趙 佩，劉志龍，高進(jìn)賢，石 磊，于 靜，葛 斌，袁繼勇

(甘肅省人民醫(yī)院1.藥劑科、2.麻醉科，甘肅 蘭州 730000)

潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis，UC)是一種慢性復(fù)發(fā)性潰瘍，臨床表現(xiàn)出慢性復(fù)發(fā)性、持續(xù)性及難治性的特點(diǎn)，病因及病理機(jī)制尚不十分明確。大量研究表明，腸腔內(nèi)各種抗原發(fā)生易位，并暴露于黏膜固有層的免疫系統(tǒng)，引起促炎細(xì)胞因子水平升高，抗炎細(xì)胞因子水平下降，導(dǎo)致級(jí)聯(lián)的免疫炎癥反應(yīng)與UC有關(guān)[1]。目前,針對(duì)UC的治療藥物主要包括抗炎藥、皮質(zhì)類固醇、生物制劑、免疫調(diào)節(jié)劑等，但長(zhǎng)期使用可產(chǎn)生腹瀉、腹部疼痛不適等不良反應(yīng)[2]，且這些治療方法并非對(duì)所有的UC患者均有效[3]。因此，治療UC的藥物開發(fā)依舊是研究熱點(diǎn)。鐵皮石斛為蘭科石斛屬草本植物，具有滋陰清熱、生津宜胃、潤(rùn)肺止咳等功效，現(xiàn)代藥理研究表明，鐵皮石斛具有抗炎、增強(qiáng)機(jī)體免疫功能、抗氧化、降血糖等廣泛的藥理作用[4]。本研究以鐵皮石斛的抗炎及調(diào)節(jié)免疫作為切入點(diǎn)，通過(guò)檢測(cè)鐵皮石斛對(duì)UC小鼠炎性反應(yīng)相關(guān)蛋白的影響，初次探討鐵皮石斛對(duì)UC小鼠的治療效應(yīng)和作用機(jī)制，為進(jìn)一步深入研究傳統(tǒng)中藥鐵皮石斛的藥用價(jià)值提供依據(jù)。

1 材料

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物健康SPF級(jí)BALB/c小鼠，♂，體質(zhì)量18～20 g，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供，合格證號(hào):SCXK(京)2016-0011。

1.2藥品與試劑鐵皮石斛購(gòu)于上海第一制藥公司(批號(hào):170122);5-氨基水楊酸(5-aminosalicylic acid，5-ASA)購(gòu)于上海愛(ài)的發(fā)制藥有限公司(批號(hào):160209)；葡聚糖硫酸鈉(dextran sodium sulfate，DSS),分子質(zhì)量為36 000～50 000，美國(guó)MP Biomedicals公司產(chǎn)品；γ-干擾素(interferon γ，INF-γ)、腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor α，TNF-α)試劑盒，購(gòu)于美國(guó)R&D公司(批號(hào)為E2000-1711-1、E2720-1710-3)；髓過(guò)氧化物酶(myeloperoxidase，MPO)抗體購(gòu)自英國(guó)Abcam公司(貨號(hào)：ab31419)。

1.3儀器Eyela N-1100旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(日本Rikakikai有限公司)；Labofuge400R低溫離心機(jī)(德國(guó)Heraeus公司)；實(shí)時(shí)定量PCR儀、電泳儀(美國(guó)Bio-Rad公司)； UV-5600紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(上海元析儀器有限公司)；MR-96A酶標(biāo)儀(深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司)。

2 方法

2.1鐵皮石斛提取物的制備根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道[5-6]，將鐵皮石斛在-80 ℃冷凍干燥成粉末，添加20倍質(zhì)量體積的甲醇，不斷攪拌過(guò)夜提取兩次。用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸發(fā)甲醇，并濃縮干燥提取物，最終得鐵皮石斛提取物浸膏粉末。

2.2模型的制備及給藥BALB/c ♂小鼠60只隨機(jī)分為6組，分別為正常組、DSS模型組、5-ASA(100 mg·kg-1)對(duì)照組、鐵皮石斛低、中、高劑量組(200、400、800 mg·kg-1)，每組10只，治療藥物劑量參考文獻(xiàn)報(bào)道[5-6]。適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，觀察無(wú)異常表現(xiàn)后再進(jìn)行實(shí)驗(yàn),實(shí)驗(yàn)前1 d，每組小鼠禁食不禁水24 h。參考文獻(xiàn)的造模方法，正常組自由飲用蒸餾水，其余各組自由飲用4% DSS溶液，連續(xù)7 d，誘導(dǎo)UC模型，d 8開始全部換成蒸餾水。造模d 1開始灌胃給藥，除正常組與模型組給予蒸餾水外，其余各組以0.02 mL·g-1體質(zhì)量給予相應(yīng)藥物，連續(xù)給藥10 d[7]。

2.3標(biāo)本采集及處理末次給藥后，小鼠禁食24 h后眼眶取血，以3 000 r·min-1離心15 min,分離血清，置-20 ℃冰箱保存。取血完畢后處死小鼠，采集小鼠結(jié)腸組織，稱重并測(cè)量長(zhǎng)度，沿腸系膜緣剪開腸腔，用生理鹽水沖洗腸內(nèi)容物，剪成2段，中性甲醛溶液內(nèi)固定，石蠟包埋進(jìn)行常規(guī)病理切片、HE染色及免疫組化染色。

2.4指標(biāo)檢測(cè)及方法

2.4.1外觀指標(biāo) 造模前后及給藥后，觀察小鼠的精神及活動(dòng)情況，記錄體質(zhì)量。按照Tab 1的標(biāo)準(zhǔn)，每天計(jì)算各組小鼠疾病活動(dòng)指數(shù) (disease activity index，DAI)評(píng)分[8]。DAI=(體質(zhì)量下降分?jǐn)?shù)+腹瀉分?jǐn)?shù)+便血分?jǐn)?shù))/3。

Tab 1 Criteria for disease activity index

a正常：成形大便；松散：不黏附于肛門的糊狀、半成形大便；腹瀉：可黏附于肛門的稀水樣便。

2.4.2病理學(xué)指標(biāo) HE染色的病理組織切片，按照周毅駿等[9]的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行評(píng)分，評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)見(jiàn)Tab 2。

2.4.3血清中細(xì)胞因子測(cè)定 ELISA法測(cè)定各組小鼠血清中IFN-γ、TNF-α含量。取提前分離并冷凍保存的血清，放置室溫，嚴(yán)格按照IFN-γ、TNF-α檢測(cè)試劑盒說(shuō)明操作。

2.4.4Real-time PCR測(cè)定小鼠遠(yuǎn)端結(jié)腸中IFN-γ、TNF-α mRNA的表達(dá) 剪取小鼠遠(yuǎn)端結(jié)腸組織約50 mg，用PBS沖洗，剪碎組織，加入500 μL TRIzol,研磨勻漿提總RNA,核酸微量定量?jī)x檢測(cè)RNA純度及濃度后，應(yīng)用反轉(zhuǎn)錄試劑盒(GoScriptTMReverse Tanscription System)將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，后用GoTaq qPCR Master Mix試劑盒進(jìn)行熒光實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)。IFN-γ、TNF-α和內(nèi)參β-actin的引物由上海生工生物工程有限公司設(shè)計(jì)、合成，引物序列見(jiàn)Tab 3。PCR的參數(shù)為:95 ℃預(yù)變性1 min，(95 ℃,10 s；60 ℃,20 s；72 ℃,20 s收集熒光)，共40個(gè)循環(huán)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果自動(dòng)以Ct值給出。相對(duì)表達(dá)量按照2-ΔΔCt方法進(jìn)行計(jì)算。反應(yīng)完畢后，65～95 ℃,0.5 ℃·s-1將擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物做熔解曲線分析。

Tab 2 Criteria for assessment of microscopic colon damage

Tab 3 Primer sequence

2.4.5Western blot檢測(cè)結(jié)腸組織中MPO的表達(dá) 剪取小鼠結(jié)腸組織約50 mg，用PBS沖洗，剪碎并加入含有蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液500 μL,研磨勻漿提取蛋白,經(jīng)BCA定量蛋白濃度后，進(jìn)行SDS-PAGE電泳,蛋白轉(zhuǎn)印至活化的PVDF膜上,5%脫脂牛奶中室溫封閉2 h，MPO抗體(1 ∶500)4 ℃孵育過(guò)夜, TBST洗滌3遍,每遍10 min,加入二抗(1 ∶5 000)室溫孵育1 h，TBST洗滌3遍,每遍10 min，滴加ECL進(jìn)行化學(xué)曝光，顯影、沖洗膠片并掃描分析，對(duì)目的條帶做灰度分析，以目的蛋白的灰度值比內(nèi)參GAPDH的灰度值校正誤差，比較蛋白表達(dá)情況。

3 結(jié)果

3.1鐵皮石斛提取物對(duì)UC小鼠體質(zhì)量、結(jié)腸長(zhǎng)度的影響與對(duì)照組相比，模型組小鼠在造模d 2出現(xiàn)皮毛無(wú)光澤、食量減少和體質(zhì)量減少的癥狀，d 3即出現(xiàn)不同程度的腹瀉、血便，這些癥狀此后不同程度加重。5-ASA和鐵皮石斛提取物治療組小鼠上述癥狀較模型對(duì)照組減輕，體質(zhì)量減輕趨勢(shì)較緩和，且鐵皮石斛提取物800 mg·kg-1治療組體質(zhì)量變化與模型對(duì)照組差異有顯著性(P<0.05)，見(jiàn)Fig 1A。處死小鼠后測(cè)量小鼠結(jié)腸長(zhǎng)度(Fig 1B),模型對(duì)照組小鼠結(jié)腸變短，與正常對(duì)照組小鼠相比差異有顯著性(P<0.05)，而5-ASA和鐵皮石斛提取物不同劑量組小鼠結(jié)腸均較模型對(duì)照組長(zhǎng)(P<0.05)。

Fig 1 Effects of D.officinale on body weight(A) and colon length(B) of ulcerative colitis

#P<0.05vsnormal group;*P<0.05vsmodel group

3.2DAI和病理學(xué)指標(biāo)評(píng)估實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，對(duì)照組小鼠精神較好，食量、活動(dòng)均無(wú)異常，皮毛有光澤，大便未出現(xiàn)血樣物。模型組小鼠在造模d 3后出現(xiàn)活動(dòng)度下降，進(jìn)食減少，部分小鼠出現(xiàn)稀便甚至腹瀉，肛周污穢黏膩，更嚴(yán)重的出現(xiàn)黏液膿血便，模型組小鼠DAI評(píng)分較正常對(duì)照組明顯升高(P<0.01)；鐵皮石斛提取物200、400 mg·kg-1組的小鼠給藥后較模型組一般情況有好轉(zhuǎn)，食量、活動(dòng)量均改善，但個(gè)別小鼠有腹瀉，伴有體質(zhì)量減輕，DAI評(píng)分與模型組比較降低(P<0.05)；鐵皮石斛提取物800 mg·kg-1組和5-ASA灌胃5 d后，小鼠活動(dòng)情況較模型組好轉(zhuǎn)，偶有小鼠大便松散，體質(zhì)量有所恢復(fù)，DAI評(píng)分較模型組明顯降低(P<0.01)，見(jiàn)Tab 4。

Fig 2、Tab 4結(jié)果顯示，鏡下觀察小鼠結(jié)腸組織，與正常小鼠結(jié)腸黏膜相比，模型組小鼠結(jié)腸黏膜有炎癥, 腸管增粗，黏膜層及漿肌層有大量中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞及漿細(xì)胞浸潤(rùn), 個(gè)別黏膜層明顯變薄。鐵皮石斛提取物高劑量組及5-ASA組鏡下小鼠結(jié)腸黏膜炎性浸潤(rùn)、肌層病變較模型組有明顯減輕，組織學(xué)損傷評(píng)分與模型組相比差異有顯著性(P<0.01)；鐵皮石斛提取物低、中劑量組與模型組小鼠相比，腸壁與周圍組織有較輕組織黏連，隱窩結(jié)構(gòu)基本完整，仍有部分炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，組織學(xué)損傷評(píng)分較模型組小鼠差異性較小(P<0.05)。

Fig 2 Effects of D.officinale on colon tissue damage of rats(HE, ×100)

A:Normal group;B: Model group; C:5-ASA group;D:D.officinale200 mg·kg-1group; E:D.officinale400 mg·kg-1group;F:D.officinale800 mg·kg-1group.

Tab 4 Scores of disease activity

##P<0.01vsnormal group;*P<0.05,**P<0.01vsmodel group

3.3鐵皮石斛提取物對(duì)小鼠血清IFN-γ、TNF-α含量的影響如Tab 5所示，正常對(duì)照組小鼠血清中IFN-γ、TNF-α的含量均較低，而模型組小鼠血清IFN-γ、TNF-α含量明顯增多(P<0.01，P<0.05)；5-ASA和鐵皮石斛提取物各劑量干預(yù)后，小鼠血清中IFN-γ、TNF-α含量均下降，IFN-γ含量減少明顯，與模型組相比，5-ASA和鐵皮石斛提取物中、高劑量組明顯降低血清IFN-γ含量(P<0.05)。TNF-α含量經(jīng)陽(yáng)性藥物治療后雖有下降，與模型組小鼠相比，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，其與鐵皮石斛提取物也未表現(xiàn)出劑量依賴性，400 mg·kg-1的鐵皮石斛提取物明顯降低血清TNF-α含量(P<0.05)。

Tab 5 Effects of D.officinale on concentrations of IFN-γ, TNF-α after oral administration in UC

#P<0.05,##P<0.01vsnormal group;*P<0.05vsmodel group

3.4鐵皮石斛提取物對(duì)小鼠遠(yuǎn)端結(jié)腸組織中IFN-γ、TNF-αmRNA表達(dá)的影響如Fig 3所示，經(jīng)過(guò)DSS誘導(dǎo)的UC小鼠遠(yuǎn)端結(jié)腸組織中IFN-γ、TNF- α mRNA的表達(dá)明顯高于正常小鼠(P<0.05)；經(jīng)過(guò)鐵皮石斛提取物的干預(yù)治療，IFN-γ、TNF-α mRNA的表達(dá)呈下降趨勢(shì)，其中，IFN-γ mRNA表達(dá)下降與鐵皮石斛劑量有相關(guān)性，中、高劑量效果明顯(P<0.05)。而陽(yáng)性藥物與鐵皮石斛提取物能夠抑制TNF-α mRNA的表達(dá)，但數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)差異無(wú)顯著性。表明鐵皮石斛能有效抑制UC小鼠結(jié)腸組織中促炎因子IFN-γ mRNA的表達(dá)，減輕結(jié)腸炎癥反應(yīng)。

Fig 3 Expression of IFN-γ, TNF-α mRNA by quantitative real-time n=10)

#P<0.05vsnormal group;*P<0.05vsmodel group

3.5鐵皮石斛提取物對(duì)小鼠結(jié)腸組織中MPO表達(dá)的影響如Fig 4所示，與正常組相比，模型組小鼠結(jié)腸組織中MPO蛋白表達(dá)明顯升高(P<0.05)；與模型組相比，5-ASA和鐵皮石斛干預(yù)各組，UC小鼠結(jié)腸組織中MPO蛋白表達(dá)明顯降低(P<0.05)，但并未呈現(xiàn)劑量相關(guān)性，中劑量的鐵皮石斛降低MPO蛋白表達(dá)效果較優(yōu)。

Fig 4 Protein expressions of MPO in colon

#P<0.05vsnormal group;*P<0.05vsmodel group

4 討論

近年來(lái)，UC在全球的患病率呈持續(xù)上升的趨勢(shì)。盡管UC的病因和病理生理學(xué)尚不完全清楚，異常免疫反應(yīng)在UC的發(fā)展中起著至關(guān)重要的作用[10]，它激活了結(jié)腸炎發(fā)病的標(biāo)志物活性氧/氮物質(zhì)(reactive oxygen species/reactive nitrogen species，ROS/RNS)生成系統(tǒng)，黏膜促炎性細(xì)胞因子(如IFN-γ、TNF-α、IL-1β、IL-6、COX-2等)過(guò)度產(chǎn)生，炎癥反應(yīng)逐級(jí)放大，促炎細(xì)胞因子與抗炎細(xì)胞因子之間的平衡失調(diào)，導(dǎo)致了結(jié)腸組織的損傷。

化學(xué)誘導(dǎo)劑DSS誘導(dǎo)的小鼠UC模型在臨床癥狀、組織學(xué)和微觀方面與人類UC相似，具有很好的結(jié)腸損傷及腸上皮屏障破壞的發(fā)病特征，適合篩選UC及炎癥性腸病(inflammatory bowel disease，IBD)潛在治療藥物[11]。我們以鐵皮石斛為目標(biāo)藥物，它主要有效成分是石斛多糖、石斛堿等，有報(bào)道鐵皮石斛具有抗炎、增強(qiáng)機(jī)體免疫功能的藥理活性，可促進(jìn)機(jī)體內(nèi)外抗炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生，并發(fā)揮調(diào)節(jié)免疫的作用[12]。結(jié)合鐵皮石斛的藥理活性和UC發(fā)病的異常免疫特點(diǎn)，本實(shí)驗(yàn)考察鐵皮石斛提取物對(duì)UC小鼠的治療作用。

實(shí)驗(yàn)研究顯示，鐵皮石斛提取物低、中、高劑量組對(duì)于UC臨床癥狀和腸道黏膜層顯示出了較好的保護(hù)和修復(fù)作用，腹瀉程度、疾病活動(dòng)指數(shù)、黏膜充血水腫程度、中性粒細(xì)胞及炎性細(xì)胞浸潤(rùn)、隱窩破壞程度均降低，提示鐵皮石斛提取物能降低炎癥的嚴(yán)重程度和范圍。在促炎因子中，IFN-γ、TNF-α是UC發(fā)病機(jī)制中的研究熱點(diǎn)，IFN-γ由NK細(xì)胞和Th1淋巴細(xì)胞產(chǎn)生，是典型的促炎因子，免疫調(diào)節(jié)活性強(qiáng)。而TNF-α作為腫瘤壞死因子家族的核心成員，是IBD中重要的調(diào)節(jié)因子，也是腸道上皮細(xì)胞增殖和凋亡的主要促炎因子，它也能激活中性粒細(xì)胞，誘導(dǎo)白三烯B4、O2、血小板激活因子等，導(dǎo)致UC患者腸黏膜微循環(huán)障礙。另外，TNF-α可增加粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子、內(nèi)皮細(xì)胞MHC1類抗原、IL-1、IL-8的分泌，并促進(jìn)中性粒細(xì)胞黏附內(nèi)皮細(xì)胞，刺激局部炎癥反應(yīng)。本研究結(jié)果表明，模型組中，血清促炎因子IFN-γ、TNF-α的表達(dá)明顯增高，與Abdin等[13]的報(bào)道一致，其表達(dá)與DAI和病理學(xué)組織評(píng)估結(jié)果相一致。且在基因表達(dá)水平，模型組TNF-α、IFN-γ mRNA表達(dá)明顯高于正常小鼠，經(jīng)過(guò)鐵皮石斛提取物的干預(yù)治療，表達(dá)明顯下降，治療作用呈現(xiàn)劑量-效應(yīng)關(guān)系。MPO是組織損傷和中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)的標(biāo)志，先前的研究[14-15]已經(jīng)證實(shí)，MPO的表達(dá)增高與中性粒細(xì)胞在腸上皮隱窩內(nèi)和腸黏膜層內(nèi)累積、浸潤(rùn)所導(dǎo)致的結(jié)腸上皮損傷密切相關(guān)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果中，鐵皮石斛提取物各劑量組結(jié)腸組織中MPO含量明顯低于模型組，說(shuō)明鐵皮石斛能減輕中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)，改善結(jié)腸炎癥程度，起到黏膜保護(hù)作用。鐵皮石斛提取物對(duì)UC小鼠血清和結(jié)腸組織中IFN-γ、TNF-α、MPO表達(dá)的調(diào)控提示，其機(jī)制可能與下調(diào)促炎因子有關(guān)，且TNF-α能啟動(dòng)NF-κB介導(dǎo)的反應(yīng)，是其有效激活物，因此，也可考慮涉及了抑制NF-κB信號(hào)通路。

總之，本研究在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中初步證實(shí)了鐵皮石斛提取物對(duì)DSS誘導(dǎo)的UC的治療作用，其可能的機(jī)制為減少血清促炎因子IFN-γ、TNF-α的釋放，下調(diào)促炎因子IFN-γ、TNF-α、MPO的表達(dá)，阻斷炎癥的放大效應(yīng)。關(guān)于鐵皮石斛治療UC的作用機(jī)制有待進(jìn)一步深入研究。

(致謝：本實(shí)驗(yàn)主要在蘭州大學(xué)第二醫(yī)院藥學(xué)部實(shí)驗(yàn)室及甘肅省人民醫(yī)院科研中心完成，感謝課題組成員在整個(gè)實(shí)驗(yàn)中所付出的勞動(dòng)。)