嚴培瑛，劉力寬，曾 陽，陳海娟，李美華，李錦萍

(青海師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,青海 西寧 810008)

糖尿病是以升高血糖為特征的代謝性疾病，由胰島素分泌缺陷或其生物作用受損引起，可引發(fā)多種并發(fā)癥[1-2]，主要分為1型糖尿病(type 1 diabetes mellitus，T1DM)和2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus，T2DM)。我國糖尿病以T2DM為主，病因和發(fā)病機制目前均不明確[3]，明顯特征是既有胰島素抵抗，又有胰島素分泌不足[4]。近年來，T2DM已成為威脅人類健康的常見疾病[5]。

金露梅(FruticosapotentillaL.)為薔薇科(Rosaceae)委陵菜屬(Potentilla)落葉灌木，廣泛分布于北溫帶地區(qū)，主要生于海拔1 000～4 500 m的林緣、水甸子、草原、草地及高山灌叢中[6]。前期研究發(fā)現(xiàn)，金露梅提取物對α-葡萄糖苷酶、α-淀粉酶和醛糖還原酶均具有抑制作用。本文研究金露梅95%甲醇提取乙酸乙酯萃取部位(MEE)對T2DM大鼠血糖變化的影響，以及對胰島素、抵抗素、瘦素、葡萄糖激酶(GK)和葡萄糖-6-磷酸酶(G-6-Pase)基因表達的影響，探究金露梅抗T2DM的作用機制。青藏高原地區(qū)金露梅資源十分豐富，目前還未有系統(tǒng)研究，民間相關(guān)資料記載金露梅有降糖、降脂的作用，本研究為后期金露梅的開發(fā)提供理論基礎(chǔ)。

1 材料

1.1實驗動物普通級SD大鼠，♂，體質(zhì)量(180±20)g，西安交通大學(xué)實驗動物中心提供，批號：SCSK(陜)2012-003。

1.2藥物與試劑金露梅原植物采自青海省大通達坂山(海拔3 006 m，37° 8' 42" N，101° 50' 32" E)，MEE提取分離參照文獻[6]。TRIzol購于Invitrogen Life Technologies；鏈脲佐菌素(STZ)，購于美國Sigma公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和熒光PCR試劑盒，購于大連寶生物工程公司；葡萄糖試劑盒，購于上海榮盛生物藥業(yè)公司。

1.3儀器XMARK全自動酶標儀、Thermal Cycler PCR擴增儀、IQ5熒光定量PCR儀，均購于Bio-Rad公司。

2 方法

2.1造模與給藥參照文獻[7]，進行造模與給藥。給藥劑量分別為MEE高劑量組(500 mg·kg-1)、MEE低劑量組(250 mg·kg-1)、鹽酸二甲雙胍陽性藥物組(75 mg·kg-1)、糖尿病模型組(等量水)和空白對照組(等量水)。

2.2血糖測定在給藥前、給藥7、14、21、28 d時，所有大鼠禁食不禁水12 h，經(jīng)尾靜脈采血，用葡萄糖試劑盒檢測大鼠的空腹血糖，結(jié)果以mmol·L-1表示。

2.3糖脂代謝關(guān)鍵酶和激素的表達量測定給藥28 d后，大鼠股動脈取血處死，剖開腹腔，取肝臟組織、胰腺組織、腎周脂肪組織各100 mg，放入冷生理鹽水中洗凈血污，用無菌吸水紙吸干水分，液氮冷凍。按試劑盒說明書操作，提取各組織總RNA，紫外分析檢測RNA純度、濃度和完整性。以O(shè)ligo dT為引物，按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書程序操作合成第一鏈cDNA。

2.4qRT-PCR反應(yīng)從NCBI獲得大鼠胰島素、抵抗素、瘦素、GK、G-6-Pase、GAPDH基因序列，截取基因序列中的CDS，采用Primer 3 Input 設(shè)計引物，并采用NCBI-BLAST檢驗引物特異性。引物序列和產(chǎn)物大小參照文獻[7]。qRT-PCR反應(yīng)采用試劑盒，在熒光定量PCR儀進行，反應(yīng)條件參照文獻[7]。選取GAPDH作為參照基因，采用2-ΔΔCt計算相對表達量[8]。

3 結(jié)果

3.1血糖變化如Tab 1所示，經(jīng)藥物治療14 d后，二甲雙 胍組、MEE高劑量組與模型組相比，空腹血糖值均有下降(P<0.05)，降糖率分別為15.63%、12.44%。治療21 d后，二甲雙胍組、MEE高、低劑量組與模型組相比，空腹血糖值均有明顯下降(P<0.01，P<0.05)，降糖率分別為24.38%、20.49%、19.67%。治療28 d后，二甲雙胍組、MEE高、低劑量組與模型組相比，空腹血糖值均有明顯下降(P<0.01)，降糖率分別為38.44%、34.71%、28.54%。表明MEE能明顯降低T2DM大鼠的血糖。

Tab 1 Effect of MEE on blood glucose of T2DM

##P<0.01vscontrol;*P<0.05,**P<0.01vsmodel

Tab 2 mRNA expression levels of rats in each experimental

##P<0.01vscontrol;*P<0.05,**P<0.01vsmodel

3.2糖脂代謝關(guān)鍵酶和激素基因表達結(jié)果如Tab 2所示，與模型組相比，二甲雙胍組和MEE高、低劑量組均能明顯上調(diào)胰島素基因表達(P<0.05)，明顯下調(diào)抵抗素和瘦素基因表達(P<0.01)，明顯提高GK基因表達(P<0.05)；與模型組相比，二甲雙胍組、MEE高劑量組能明顯下調(diào)G-6-Pase基因表達(P<0.01)，MEE低劑量組能明顯下調(diào)G-6-Pase基因表達(P<0.05)。

4 討論

在本研究中，用金露梅95%甲醇提取乙酸乙酯萃取部位治療后，T2DM大鼠餐后血糖明顯降低，抵抗素、瘦素水平均下調(diào)，葡萄糖激酶基因表達明顯上升，葡萄糖-6-磷酸酶基因表達明顯下降。表明金露梅95%甲醇提取乙酸乙酯萃取部位中可能存在某種成分，可以對胰島素、抵抗素、瘦素三者的相互作用產(chǎn)生影響，形成某種調(diào)節(jié)通路，且能調(diào)節(jié)GK、G-6-Pase的基因表達，從而調(diào)節(jié)T2DM中的某些脂代謝紊亂。綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)金露梅能夠有效降低T2DM大鼠餐后血糖，且能夠調(diào)節(jié)多種糖脂代謝相關(guān)激素的表達，部分恢復(fù)T2DM大鼠胰島素水平，以達到抵抗T2DM的目的。