba1為材料，以0.3 mol·L-1甘露醇模擬干旱脅迫，結(jié)合外源添加H2S、ABA供體NaHS、ABA，利用生理指標(biāo)結(jié)合分子手段的方法，探討ABA與H2S在擬南芥耐旱性中作用和關(guān)系，旨在揭示干旱脅迫下ABA和信號(hào)分子H2S的相互作用及信號(hào)關(guān)系，為進(jìn)一步研究植物的抗旱機(jī)制提供一定的科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 擬南芥的培養(yǎng)

本試驗(yàn)以WT、lcd(SALK_082099)和aba1(SALK_059469)突變體為研究材料。其中，WT種子由本課題組提供，lcd和aba1T-DNA插入突變體種子均購(gòu)自美國(guó)俄亥俄州立大學(xué)擬南芥生物資源中心(ABRC)。

將擬南芥種子用無(wú)菌水浸泡后，放置于4℃冰箱中春化3 d。將種子用無(wú)菌水沖洗30 s，75%乙醇吹打30 s，無(wú)菌水沖洗30 s，隨后用0.5%次氯酸鈉溶液清洗2 min，無(wú)菌水沖洗3次。接種于MS+30 g·L-1蔗糖、pH5.8的瓊脂培養(yǎng)基中，在溫度23℃、光照2 000 lux、光周期為16/8 h的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)16 d。土培苗按照土∶蛭石=2∶1的栽培方法，光周期為16/8 h，每周澆兩次營(yíng)養(yǎng)液，待生長(zhǎng)至4周進(jìn)行實(shí)驗(yàn)處理。

選擇生長(zhǎng)一致的擬南芥植株以0.3 mol·L-1的甘露醇進(jìn)行干旱處理，處理時(shí)間為：6、12、24、48、72 h。實(shí)驗(yàn)以0 h作為空白對(duì)照，未添加甘露醇處理的作為陰性對(duì)照組，添加甘露醇處理為實(shí)驗(yàn)組。

1.2 突變體鑒定

1.2.1 擬南芥DNA提取

取生長(zhǎng)4周的擬南芥新鮮葉片，按照Easy Pure? Plant Genomic DNA Kit提取總DNA。

1.2.2 突變體鑒定引物

根據(jù)http://signal.salk.edu/tdnaprimers.2.html設(shè)計(jì)，設(shè)計(jì)特異性引物分別如下(表1)。

表1突變體鑒定引物

Table1IdentificationofmutantprimersforPCRinthemanuscription

引物名稱Primer name基因序列Gene sequence(5'—3')LBa1TGGTTCACGTAGTGGGCCATCGAtaba1 LPGATGTTGGTGGTGGAAAAATGAtlaba1 RPACGTTCAAGAGCATCGTCATCAtlcd LPGATTGAGGGATGGAGAGGAAGAtlcd RPAGTCGGAGTTTCTTACTCGCC

PCR采用20 μL體系：1 μLlcd、aba1上游引物(LP)，1 μL下游引物(RP)，WT、lcd、aba1 DNA模板1 μL，2×Taq PCR Star Mix with Loading Dye 10 μL，ddH2O 7 μL。PCR循環(huán)條件為：

lcd程序設(shè)定為：94℃ 10 min，30個(gè)循環(huán)(94℃ 30 s，54℃ 30 s，72℃ 30 s)，72℃ 1 min。

aba1程序設(shè)定為：94℃ 10 min，30個(gè)循環(huán)(94℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 30 s)，72℃ 1 min。

采用1%的瓊脂糖凝膠電泳，溴化乙錠(EB)染色，UVI凝膠圖像分析系統(tǒng)觀察照相。

1.3 擬南芥總RNA提取

使用TaKaRa公司的Trizol試劑盒進(jìn)行提取，所有提取用品在121℃高壓滅菌25 min，試驗(yàn)過(guò)程均在超凈工作臺(tái)進(jìn)行，提取出的RNA用TaKaRa公司的Primer ScriptTMRT reagent Kit With gCDNA Eraser(Perfect Real Time)反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄成為cDNA。

1.4 RT-qPCR反應(yīng)

定量引物用DNAstar軟件PrimerSelect模塊，設(shè)計(jì)特異性引物(表2)。

RT-qPCR反應(yīng)體系：按照TAKARA公司的SYBR Premix Ex TaqTMⅡ(Tli RNaseH Plus)操作說(shuō)明書(shū)于25 μL反應(yīng)體系中進(jìn)行PCR擴(kuò)增(表3)。

表2 基因特異性引物

表3 qRT-PCR反應(yīng)體系

1.5 L/D-CDes酶活、H2S含量以及ABA含量測(cè)定

H2S含量、ABA含量由上海酶聯(lián)生物公司的試劑盒測(cè)定，具體操作按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。L/D-CDes酶活性測(cè)定采用亞甲基藍(lán)法[18]，略有改動(dòng)。具體方法如下：稱取不同處理的擬南芥蓮座葉0.2 g，加入2 mL 20 mmol·L-1Tris-HCl緩沖液研磨(pH7.4)，離心后取上清。1 mL的反應(yīng)體系為：0.8 mmol·L-1L/D-Cys，2.5 mmol·L-1DTT，100 mmol·L-1Tris-HCl pH9.0/pH8.0和100 μL上清液。將裝有醋酸鋅(ZnAc)的1.5 mL EP管裝有含上述混合液的小三角瓶?jī)?nèi)，迅速將小三角瓶封嚴(yán)，于37℃搖床孵育15 min后，在EP管加入30 mmol·L-1FeCl3與20 mmol·L-1N,N-二甲基對(duì)苯二胺各100 μL搖勻終止反應(yīng)。室溫避光反應(yīng)15 min后，在波長(zhǎng)為670 nm的紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)UNICO(UV-2102)中測(cè)定OD值，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算L/D-CDes酶活性。

1.6 種子萌發(fā)率測(cè)定

選擇均勻飽滿的種子，每個(gè)處理設(shè)3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)有50顆種子，從開(kāi)始光照培養(yǎng)時(shí)起，觀察并統(tǒng)計(jì)萌發(fā)的種子數(shù)目，以胚根突破種皮1 mm即視為萌發(fā)，計(jì)算萌發(fā)百分率。

萌發(fā)率=第10天已萌發(fā)種子數(shù)/供試種子數(shù)×100%

(1)

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

數(shù)據(jù)采用SPSS17.0對(duì)組間隨時(shí)間變化的差異性多重比較采用LSD法分析，作圖在Origin pro 9.0中進(jìn)行。每次試驗(yàn)至少進(jìn)行3次獨(dú)立重復(fù)試驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 lcd與aba1純合突變體的篩選

以WT為對(duì)照，通過(guò)三引物鑒定法對(duì)T-DNA插入突變體進(jìn)行純合突變體鑒定，其中純合突變體中用基因特異性引物無(wú)法擴(kuò)增出條帶，用T-DNA特異性引物可以擴(kuò)增出目的帶，結(jié)果如圖1所示，其中M為Marker，1泳道WT可用LP+RP引物擴(kuò)增出片段，lcd和aba1突變株系用基因特異性引物L(fēng)P+RP無(wú)法擴(kuò)增出條帶，而用T-DNA特異性引物L(fēng)Bb1+RP可以擴(kuò)增出目的條帶，證明T-DNA成功插入兩條鏈中，從而篩選出lcd與aba1純合突變體，擴(kuò)繁并用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.2 干旱脅迫對(duì)擬南芥種子萌發(fā)的影響

由圖2可知，萌發(fā)10 d后，我們發(fā)現(xiàn)干旱脅迫下WT、lcd和aba1種子萌發(fā)明顯滯后于其正常培養(yǎng)基中的萌發(fā)，且干旱對(duì)其生長(zhǎng)也有一定的抑制作用。lcd和aba1的種子萌發(fā)率在脅迫處理第3 d明顯低于WT，且WT、lcd和aba1在干旱脅迫下，種子萌發(fā)率分別降低14%，22%，48.65%，干旱脅迫對(duì)aba1的抑制效果要比lcd更為顯著，說(shuō)明LCD，ABA1基因均參與調(diào)控干旱脅迫下擬南芥的種子萌發(fā)過(guò)程，且lcd，aba1突變體對(duì)干旱脅迫更加敏感。

圖1 lcd、aba1純合突變體的PCR鑒定 A：1.WT，LP+RP；2.lcd，LP+RP；3.lcd，LB+RP B：1.WT，LP+RP；2.aba1，LP+RP；3.aba1，LB+RPFig.1 Identification of omozygous strains by PCR A:1.WT with LP+RP; 2.lcd with LP+RP; 3.lcd with LB+RPB:1.WT with LP+RP; 2.aba1 with LP+RP; 3.aba1 with LB+RP

圖2 干旱脅迫對(duì)WT、lcd、aba1擬南芥生長(zhǎng)(A)、種子萌發(fā)率(B)的影響 圖中小寫(xiě)字母表示同一株系不同濃度在P<0.05時(shí)的顯著性差異，大寫(xiě)字母表示不同株系同一濃度在P<0.05時(shí)的顯著性差異，下同。Fig.2 Effects of drought stress on growth(A) and seed germination rate(B) of WT,lcd and aba1 The lowercase letters in the figure indicate the significant differences in the different concentrations of the same strain at P<0.05,and the uppercase letters indicate the significant difference in the same concentration of different strains at P<0.05,the same as below.

2.3 干旱脅迫對(duì)野生型擬南芥H2S含量、L/D-CDes酶活性及ABA含量的影響

由圖3A可知，干旱脅迫下，野生型擬南芥內(nèi)源H2S含量增加，從圖3中可以看出，在不同的干旱脅迫時(shí)間處理下，H2S含量均顯著高于空白對(duì)照組。與對(duì)照組相比，0.3 mol·L-1甘露醇處理下，H2S含量分別在24 h最低，72 h達(dá)到最大值。同時(shí)干旱脅迫顯著提高了擬南芥葉片中L/D-CDes活性(圖3B)，且L/D-CDes酶活性的變化變化趨勢(shì)相似，但L-CDes>D-CDes。由此得出H2S響應(yīng)干旱脅迫，且L-CDes與干旱誘導(dǎo)的H2S合成緊密相關(guān)。

圖3C表示干旱脅迫下ABA含量隨甘露醇處理時(shí)間的變化，干旱脅迫下，ABA含量顯著提高，在處理時(shí)間范圍內(nèi)，ABA含量變化呈波動(dòng)趨勢(shì)，其中在12 h達(dá)到最大值，說(shuō)明ABA響應(yīng)干旱脅迫。

圖3 干旱脅迫對(duì)野生型擬南芥H2S含量(A)、L/D-CDes活性(B)、ABA含量(C)的影響Fig.3 Effects of H2S content (A),L/D-CDes activities (B) and ABA content (C) under drought stress in Wild-type Arabidopsis

圖4 干旱脅迫對(duì)野生型擬南芥中LCD(A)、ABA1(B)基因相對(duì)表達(dá)的影響 圖中小寫(xiě)字母表示同一時(shí)間不同濃度在P<0.05時(shí)的顯著性差異，大寫(xiě)字母表示不同時(shí)間同一濃度在P<0.05時(shí)的顯著性差異，下同。Fig.4 Effects of drought stress on the gene relative expressions of LCD(A) and ABA1(B) in wild-type Arabidopsis The lower case letters indicate the same time different concentrations at P<0.05 when the significant difference between the capital letters that the same concentrations at the different time in the P<0.05 significant difference,the same as below.

2.4 干旱脅迫對(duì)野生型擬南芥LCD、ABA1相對(duì)基因表達(dá)量的影響

在干旱脅迫下，合成L-CDes和ABA的基因LCD、ABA1基因相對(duì)表達(dá)的變化如圖4所示。圖4A表明，LCD基因相對(duì)表達(dá)總體表現(xiàn)逐漸增加的趨勢(shì)，且變化趨勢(shì)與L-CDes酶活性基本保持一致，在72 h達(dá)到峰值。圖4B表示ABA1基因相對(duì)表達(dá)隨干旱脅迫時(shí)間的變化情況，在6～72 h的處理時(shí)間內(nèi)，其基因相對(duì)表達(dá)隨干旱脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)進(jìn)一步增加，總體呈波動(dòng)趨勢(shì)，分別在24 h達(dá)到最小和在48 h達(dá)到最大值。轉(zhuǎn)錄水平分析表明，干旱脅迫通過(guò)改變LCD，ABA1基因的表達(dá)從而使L-CDes酶活性及ABA含量發(fā)生變化。

圖5 干旱脅迫下，外源添加NaHS、ABA對(duì)WT中H2S含量的影響Fig.5 Effects of exogenous NaHS,ABA on H2S content in WT under drought stress

圖6 干旱脅迫下，外源添加NaHS或ABA對(duì)WT、aba1和lcd中H2S含量的影響Fig.6 Effects of exogenous NaHS or ABA on the content of H2S in WT,aba1 and lcd under drought stress

圖7 外源NaHS、ABA對(duì)干旱脅迫下WT、aba1、lcd中ABA1、LCD相對(duì)基因表達(dá)量的影響Fig.7 Effects of exogenous NaHS or ABA on the relative expression of ABA1 and LCD in WT,aba1 and lcd under drought stress

2.5 干旱脅迫下，外源NaHS、ABA對(duì)野生型擬南芥內(nèi)源H2S含量的影響

如圖5所示，干旱脅迫下，分別外源添加150 μmol·L-1NaHS，25 μmol·L-1ABA后，隨著處理時(shí)間，H2S含量會(huì)顯著上升。表明ABA及H2S供體NaHS顯著影響野生型擬南芥H2S的產(chǎn)生，說(shuō)明干旱脅迫下，ABA和H2S存在一定的聯(lián)系。

2.6 干旱脅迫下，外源NaHS、ABA對(duì)WT、lcd和aba1中內(nèi)源H2S含量的影響

我們利用WT、H2S合成酶缺失型突變體lcd和ABA1缺失突變體aba1，通過(guò)外源添加NaHS、ABA對(duì)LCD、ABA1基因的缺失進(jìn)行補(bǔ)償實(shí)驗(yàn)，研究干旱脅迫下，ABA和H2S的信號(hào)關(guān)系(圖6)。

干旱脅迫下，外源添加NaHS或ABA后，aba1中H2S含量的均顯著上升，說(shuō)明外源NaHS與ABA對(duì)aba1中內(nèi)源H2S的釋放產(chǎn)生作用，外源添加NaHS促進(jìn)WT、aba1與lcd中H2S產(chǎn)生，但aba1與lcd沒(méi)有恢復(fù)WT中H2S的釋放量，說(shuō)明調(diào)控H2S產(chǎn)生的不僅僅只有ABA1與LCD。當(dāng)外源添加ABA后，對(duì)lcd中H2S的產(chǎn)生沒(méi)有顯著的促進(jìn)作用，初步說(shuō)明H2S位于ABA下游。

2.7 干旱脅迫下，外源NaHS、ABA對(duì)WT、lcd和aba1中LCD、ABA1相對(duì)基因表達(dá)量的影響

為了進(jìn)一步證實(shí)H2S位于ABA下游，我們通過(guò)轉(zhuǎn)錄水平，研究外源NaHS、ABA對(duì)WT、lcd、aba1中LCD、ABA1基因相對(duì)表達(dá)的影響，結(jié)果如圖7所示，干旱處理48 h后，脅迫誘導(dǎo)WT、aba1和lcd中ABA、LCD基因相對(duì)表達(dá)上調(diào)，其中aba1和lcd中ABA、LCD基因相對(duì)表達(dá)顯著低于WT中ABA1、LCD基因相對(duì)表達(dá)，當(dāng)外源添加H2S供體NaHS進(jìn)行補(bǔ)償LCD的缺失后，WT、lcd、aba1中ABA1與LCD基因相對(duì)表達(dá)均有不同程度的提高，而外源添加ABA進(jìn)行補(bǔ)償ABA1的缺失后，WT與aba1中ABA1，LCD基因相對(duì)表達(dá)上調(diào)，但ABA對(duì)lcd突變體中LCD基因相對(duì)表達(dá)促進(jìn)作用不明顯，轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)而證實(shí)了H2S位于ABA下游發(fā)揮作用這一結(jié)論。

3 討論

植物的生長(zhǎng)發(fā)育經(jīng)常會(huì)受到環(huán)境非生物因素的極大影響，如干旱、高鹽、低溫等，植物處于逆境環(huán)境時(shí)，首先要響應(yīng)并適應(yīng)這些脅迫條件從而在逆境中生存，而干旱作為一種重要的環(huán)境因素一直是國(guó)內(nèi)外研究的熱點(diǎn)[19]。

H2S是新發(fā)現(xiàn)的第3種內(nèi)源性氣體信號(hào)分子，參與在植物多種生理過(guò)程。植物中H2S主要通過(guò)的產(chǎn)生半胱氨酸脫巰基酶(CDes)催化半胱氨酸產(chǎn)生，目前擬南芥中已經(jīng)克隆了一些CDes編碼基因，其中LCD與DCD是植物內(nèi)源H2S產(chǎn)生過(guò)程中編碼CDes合成酶功能最明確的兩個(gè)基因[20]。越來(lái)越多的研究表明，H2S作為新型氣體信號(hào)分子會(huì)參與低溫、高鹽和干旱脅迫下的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，且外源NaHS能夠緩解脅迫所引起的損傷[21]。植物激素是一類小分子化合物，調(diào)控了植物生長(zhǎng)、發(fā)育和對(duì)環(huán)境變化的響應(yīng)。通過(guò)改變激素的合成、運(yùn)輸和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，植物能夠調(diào)節(jié)生長(zhǎng)與脅迫耐受的平衡，從而促進(jìn)植物在脅迫環(huán)境中生存。ABA作為一種重要的植物激素，它在植物的生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用[22]。孫麗敏等[23]發(fā)現(xiàn)H2S信號(hào)和WRKY會(huì)增強(qiáng)ABA調(diào)節(jié)根生長(zhǎng)和氣孔運(yùn)動(dòng)顯示H2S與ABA之間存在密切關(guān)系。但關(guān)于干旱脅迫下，H2S與ABA在植物中的信號(hào)作用關(guān)系鮮有報(bào)道。

干旱影響植物的生長(zhǎng)發(fā)育，本文通過(guò)測(cè)定WT、lcd和aba1的種子萌發(fā)率的結(jié)果發(fā)現(xiàn)干旱脅迫下lcd和aba1突變體的萌發(fā)率均顯著低于WT，且aba1種子發(fā)芽率抑制作用最為明顯(圖2)，說(shuō)明ABA對(duì)干旱脅迫更加敏感。干旱脅迫促使擬南芥幼苗中H2S含量的增加以及CDes活性的增強(qiáng)(圖3)，二者在6～72 h脅迫時(shí)間內(nèi)有相同的變化趨勢(shì)(圖3:A～B)，CDes活性變化中，L-CDes活性始終高于D-CDes活性，說(shuō)明干旱脅迫下，在合成H2S中，L-CDes占主導(dǎo)作用。這與本課題組前期關(guān)于干旱脅迫下研究擬南芥中H2S與PLDα1響應(yīng)干旱脅迫作用的研究結(jié)果相一致[24]，另一方面，干旱脅迫也會(huì)誘導(dǎo)ABA含量的上升(圖3C)，且ABA含量隨處理時(shí)間呈波動(dòng)趨勢(shì)。H2S和ABA都會(huì)積極響應(yīng)干旱脅迫，推測(cè)二者在響應(yīng)脅迫的過(guò)程中有一定的聯(lián)系。

對(duì)干旱脅迫下LCD和ABA1的基因表達(dá)進(jìn)行定量分析發(fā)現(xiàn)，干旱脅迫均能誘導(dǎo)LCD和ABA1表達(dá)上調(diào)(圖4)，且LCD與L-CDes酶活性的變化趨勢(shì)相同，在72 h達(dá)到最大，說(shuō)明在干旱上調(diào)LCD的表達(dá)，從而促使L-CDes酶活性的變化。如圖4B，ABA1表達(dá)在48 h達(dá)到峰值，但ABA含量卻在12 h就已經(jīng)達(dá)到了最大值，說(shuō)明ABA含量變化先于ABA1的表達(dá)，ABA1表達(dá)有滯后效應(yīng)。為了證明H2S和ABA存在聯(lián)系，分別外源添加150 μmol·L-1NaHS，25 μmol·L-1ABA后發(fā)現(xiàn)，隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)，H2S含量會(huì)顯著上升(圖5)，說(shuō)明ABA和H2S供體NaHS能夠顯著影響野生型擬南芥H2S產(chǎn)生，進(jìn)一步說(shuō)明了干旱脅迫下，ABA與NaHS可能參與H2S的合成。

以擬南芥WT、突變體aba1和lcd為研究材料，通過(guò)外源添加ABA與NaHS進(jìn)行補(bǔ)償實(shí)驗(yàn)，探究ABA與H2S在干旱脅迫下的信號(hào)關(guān)系。結(jié)果表明，干旱脅迫誘導(dǎo)H2S的產(chǎn)生。外源添加NaHS和ABA后，促進(jìn)了WT、aba1和lcd中H2S的釋放(圖6)，說(shuō)明即使ABA1，LCD基因缺失，但NaHS對(duì)WT、aba1、lcd中H2S釋放仍然有促進(jìn)作用，當(dāng)外源添加NaHS補(bǔ)償LCD的缺失后，H2S含量顯著上升，但aba1與lcd并沒(méi)有恢復(fù)WT中H2S的釋放量，說(shuō)明調(diào)控H2S產(chǎn)生的不僅僅只有ABA1與LCD。此結(jié)果與Qiao Z等人研究CDPKs通過(guò)在擬南芥中增強(qiáng)H2S信號(hào)來(lái)增強(qiáng)Cd耐受性的研究結(jié)果相似[25]，當(dāng)外源添加ABA后，促進(jìn)了WT，aba1中H2S的釋放，卻對(duì)lcd中H2S的產(chǎn)生沒(méi)有顯著的促進(jìn)作用(圖6)，說(shuō)明ABA誘導(dǎo)H2S的產(chǎn)生依賴于LCD，也初步說(shuō)明了H2S可能位于ABA下游。

為了證實(shí)上一結(jié)論，我們從轉(zhuǎn)錄水平分析H2S與ABA響應(yīng)干旱脅迫的信號(hào)關(guān)系。如圖7A所示，干旱脅迫能均誘導(dǎo)WT、aba1和lcd突變體擬南芥中ABA1、LCD的基因相對(duì)表達(dá)，aba1和lcd中ABA1、LCD的基因相對(duì)表達(dá)顯著低于WT中ABA1、LCD的基因相對(duì)表達(dá)，表明干旱脅迫通過(guò)上調(diào)ABA1、LCD的基因相對(duì)表達(dá)從而促進(jìn)ABA含量與H2S含量上升。外源添加NaHS、ABA后，WT、lcd、aba1中ABA1基因相對(duì)表達(dá)均有不同程度的提高，但lcd、aba1中ABA1基因相對(duì)表達(dá)并沒(méi)有恢復(fù)到WT中ABA1基因相對(duì)表達(dá)水；NaHS、ABA對(duì)lcd、aba1中H2S含量的影響也得到了相似的結(jié)果，當(dāng)外源添加NaHS、ABA后，促進(jìn)WT、aba1中LCD的表達(dá)，表明aba1突變體中缺失ABA1基因并沒(méi)有影響LCD基因相對(duì)表達(dá)，但外源ABA對(duì)lcd突變體中LCD基因的表達(dá)沒(méi)有顯著的促進(jìn)作用，說(shuō)明干旱脅迫通過(guò)ABA促進(jìn)H2S的釋放與上調(diào)LCD基因相對(duì)表達(dá)進(jìn)而調(diào)控植物生長(zhǎng)，干旱脅迫下H2S信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)依賴于ABA1。轉(zhuǎn)錄水平證實(shí)了H2S位于ABA下游發(fā)揮作用這一結(jié)論。

綜上，本研究表明干旱脅迫下，植物通過(guò)上調(diào)LCD、ABA1基因相對(duì)表達(dá)從而提高CDes酶活性，ABA含量的效果，進(jìn)而開(kāi)啟H2S與ABA響應(yīng)干旱的途徑；在該響應(yīng)途徑中，H2S位于ABA信號(hào)下游發(fā)揮作用，但信號(hào)途徑存在復(fù)雜而緊密的作用機(jī)制，這種作用機(jī)制仍值得進(jìn)一步深入研究。