王 晶 趙津璋 劉國良 李 微 周艷麗*

辛伐他汀屬于羥甲基戊二酰還原酶抑制劑(hydroxy methyl glutary coenzyme A，HMG-CoA)， 是美國Merck公司以土曲霉菌的酵解產(chǎn)物合成而得，具有抑制內(nèi)源性膽固醇的合成及調(diào)節(jié)血脂的作用，主要用于高血脂的治療[1]。然而，近年來研究發(fā)現(xiàn)，辛伐他汀還有其他的藥理活性，如擴張血管、促進(jìn)骨代謝、抗血栓、抗氧化、抗炎等作用[2]。本研究通過觀察辛伐他汀對去卵巢小鼠高轉(zhuǎn)換的骨代謝狀態(tài)的調(diào)節(jié)作用，分析辛伐他汀對骨代謝過程中骨形成和骨吸收指標(biāo)的影響，為他汀類藥物應(yīng)用于骨病治療提供數(shù)據(jù)支持。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

選取36只清潔級未孕雌性昆明小鼠，體重(20±3)g，8～10周齡，均購于黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)藥物安全性評價(good laboratory practice，GLP)實驗中心，合格證號為SCXK(黑)2013-0004。

1.2 儀器設(shè)備與試劑

(1)儀器設(shè)備。雙能X射線骨密度儀(美國HOLOGIC公司)；MUTISKAN MK3型酶標(biāo)儀(美國賽默飛世爾科技公司)；實驗設(shè)備還包括-20 ℃和-80 ℃冰箱、分析天平、顯微鏡、手術(shù)剪、骨剪、眼科鑷、可吸收縫合線、縫合針、載玻片和蓋玻片等。

(2)試劑。辛伐他汀片(商品名辛可，20 mg/片，廣州南新制藥有限公司)；蘇木精(上海藍(lán)季生物)；曙紅Y(天津市天新精細(xì)化工開發(fā)中心)；酶聯(lián)免疫(ELISA)骨鈣素(bone glaprotein，BGP)試劑盒、酶聯(lián)免疫(ELISA)TRAP5b試劑盒、酶聯(lián)免疫(Elisa)骨源性堿性磷酸酶(bone alkaline phosphatase，BALP)試劑盒(南京建成生物工程研究所)。

1.3 實驗方法

1.3.1 動物造模

(1)將適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d的小鼠采用隨機分組法分為模型組(25只)和假手術(shù)組(11只)。手術(shù)前12 h，禁水處理。

(2)模型組小鼠采用10%水合氯醛腹腔注射(0.4 ml/100 g)，麻醉后取臥位，分別在背部脊柱兩側(cè)備皮。先在一側(cè)背腹部行縱向切口約0.5 cm，依次切開皮膚、腰肌，找到白色發(fā)亮的脂肪團(tuán)后，剝開脂肪即可看見淡粉色的菜花樣卵巢，在子宮角上用可吸收手術(shù)縫合線結(jié)扎后，切斷并摘除卵巢，然后依次縫合腰肌和皮膚；另一側(cè)采用同樣方法摘除卵巢。

(3)假手術(shù)組小鼠，除了摘除卵巢附近與卵巢大小相近的脂肪組織外，其余操作步驟均同模型組。

1.3.2 動物分組及給藥

術(shù)后30 d，將模型組存活的小鼠(20只)隨機分為模型組和干預(yù)組，每組10只，模型組給予生理鹽水，干預(yù)組給予辛伐他汀混懸液，5.2 mg/(kg·d)；假手術(shù)組存活的小鼠10只，給予生理鹽水。連續(xù)灌胃給藥12周。

1.4 指標(biāo)檢測

術(shù)后第4～8 d，3組小鼠每日做陰道涂片，進(jìn)行HE染色，觀察各階段陰道細(xì)胞形態(tài)，確定卵巢切除是否完全。然后摘取眼球取血，靜置30 min后，置于4 ℃低溫離心機，以13000 r/min，離心10 min。取上層血清，放置于-20 ℃冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆谩Ｈ√幩篮蟮男∈笱倒墙M織，剔除表面肌肉組織后迅速用浸透生理鹽水的紗布包好，置于-80 ℃冰箱中凍存?zhèn)溆?。采用雙能X射線骨密度儀測定小鼠腰椎骨組織的骨密度(bone mineral density，BMD)。采用酶聯(lián)免疫吸附測定(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)法測定小鼠血清中的BGP、BALP和TRAP5b含量。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析處理，數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差s)表示。兩組間比較采用t檢驗，采用單因素方差分析(One-Way ANOVA)，進(jìn)行多組間比較。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 陰道涂片檢查結(jié)果

根據(jù)陰道涂片結(jié)果判定卵巢摘除是否完全。卵巢摘除后的小鼠陰道涂片動情周期性變化消失，表現(xiàn)為大量的白細(xì)胞及少量的上皮細(xì)胞，處于動情間期。假手術(shù)組小鼠陰道涂片結(jié)果具有明顯的周期性變化：①動情前期主要為完整的上皮細(xì)胞；②動情期均為大量角化細(xì)胞；③動情后期主要為角化細(xì)胞和白細(xì)胞共存；④動情間期以白細(xì)胞為主，伴有少數(shù)上皮細(xì)胞，各階段典型特點結(jié)果如圖1所示。

圖1 假手術(shù)組小鼠動情周期陰道涂片細(xì)胞形態(tài)圖(HE，×400)

2.2 BMD測定結(jié)果

模型組與假手術(shù)組比較，模型組的平均BMD為(0.095±0.010)g/cm2，假手術(shù)組的BMD為(0.141±0.013)g/cm2，兩組比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(t=0.00015，P＜0.01)，表明模型組小鼠的BMD明顯下降。在辛伐他汀干預(yù)的條件下模型組小鼠BMD明顯低于干預(yù)組(0.125±0.011)g/cm2，兩組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=0.00075，P＜0.01)，見表1，如圖2所示。

表1 三組BMD測定結(jié)果比較

表1 三組BMD測定結(jié)果比較

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圖2 三組BMD測定結(jié)果示圖

2.3 血清生化指標(biāo)檢測結(jié)果

(1)BALP的含量測定。模型組血清中BALP活力為(21.831±3.028)金氏單位/100 ml，假手術(shù)組為(11.614±1.517)金氏單位/100 ml，兩者有極顯著性差異。干預(yù)組小鼠血清中的BALP活力為(18.052±2.586)金氏單位/100 ml，明顯高于模型組，且差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(t=0.0090，P＜0.01)，如圖3所示。

圖3 三組BALP含量測定結(jié)果示圖

(2)TRAP5b的活力測定。模型組小鼠血清中TRAP5b活力為(45.597±6.302)U/L，假手術(shù)組為(32.552±3.167)U/L，兩者差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=0.0002，P＜0.01)。干預(yù)組小鼠血清中TRAP5b活力為(35.724±4.701)U/L，與模型組比較，明顯低于模型組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(t=0.0012，P＜0.01，見表2，如圖4所示。

表2 三組TRAP5b測定結(jié)果比較(U/L，

表2 三組TRAP5b測定結(jié)果比較(U/L，

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圖4 三組TRAP5b活力測定結(jié)果示圖

(3)BGP的含量測定結(jié)果。模型組小鼠血清BGP含量為(3.976±0.694)ng/ml，假手術(shù)組為(1.549±0.524)ng/ml，兩者含量有極顯著性差異。干預(yù)組小鼠血清中的BGP含量為(2.001±0.480)ng/ml，明顯低于模型組，且差異顯著，如圖5所示。

3 討論

他汀類藥物主要用于治療高血脂及心血管系統(tǒng)疾病，是羥甲基戊二酰輔酶A(HMG-CoA)還原酶抑制劑[3]。近年來研究發(fā)現(xiàn)，他汀類藥物對BMD，骨代謝生化指標(biāo)具有顯著的療效[4-5]。辛伐他汀作為早期發(fā)現(xiàn)的經(jīng)典他汀類藥物，經(jīng)試驗證實可通過多種途徑治療骨質(zhì)疏松[6-7]。

骨吸收和骨形成的動態(tài)平衡是保證骨結(jié)構(gòu)完整性的關(guān)鍵。骨質(zhì)疏松癥的發(fā)生是骨代謝的動態(tài)平衡受到破壞，主要表現(xiàn)為BMD下降以及血清中相關(guān)因子改變。BMD是骨質(zhì)疏松癥的診斷及治療中的重要指標(biāo)，能夠衡量治療骨質(zhì)疏松藥物的有效性[8]。血清中BALP和TRAP是骨代謝的主要相關(guān)因子，通過測量血清中兩種酶的含量即可了解骨代謝狀態(tài)。因此實驗通過檢測腰椎骨密度，以及血清中的骨代謝相關(guān)因子骨性堿性磷酸酶(BALP)、抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP5b)及BGP水平，來評估辛伐他汀對BMD及骨代謝過程的影響。

本實驗結(jié)果表明，在小鼠卵巢摘除之后，其血清中骨形成的相關(guān)因子BALP活力升高；骨吸收的相關(guān)因子TRAP5b活力上升；BGP水平顯著上升，表明卵巢摘除的小鼠，處于一種高轉(zhuǎn)換的骨代謝狀態(tài)，導(dǎo)致骨量的流失；同時小鼠BMD在卵巢摘除后也明顯下降[9]。

本研究采用辛伐他汀對去卵巢小鼠進(jìn)行干預(yù)治療，實驗結(jié)果證實，與模型組小鼠相比，BALP、TRACP、BGP和BMD的4個指標(biāo)均得到了改善，表明辛伐他汀能夠減緩卵巢摘除小鼠骨密度的下降、改善骨代謝、緩解骨丟失。

圖5 三組BGP含量測定結(jié)果示圖