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(遼寧中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，遼寧 大連 116600)

穿龍薯蕷(DioscoreanipponicaMakino)為薯蕷科多年生草本植物，分布于我國(guó)東北、華北、山東、河南、安徽、浙江北部、江西(廬山)、陜西(秦嶺以北)、甘肅、寧夏、青海南部、四川西北部[1]。以干燥根莖入藥，習(xí)稱穿山龍，味甘、苦，性溫[2]，具有祛風(fēng)除濕，舒筋通絡(luò)，活血止痛等作用?，F(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn)，穿山龍具有明顯的抗炎作用，有較好的開發(fā)前景[3]。隨著穿山龍藥材需求量的不斷增加，其藥材商品的需求量也隨之增多，不同區(qū)域產(chǎn)地間藥材商品質(zhì)量差異較大等問題也隨之凸顯。原因之一是穿龍薯蕷種子商品質(zhì)量差異較大。然而關(guān)于穿龍薯蕷種子質(zhì)量等級(jí)的劃分標(biāo)準(zhǔn)十分不清晰，很難對(duì)市售種子的質(zhì)量進(jìn)行有效的控制和評(píng)價(jià)，造成種子質(zhì)量良莠不齊，嚴(yán)重影響藥材的規(guī)范化生產(chǎn)成效。因此，本研究在對(duì)不同產(chǎn)地穿龍薯蕷種子全面收集的基礎(chǔ)上，根據(jù)《農(nóng)作物種子檢驗(yàn)規(guī)程》(GB/T 3543-1995)[4]開展穿龍薯蕷種子質(zhì)量分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)研究，以期為規(guī)范和制定穿龍薯蕷種子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供依據(jù)，實(shí)現(xiàn)市售種子的規(guī)范化，從源頭控制穿龍薯蕷藥材的質(zhì)量。

1 材料與儀器

1.1 材 料

穿龍薯蕷種子于2016—2017年收集，共27個(gè)批次樣品，分別來(lái)源于黑龍江省、吉林省、遼寧省、內(nèi)蒙古自治區(qū)、甘肅省、青海省、寧夏回族自治區(qū)、陜西省、山西省、山東省、河北省、河南省、安徽省、浙江省、江西省、湖南省、四川省、廣西壯族自治區(qū)。其中，遼寧共8份樣品，分別收集于遼寧省清原縣、遼寧省清原縣英額門鎮(zhèn)丁家街村、遼寧省清原縣英額門鎮(zhèn)椽子溝村、遼寧省清原縣大孤家鎮(zhèn)、遼寧省新賓縣大四平鄉(xiāng)、遼寧省阜新市、遼寧省本溪市、遼寧省鞍山市；吉林省3份樣品，分別收集于吉林省柳河縣三源浦鎮(zhèn)、吉林省梅河口龍山、吉林省梅河縣山城鎮(zhèn)。經(jīng)遼寧中醫(yī)藥大學(xué)尹海波教授鑒定為薯蕷科植物穿龍薯蕷的干燥成熟種子，各種子批產(chǎn)地來(lái)源編號(hào)見表1。

1.2 儀 器

LRH-150-GIS人工氣候箱(韶關(guān)市泰宏醫(yī)療器械有限公司)，DNP-9162型電熱恒溫培養(yǎng)箱(上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)，電熱鼓風(fēng)干燥箱(上海一恒科學(xué)儀器有限公司)，JD 60-4電子天平(沈陽(yáng)龍騰電子有限公司)，SLY-C微電腦自動(dòng)數(shù)粒儀(杭州綠博儀器有限公司)。

2 方 法

試驗(yàn)參照《農(nóng)作物種子檢驗(yàn)規(guī)程》(GB/T 3543-1995)[4]標(biāo)準(zhǔn)執(zhí)行。

2.1 扦 樣

種子批的最大重量為10 000 kg，送檢樣品最少為50 g，凈度分析試樣最少為5 g(不少于2 500粒)。

表1 種子來(lái)源信息

2.2 真實(shí)性鑒定

采用種子外觀形態(tài)法，隨機(jī)選取100粒種子，4組重復(fù)，利用顯微鏡、游標(biāo)卡尺等儀器進(jìn)行外觀形態(tài)觀察，并記錄觀察結(jié)果。

2.3 凈度測(cè)定

每一批次種子分別選取50 g，重復(fù)3次，供試種子去掉雜質(zhì)和廢種子后，剩余潔凈種子的重量占樣品總重量的百分率即為種子凈度。

2.4 百粒重測(cè)定

利用自動(dòng)數(shù)粒儀從“2.3”項(xiàng)下的凈種子中隨機(jī)數(shù)取100粒，8個(gè)重復(fù)，分別稱重，計(jì)算8個(gè)重復(fù)的平均質(zhì)量、標(biāo)準(zhǔn)差及變異系數(shù)。變異系數(shù)不超過4.0%視為測(cè)定值有效。

2.5 含水量測(cè)定

采用高恒溫烘干法[5]，稱取各產(chǎn)地穿龍薯蕷種子樣品5 g于烘為恒重的稱量瓶中，130 ℃恒溫烘干3 h，計(jì)算種子含水量。

2.6 發(fā)芽率測(cè)定

將各產(chǎn)地穿龍薯蕷凈種子用清水沖洗掉泥沙，浸泡于75%乙醇中消毒40 min，后用大量清水沖凈乙醇，再用純凈水潤(rùn)洗3遍備用。將各產(chǎn)地種子置于直徑150 mm，鋪有1層紗布1層濾紙的培養(yǎng)皿中 ，于20 ℃人工氣候培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每天統(tǒng)計(jì)發(fā)芽率，每產(chǎn)地設(shè)置3次重復(fù)，每重復(fù)100粒種子。

2.7 生活力測(cè)定

采用四唑染色法進(jìn)行。取各產(chǎn)地100粒新鮮種子，沿種脊將種子切成兩半，露出胚乳。滴入濃度為0.6%的TTC溶液浸沒種子，置于45 ℃恒溫培養(yǎng)箱中避光染色4 h[5]，3個(gè)重復(fù)。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 外觀形態(tài)結(jié)果

穿龍薯蕷種子呈橢圓形，長(zhǎng)比寬約大2倍，四周有不等的薄膜狀翅。種仁橢圓形，呈深棕色，腹側(cè)凹入處下緣具有點(diǎn)狀臍，由種臍向一側(cè)面伸出一線狀種脊。胚白色，胚芽明顯，具子葉一枚。

3.2 各項(xiàng)指標(biāo)測(cè)定結(jié)果

對(duì)收集的27個(gè)產(chǎn)地的穿龍薯蕷種子樣品進(jìn)行凈度、含水量、百粒重、發(fā)芽率、生活力等指標(biāo)的測(cè)定，結(jié)果見表2。

結(jié)果顯示，山東、安徽、廣西、四川等4個(gè)地區(qū)的種子凈度較低(在85%以下)，其中廣西種子凈度明顯低于其他產(chǎn)區(qū)(低于65%)；吉林省柳河縣三源浦鎮(zhèn)、梅河縣山城鎮(zhèn)、遼寧省清原縣、英額門鎮(zhèn)丁家街村、內(nèi)蒙古、陜西、山西的種子凈度較高，均達(dá)到95%以上；遼寧省與吉林省的種子為一年生，其百粒重在0.89～1.40 g之間，其他省份為二年生種子，其百粒重在160.28～210.08 g之間；含水量在7.34%～11.63%之間，其中遼寧省阜新市、本溪市、鞍山市種子含水量較低，均在8.00%以下，遼寧省清原縣大孤家鎮(zhèn)、新賓縣大四平鄉(xiāng)、內(nèi)蒙古、甘肅、青海南部、寧夏、山西、山東、河北、河南、浙江北部、江西(廬山)、四川、廣西的種子含水量較高，均在10%以上。不同產(chǎn)地的穿龍薯蕷種子發(fā)芽率、生活力差異較大，發(fā)芽率在14%～88%之間，生活力在15%～94%之間。

4 數(shù)據(jù)分析處理

4.1 聚類分析

應(yīng)用SPSS 20.0軟件對(duì)表2中測(cè)定的5項(xiàng)指標(biāo)進(jìn)行系統(tǒng)聚類分析，聚類方法采用最遠(yuǎn)距離法，區(qū)間選擇平方歐氏距離，將27個(gè)產(chǎn)地的穿龍薯蕷種子在閾值10處分為兩級(jí)，結(jié)果如圖1。由圖1可知，遼寧不同產(chǎn)地的8批種子與吉林不同產(chǎn)區(qū)的3批種子為一類，其余各省及自治區(qū)為一類。

表2 不同產(chǎn)地穿龍薯蕷種子各指標(biāo)測(cè)定結(jié)果

結(jié)合系統(tǒng)聚類分析的結(jié)果，初步將27個(gè)穿龍薯蕷種子進(jìn)行了質(zhì)量等級(jí)劃分，并將各等級(jí)不同指標(biāo)的置信區(qū)間進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，見表3。

表3 穿龍薯蕷種子測(cè)定指標(biāo)等級(jí)劃分區(qū)間

4.1.1 含水量等級(jí)劃分區(qū)間的確定

從聚類分析結(jié)果可以看出，一級(jí)種子和二級(jí)種子含水量的取值范圍存在重疊，一級(jí)種子含水量為7.34%～10.42%，二級(jí)種子含水量為9.31%～11.63%，不能通過含水量將一級(jí)種子和二級(jí)種子區(qū)分開來(lái)。為獲得更為準(zhǔn)確的含水量等級(jí)劃分標(biāo)準(zhǔn)必須進(jìn)行進(jìn)一步數(shù)學(xué)處理，參照黃河[6]等的處理方法，具體如下：

1) 含水量等級(jí)界限的確定：按下列公式計(jì)算含水量界限。

M=(T1M小+T2M大)/2=(9.31+10.42)/2=9.865(%)，T1M小為一級(jí)種子含水量界限下限，T2M大為二級(jí)種子含水量界限上限。

因此，從含水量考慮，穿龍薯蕷種子一級(jí)和二級(jí)劃分界限為9.865%。

2) 含水量劃分等級(jí)的可行性分析：以含水量9.865%為等級(jí)劃分界限，將27個(gè)產(chǎn)地穿龍薯蕷種子樣品劃分為一級(jí)和二級(jí)，獲得一級(jí)種子15個(gè)，二級(jí)種子12個(gè)。對(duì)27個(gè)產(chǎn)地種子含水量數(shù)據(jù)進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)，符合正態(tài)分布，因此采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)法對(duì)一級(jí)種子和二級(jí)種子含水量進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果可知p=0.00<0.01，即以含水量9.865%為等級(jí)劃分界限時(shí)，兩級(jí)種子間存在極顯著性差異，故此劃分依據(jù)合理。

4.1.2 凈度等級(jí)劃分區(qū)間的確定

采用含水量等級(jí)區(qū)間劃分的相同方法，計(jì)算確定穿龍薯蕷種子一級(jí)品和二級(jí)品凈度的劃分界限為92.59%。以凈度92.59%為等級(jí)劃分界限，將27個(gè)產(chǎn)地種子樣品劃分為一級(jí)品和二級(jí)品，獲得一級(jí)品13個(gè)，二級(jí)品14個(gè)。對(duì)凈度數(shù)據(jù)進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)，不符合正態(tài)分布，因此采用秩和檢驗(yàn)法對(duì)一級(jí)種子和二級(jí)種子含水量進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果可知p=0.00<0.01，即以凈度92.59%為等級(jí)劃分界限時(shí)，兩級(jí)種子間存在極顯著差異，故此劃分依據(jù)合理。

4.1.3 百粒重等級(jí)劃分區(qū)間的確定

根據(jù)聚類分析結(jié)果，一級(jí)品與二級(jí)品種子的百粒重分級(jí)區(qū)間為：一級(jí)品0.89～1.40 g，二級(jí)品160.28～210.08 g。對(duì)百粒重?cái)?shù)據(jù)進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)，不符合正態(tài)分布，因此采用秩和檢驗(yàn)法對(duì)一級(jí)種子和二級(jí)種子百粒重進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果可知p=0.00<0.01，即以一級(jí)品百粒重0.89～1.40 g，二級(jí)品百粒重160.28～210.08 g為等級(jí)劃分界限時(shí)，兩級(jí)種子間存在極顯著差異，故此劃分依據(jù)合理。

4.1.4 發(fā)芽率等級(jí)劃分區(qū)間的確定

采用含水量等級(jí)區(qū)間劃分的相同方法，計(jì)算確定穿龍薯蕷種子一級(jí)品和二級(jí)品發(fā)芽率的劃分界限為63%。將27個(gè)產(chǎn)地種子樣品劃分為一級(jí)品和二級(jí)品，獲得一級(jí)品10個(gè)，二級(jí)品17個(gè)。對(duì)發(fā)芽率數(shù)據(jù)進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)，符合正態(tài)分布，因此采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)法對(duì)一級(jí)種子和二級(jí)種子發(fā)芽率進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果可知p=0.00<0.01，即以發(fā)芽率63%為等級(jí)劃分界限時(shí)，兩級(jí)種子間存在極顯著差異，故此劃分依據(jù)合理。

圖1 穿龍薯蕷種子系統(tǒng)聚類分析樹狀圖

表4 穿龍薯蕷種子連續(xù)性變量測(cè)定指標(biāo)等級(jí)劃分取值范圍

4.1.5 生活力等級(jí)劃分區(qū)間的確定

采用含水量等級(jí)區(qū)間劃分的相同方法，計(jì)算確定穿龍薯蕷種子一級(jí)品和二級(jí)品生活力的劃分界限為82%。將27個(gè)產(chǎn)地種子樣品劃分為一級(jí)品和二級(jí)品，獲得一級(jí)品10個(gè)，二級(jí)品17個(gè)。對(duì)生活力數(shù)據(jù)進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)，符合正態(tài)分布，因此采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)法對(duì)一級(jí)種子和二級(jí)種子生活力進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果可知p=0.00<0.05，即以生活力82%為等級(jí)劃分界限時(shí)，兩級(jí)種子間存在顯著差異，故此劃分依據(jù)合理。

4.2 穿龍薯蕷種子連續(xù)性變量測(cè)定結(jié)果等級(jí)劃分范圍的確定

根據(jù)上述分析結(jié)果，為提高標(biāo)準(zhǔn)的可執(zhí)行性，對(duì)各測(cè)定指標(biāo)數(shù)據(jù)取值范圍進(jìn)行調(diào)整和修正，結(jié)果見表4。

按表4中各測(cè)定指標(biāo)修正后的取值范圍，同4.1項(xiàng)下分析方法進(jìn)行獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)和秩和檢驗(yàn)(服從正態(tài)分布的資料采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，不服從正態(tài)分布的資料采用秩和檢驗(yàn))，所得穿龍薯蕷種子一級(jí)品和二級(jí)品之間均有顯著差異，p值均小于0.05，即劃分依據(jù)合理。故而根據(jù)上述數(shù)據(jù)處理結(jié)果，初步制定了穿龍薯蕷種子質(zhì)量分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)，見表5。將27個(gè)不同產(chǎn)地的穿龍薯蕷種子分為2個(gè)等級(jí)，分級(jí)方法采用最低定級(jí)原則，即任何一項(xiàng)指標(biāo)不符合定級(jí)標(biāo)準(zhǔn)均不能作為相應(yīng)等級(jí)的合格種子。分級(jí)結(jié)果為一級(jí)種子有6個(gè)，二級(jí)種子有21個(gè)。

表5 穿龍薯蕷種子質(zhì)量分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)結(jié)果

5 討 論

5.1在計(jì)算每一級(jí)種子置信區(qū)間范圍時(shí)，部分指標(biāo)的置信區(qū)間發(fā)生了重疊。以含水量為例，為解決置信區(qū)間重疊的問題，參照黃河[6]的方法，以均數(shù)加減一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)差確定一級(jí)種子和二級(jí)種子的正態(tài)分布范圍，結(jié)果如下：

一級(jí)種子和二級(jí)種子正態(tài)分布仍存在重疊，所以需要對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行進(jìn)一步處理。取一級(jí)品指標(biāo)的界限下限與二級(jí)品指標(biāo)的界限上限中點(diǎn)為新的界限值，對(duì)其進(jìn)行可行性分析，進(jìn)而得出新的界限值具有可行性。得出各指標(biāo)等級(jí)劃分取值范圍后，根據(jù)可執(zhí)行性與實(shí)際應(yīng)用價(jià)值對(duì)取值范圍進(jìn)行調(diào)整和修正，修正后的結(jié)果即為穿龍薯蕷種子質(zhì)量分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)結(jié)果。

5.2經(jīng)過進(jìn)一步數(shù)學(xué)處理后的結(jié)果與原聚類分析的結(jié)果有所不同，聚類分析結(jié)果中一級(jí)種子有11個(gè)，二級(jí)種子16個(gè)，而經(jīng)過進(jìn)一步界限值確定后結(jié)果為一級(jí)種子6個(gè)，二級(jí)種子21個(gè)。這是由于此分類方法很苛刻，提高了分類的要求。

5.3種子是個(gè)體植株的雛形，藥材質(zhì)量的優(yōu)劣、產(chǎn)量的高低與中藥材種子的質(zhì)量息息相關(guān)。種子商品處于整個(gè)中醫(yī)藥現(xiàn)代化產(chǎn)業(yè)鏈的上游，其質(zhì)量?jī)?yōu)劣的客觀評(píng)價(jià)直接影響后續(xù)產(chǎn)業(yè)鏈的進(jìn)行[7-10]。目前關(guān)于穿龍薯蕷種子的質(zhì)量等級(jí)劃分非常不清晰，很難對(duì)市售種子的質(zhì)量進(jìn)行有效的控制和評(píng)價(jià)，造成種子質(zhì)量良莠不齊，嚴(yán)重影響規(guī)范化生產(chǎn)成效[11-13]。因此，本研究在對(duì)不同產(chǎn)地穿龍薯蕷種子全面收集的基礎(chǔ)上對(duì)其質(zhì)量指標(biāo)系統(tǒng)測(cè)定和質(zhì)量分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行了研究，初步制定了穿龍薯蕷種子質(zhì)量分級(jí)方法，為規(guī)范和制定穿龍薯蕷種子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供依據(jù)，以期實(shí)現(xiàn)市售種子的規(guī)范化，從源頭控制穿龍薯蕷藥材的質(zhì)量。

各類文獻(xiàn)規(guī)范數(shù)據(jù)選項(xiàng)表

注：“√”為必備項(xiàng)，“0”為任選項(xiàng)，“*”為有則加項(xiàng)，“-”為不要求項(xiàng)。