南彩云，鐘國(guó)躍，朱繼孝，楊 雯，李輝虎，張風(fēng)波，張博文，李 敏

(江西中醫(yī)藥大學(xué)中藥資源與民族藥研究中心，江西 南昌 330004)

滇結(jié)香花為瑞香科結(jié)香屬植物滇結(jié)香[Edgeworthiagardneri(Wall.) Meisn.]的干燥花蕾，民間常用于青盲、翳障、多淚、羞明等眼部疾患[1]。課題組的前期研究表明，滇結(jié)香主要含有黃酮類(lèi)、香豆素類(lèi)、有機(jī)酸類(lèi)等化合物，其60%乙醇提取部位具有良好的抗四氯化碳(CCl4)誘導(dǎo)的小鼠肝損傷作用[2]，并從中分離得到了12個(gè)成分。研究發(fā)現(xiàn)[3-4]，西瑞香素具有較好的抗腫瘤作用，對(duì)二甲苯引起的小鼠耳廓腫脹及雞蛋清引起的大鼠足跖腫脹有較好的抑制作用。Nurgun等[5]研究表明，銀鍛苷對(duì)卡拉膠誘導(dǎo)的腳掌水腫，具有較強(qiáng)的抑制作用。Yan等[6]發(fā)現(xiàn)，結(jié)香苷C對(duì)于冰醋酸法致痛覺(jué)模型具有較強(qiáng)的鎮(zhèn)痛作用，但均未有關(guān)于肝保護(hù)作用方面的研究。本研究對(duì)分離得到的5種宏量化合物西瑞香素、水楊酸、結(jié)香苷C、銀鍛苷、紫云英苷進(jìn)行了小鼠體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，以探討滇結(jié)香保肝活性成分物質(zhì)及其可能的作用機(jī)制。

1 材料

1.1藥品與試劑聯(lián)苯雙酯滴丸，購(gòu)自浙江萬(wàn)邦藥業(yè)股份有限公司，批號(hào)：A02151219；西瑞香素、水楊酸標(biāo)準(zhǔn)品，購(gòu)自南京道斯夫生物科技有限公司；紫云英苷標(biāo)準(zhǔn)品，購(gòu)自成都德斯特生物技術(shù)有限公司；結(jié)香苷C、銀鍛苷均為實(shí)驗(yàn)室自制，純度達(dá)98%；谷丙轉(zhuǎn)氨酶(alanine aminotransferase,ALT，批號(hào)：20170614)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(aspartate aminotransferase, AST，批號(hào)：20170614)、丙二醛(malondialdehyde，MDA，批號(hào)：20170607)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD，批號(hào)：20170612)測(cè)定試劑盒，均購(gòu)自南京建成生物工程研究所；動(dòng)物組織總RNA提取試劑盒、D2000 DNA Marker(天根生化科技有限公司)；反轉(zhuǎn)錄試劑盒(批號(hào)：0000228426)、GelRedTM1000×in water(Promega公司)；Tap PCR Green Mix(北京鼎國(guó)生化有限公司)；TNF-α、IL-6、GAPDH引物，均由北京鼎國(guó)生化有限公司合成。

1.2儀器高速冷凍離心機(jī)(美國(guó)Beckman-Coulter公司)；Multiskan GO全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀(美國(guó)Thermo公司)；紫外分光光度計(jì)UV-1800(日本島津有限公司)；DY89-II電動(dòng)勻漿機(jī)(寧波新芝生物科技股份有限公司)；凝膠成像儀(美國(guó)Bio-Rad公司)；TKY-BMB型石蠟包埋機(jī)、包埋專(zhuān)用冷臺(tái)(湖北省泰康醫(yī)療設(shè)備有限公司)；半自動(dòng)輪轉(zhuǎn)式切片機(jī) RM2245(北京長(zhǎng)恒榮創(chuàng)科技有限公司)；XI15正置顯微鏡(日本奧林巴斯有限公司)。

1.3實(shí)驗(yàn)動(dòng)物130只昆明種成年♂小鼠，SPF級(jí)，購(gòu)自湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，許可證號(hào)：SCXK(湘)2016-0002。實(shí)驗(yàn)室溫度(24±2)℃，相對(duì)濕度(50±2)%。

2 方法

2.1小鼠分組及給藥130只小鼠(20～30 g)隨機(jī)分成13組，每組10只。分別為空白對(duì)照組、模型組、聯(lián)苯雙酯組(陽(yáng)性對(duì)照組)、紫云英苷低、高劑量組(ZL、ZH)，西瑞香素低、高劑量組(XL、XH)，結(jié)香苷C低、高劑量組(JL、JH)，水楊酸低、高劑量組(SL、SH)，銀鍛苷低、高劑量組(YL、YH)。參考文獻(xiàn)[7]并結(jié)合預(yù)實(shí)驗(yàn)，確定各個(gè)給藥組低、高劑量組給藥劑量為50、100 mg·kg-1，聯(lián)苯雙酯組的劑量為150 mg·kg-1。各個(gè)藥物分別混懸于0.5%的羧甲基纖維素鈉溶液中，連續(xù)給藥7 d，空白對(duì)照組和模型組給予相應(yīng)體積的生理鹽水。

2.2模型建立以CCl4誘導(dǎo)小鼠急性肝損傷模型。d 6給藥1 h后，腹腔注射0.2% CCl4花生油溶液10 mL·kg-1?？瞻讓?duì)照組給予相應(yīng)體積的花生油。造模后，禁食不禁水，16 h后給藥1次，1 h后眼眶取血，全血5 000 r·min-1、4 ℃離心10 min，取血清置于4 ℃冰箱備用。小鼠斷頸脫臼處死，并于冰臺(tái)快速分離相同部位肝臟組織2份，其中一份10%甲醛固定，另一份取出后置于-70 ℃冰箱備用[8]。

2.3生化指標(biāo)的測(cè)定將離心后的血清取出，用酶標(biāo)儀按試劑盒測(cè)定ALT、AST等指標(biāo)。取左葉肝臟組織0.1 g，以生理鹽水為溶劑，制備成10%的肝組織勻漿，3 000 r·min-1離心10 min，取上清液，采用測(cè)試盒比色皿法，分別測(cè)定SOD、MDA的含量。

2.4肝組織病理學(xué)檢測(cè)取10%甲醛固定好的肝臟大葉，常規(guī)石蠟包埋、切片、HE染色，并于光鏡下觀察拍照。

2.5肝組織TNF-α、IL-6mRNA表達(dá)的檢測(cè)每組取15 mg左右肝組織樣品，共13組，按照RNA動(dòng)物組織提取試劑盒說(shuō)明書(shū)提取肝組織總RNA，1.2%瓊脂糖凝膠電泳鑒定RNA純度。取4 μL總RNA，進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，合成cDNA。所用引物序列信息[9-11]見(jiàn)Tab 1。PCR反應(yīng)體系總體積為50 μL，GAPDH基因PCR擴(kuò)增條件為94 ℃預(yù)變性3 min，94 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，循環(huán)28次，72 ℃終止10 min；TNF-α基因PCR擴(kuò)增條件為94 ℃預(yù)變性3 min，94 ℃變性45 s，60 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，循環(huán)34次，72 ℃終止10 min；IL-6基因PCR擴(kuò)增條件為94 ℃預(yù)變性3 min，94 ℃變性45 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，循環(huán)35次，72 ℃終止7 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳及Biotium GelRed染液染色，凝膠影像分析儀分析，以GAPDH為內(nèi)參對(duì)照，目的mRNA與GAPDH的RT-PCR產(chǎn)物的吸光度值比值作為目的mRNA相對(duì)表達(dá)量。

3 結(jié)果

3.1對(duì)CCl4肝損傷小鼠肝勻漿SOD、MDA活性及血清ALT、AST水平的影響Tab 2結(jié)果顯示，與空白對(duì)照組相比，小鼠肝組織勻漿中SOD含量明顯降低，MDA含量明顯上升，小鼠血清中ALT、AST水平明顯增高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，表明造模成功。與模型組相比較，各給藥組小鼠肝組織勻漿中SOD含量明顯升高，MDA含量明顯降低(P<0.01，P<0.05)；縱向比較血清中生化指標(biāo)，ZH、SH、JL、JH、XH、YH各給藥組ALT水平均有明顯降低，差異具有顯著性(P<0.01，P<0.05)，ZL、SL、XL、YL給藥組ALT水平雖有所降低，但差異無(wú)顯著性(P>0.05)，ZH、SH、JL、JH、XL、XH、YH各給藥組的AST含量明顯降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01，P<0.05)，ZL、SL、YL給藥組AST含量雖有所降低，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

3.2肝臟組織病理學(xué)變化如Fig 1所示，正常組肝小葉結(jié)構(gòu)完整，肝細(xì)胞形態(tài)正常，肝細(xì)胞索排列整齊，細(xì)胞連接緊密；模型組肝細(xì)胞水腫，肝細(xì)胞彌漫性變性，肝竇變窄，有大量的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，甚至出現(xiàn)細(xì)胞壞死；陽(yáng)性對(duì)照組肝細(xì)胞與模型組相比較，細(xì)胞狀況明顯改善，少量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；ZH、SH、JL、JH、XH、YH各給藥組肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)有明顯改善,肝細(xì)胞脂肪變性明顯減輕,炎性細(xì)胞浸潤(rùn)、壞死程度明顯減輕，受損面積明顯變小；ZL、SL、XL、YL給藥組肝細(xì)胞肝索排列紊亂，肝小葉可見(jiàn)大量肝細(xì)胞壞死,細(xì)胞膜溶解消失或碎裂，細(xì)胞核有明顯聚集現(xiàn)象，與模型組對(duì)比，無(wú)明顯改善。

Tab 1 Information of PCR primers

Tab 2 Effects of different compounds on activity of SOD, MDA and levels of serum ALT, AST on carbon tetrachloride-induced liver injury in

*P<0.05,**P<0.01vsnormal;#P<0.05,##P<0.01vsmodel

Fig 1 Effects of different compounds on carbon tetrachloride-induced liver injury tissue in mice(HE, ×200)

3.3對(duì)肝組織TNF-α、IL-6mRNA表達(dá)的影響如Fig 2所示，CCl4引起的小鼠急性肝損傷使TNF-α、IL-6 mRNA的表達(dá)明顯增加，亦能表明實(shí)驗(yàn)造模成功。各不同單體化合物及不同給藥劑量組對(duì)TNF-α、IL-6 mRNA的表達(dá)結(jié)果顯示： 除ZL給藥組外，其他給藥組均可明顯抑制TNF-α mRNA的表達(dá)，而且JL、JH、ZH組的抑制作用與陽(yáng)性對(duì)照組作用相當(dāng)；不同給藥組中，除YL、ZL、XL組外，其他給藥組均可明顯抑制IL-6 mRNA表達(dá)，且JL、JH、ZH、XH給藥組與陽(yáng)性對(duì)照組比較，差異無(wú)顯著性。

4 討論

CCl4是經(jīng)典的誘導(dǎo)肝損傷動(dòng)物模型的化學(xué)物質(zhì)，該動(dòng)物模型具有指標(biāo)明確、重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)。其誘導(dǎo)機(jī)制主要為當(dāng)肝臟受到損傷時(shí)，肝細(xì)胞內(nèi)酶大量釋放到血液，導(dǎo)致血內(nèi)ALT、AST等酶含量明顯升高，故血清中ALT、AST的含量高低可在一定程度上反映出肝細(xì)胞損傷程度。CCl4進(jìn)入體內(nèi)經(jīng)肝微粒體細(xì)胞色素P450代謝，可引起脂質(zhì)過(guò)氧化作用，并形成脂質(zhì)過(guò)氧化物MDA，SOD作為機(jī)體內(nèi)天然存在的超氧自由基清除因子之一，可有效清除由CCl4作用產(chǎn)生的自由基，MDA、SOD的含量高低可反映肝細(xì)胞的修復(fù)程度[12]。本研究采用小鼠CCl4肝損傷經(jīng)典模型，試劑盒測(cè)定血清中ALT、AST含量及肝勻漿中MDA、SOD的含量，對(duì)5種成分進(jìn)行了保肝活性評(píng)價(jià)。結(jié)果表明，與模型組比較，ZH、SH、JL、JH、XH組血清中ALT、AST水平明顯降低，結(jié)合各個(gè)給藥組病理切片，說(shuō)明該5組給藥組能增強(qiáng)肝細(xì)胞抗損傷能力，增加膜結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性，對(duì)肝臟有一定的保護(hù)作用。肝組織中MDA含量降低，SOD含量升高，提示該5組實(shí)驗(yàn)組具有增強(qiáng)肝臟抗氧化能力、減少脂質(zhì)過(guò)氧化物生成的作用。其中，結(jié)香苷C(JL、JH)給藥組與陽(yáng)性對(duì)照組實(shí)驗(yàn)效果相近，作用最佳，可能為滇結(jié)香保肝作用的主要有效成分之一。

Fig 2 Effect of different compounds on expressions of TNF-α, IL-6 mRNA in mouse

1:Normal; 2: Model; 3: Positive; 4: YL; 5: YH; 6: ZL; 7: ZH; 8: SL; 9: SH; 10: JL; 11: JH; 12: XL; 13: XH.**P<0.01vsnormal;#P<0.05,##P<0.01vsmodel.

本研究從分子水平對(duì)5種成分的保肝活性及其作用機(jī)制進(jìn)行了探討。觀察TNF-α、IL-6 mRNA的表達(dá)水平，探究各成分的肝保護(hù)作用及其可能的作用機(jī)制。TNF-α是一種主要由單核巨噬細(xì)胞分泌的具有多種生物活性的多肽調(diào)節(jié)因子。CCl4可激活枯否氏細(xì)胞產(chǎn)生TNF-α等促炎細(xì)胞因子，這些炎性介質(zhì)的釋放可活化中性粒細(xì)胞，通過(guò)自分泌或旁分泌作用，激活免疫細(xì)胞和炎性反應(yīng)信號(hào)通道[13]，誘導(dǎo)其他炎性因子如IL-6 mRNA的表達(dá)，進(jìn)一步產(chǎn)生氧自由基，加重炎性反應(yīng)[14]。IL-6是白介素家族的成員，由巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞及淋巴細(xì)胞等炎癥細(xì)胞產(chǎn)生的促炎癥細(xì)胞因子[15]，可使T、B細(xì)胞及NK細(xì)胞廣泛激活，誘導(dǎo)其他炎性介質(zhì)的產(chǎn)生，從而加劇和促進(jìn)局部炎癥的形成。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，CCl4能明顯促進(jìn)TNF-α、IL-6 mRNA的表達(dá)，結(jié)合組織病理切片及血清、血漿指標(biāo)，與模型組比較，表明ZH、SH、JL、JH、XH、YH組可有效抑制TNF-α、IL-6 mRNA的表達(dá)，降低血清、血漿中TNF-α和IL-6的含量，且JL、JH、YH給藥組具有下調(diào)TNF-α、IL-6 mRNA表達(dá)的作用，與陽(yáng)性對(duì)照組相比較，差異無(wú)顯著性，表明其可能是通過(guò)調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能而降低CCl4引起的肝損傷。

綜上，ZH、SH、JL、JH、XH、YH給藥組可降低肝勻漿中MDA的含量，提高SOD的生物活性，降低血清中ALT、AST的含量，以及抑制肝組織中TNF-α mRNA和IL-6 mRNA的表達(dá)，可能是通過(guò)調(diào)節(jié)小鼠的免疫功能，增強(qiáng)肝臟抗氧化能力，減少脂質(zhì)過(guò)氧化物生成，從而達(dá)到緩解、降低小鼠肝損傷的效果。前期研究表明，滇結(jié)香60%乙醇提取部位對(duì)CCl4致急性肝損傷小鼠具有較好的保肝作用，其降A(chǔ)LT、AST作用優(yōu)于陽(yáng)性對(duì)照聯(lián)苯雙酯組[3]。本次實(shí)驗(yàn)中所考察的單體藥物均來(lái)自于該部位，結(jié)果顯示，ZH、SH、JL、JH、XH、YH給藥組均具有良好的保肝作用，但降A(chǔ)LT、AST作用均弱于60%乙醇提取部位，提示該部位中可能還存在保肝活性更強(qiáng)的微量成分，或各成分之間存在協(xié)同作用，還有待進(jìn)一步研究。