林志強(qiáng) 唐學(xué)義 劉洪洲 仝蘭芝

(1濮陽(yáng)市人民醫(yī)院呼吸內(nèi)科，河南 濮陽(yáng) 457000；2河南省人民醫(yī)院呼吸內(nèi)科；3濮陽(yáng)市中醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科)

肺癌的發(fā)生是包含抑癌基因失活和癌基因激活在內(nèi)的多基因、多階段的復(fù)雜過(guò)程，尋找與肺癌發(fā)生發(fā)展相關(guān)的基因，并研究其分子機(jī)制，對(duì)于肺癌的靶向治療具有重要意義。腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子(TRAF)4定位于17q11-12，多種人類(lèi)癌癥中已發(fā)現(xiàn)TRAF4過(guò)表達(dá)，如乳腺癌、膀胱癌、卵巢癌等〔1～3〕。有研究發(fā)現(xiàn)，抑制TRAF4表達(dá)可降低肺癌細(xì)胞增殖〔4〕，但關(guān)于TRAF4對(duì)肺癌生物學(xué)特性的影響尚不完全清楚。替莫唑胺是一種新一代的口服烷化劑，不僅作為復(fù)發(fā)腦膠質(zhì)瘤治療藥物，在肺癌的治療中也得到廣泛應(yīng)用。研究發(fā)現(xiàn)，單獨(dú)使用替莫唑胺可延長(zhǎng)肺癌患者的生存期，增加化療敏感性〔5〕；也有研究發(fā)現(xiàn)替莫唑胺可抑制肺癌細(xì)胞活力，阻滯細(xì)胞周期〔6〕。目前關(guān)于TRAF4是否可增加肺癌替莫唑胺化療敏感性尚不清楚。因此，本研究通過(guò)RNA干擾(RNAi)技術(shù)沉默肺癌細(xì)胞TRAF4表達(dá)，探討抑制TRAF4表達(dá)后替莫唑胺單獨(dú)及共同處理對(duì)肺癌細(xì)胞增殖及凋亡的影響及其可能的分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1細(xì)胞及主要試劑和儀器 人胚肺成纖維細(xì)胞MRC5及肺癌SPC-A-1、A549、H322、H1299細(xì)胞均購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)；替莫唑胺購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究所(批號(hào)：100639-201302，純度為99.6%)；胎牛血清、RPMI1640培養(yǎng)基均購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；熒光定量試劑盒及反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自日本Takara；CCK8細(xì)胞增殖試劑盒、二喹啉甲酸(BCA)試劑盒、膜聯(lián)蛋白V-FITC(Annexin V-FITC)/碘化丙錠(PI)細(xì)胞凋亡試劑盒均購(gòu)自碧云天生物技術(shù)研究所；含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(Caspase)-3、Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bax)、Notch1、Hes1抗體購(gòu)自美國(guó)Abcam公司；酶標(biāo)儀購(gòu)自美國(guó)Bio Tek公司；流式細(xì)胞儀購(gòu)自美國(guó)BD公司。

1.2TRAF4在肺癌細(xì)胞中的表達(dá) MRC5、SPC-A-1、A549、H322、H1299細(xì)胞在37℃、體積分?jǐn)?shù)為5%CO2的飽和濕度條件下用含10%胎牛血清的PRMI1640培養(yǎng)基培養(yǎng)。通過(guò)RT-PCR方法檢測(cè)各細(xì)胞中TRAF4 mRNA表達(dá)，步驟如下：通過(guò)Trizol法提取各細(xì)胞中的總RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，以cDNA為模板的反應(yīng)體系為20 μl，應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增。引物均由上海生工合成，TRAF4的引物序列，前向：5'-CTGGACATTTGATCATGCAG-3'，反向：5'-ATTTGATCCAATAGTTGCTCGA-3'。內(nèi)參GA-PDH 的引物，反向：5'-GTCACCAGGGCTGCTTTTAA-CTC-3'，反向：5'- CAGCATCGCCCCACTTGATTTTG-3'。采用2-△△Ct比較法，根據(jù)Ct均值對(duì)TRAF4 mRNA相對(duì)含量進(jìn)行定量分析。

1.3A549細(xì)胞分組及TRAF4的siRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞 A549細(xì)胞分為空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組、TRAF4-siRNA組、替莫唑胺(200 μmol/L替莫唑胺處理細(xì)胞)和TRAF4-siRNA+替莫唑胺組，TRAF4的siRNA轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞參照脂質(zhì)體LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染說(shuō)明，轉(zhuǎn)染前1 d以2×105/ml接種細(xì)胞于6孔板，每孔2 ml，細(xì)胞生長(zhǎng)達(dá)到80%～90%匯合度時(shí)轉(zhuǎn)染。培養(yǎng)48 h，收集細(xì)胞，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.4TRAF4的siRNA轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞效果檢測(cè) 通過(guò)RT-PCR及Western印跡檢測(cè)TRAF4的siRNA轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞效果。RT-PCR方法參照1.2。Western印跡檢測(cè)步驟：細(xì)胞中加入適量的細(xì)胞裂解液提取細(xì)胞中總蛋白，BCA法定量蛋白，每泳道加入50 μg總蛋白進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離，半干法轉(zhuǎn)硝酸纖維素膜，5%脫脂奶粉封閉2 h，4℃孵育一抗過(guò)夜，TRAF4及內(nèi)參GAPDH抗體分別按照1∶500和1∶1 000稀釋?zhuān)茨?，加入二抗，二抗為辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記的羊抗兔(1∶2 000稀釋)，室溫孵育1 h，洗膜，化學(xué)發(fā)光法在紫外凝膠成像儀上進(jìn)行拍照分析。

1.5CCK8法檢測(cè)各組細(xì)胞活力 將100 μl生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期的A549細(xì)胞接種至96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每組細(xì)胞設(shè)置5個(gè)重復(fù)孔，并設(shè)置空白對(duì)照孔，置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后按照1.3分組處理細(xì)胞，繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞48 h，每孔加入10 μl的CCK8溶液，37℃孵育4 h。空白對(duì)照孔調(diào)零，酶標(biāo)儀測(cè)定570 nm波長(zhǎng)各組的吸光度值(OD)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。以O(shè)D值反映細(xì)胞活力，可間接反映細(xì)胞的增殖能力。

1.6Annexin V-FITC/PI雙染法檢測(cè)細(xì)胞凋亡 磷酸緩沖液洗滌各組細(xì)胞，0.25%胰蛋白酶消化細(xì)胞，離心后收集細(xì)胞，采用Annexin V-FITC/PI細(xì)胞凋亡試劑盒進(jìn)行染色，1 h內(nèi)上流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組細(xì)胞的凋亡情況。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.7Caspase-3、Bax、Notch1、Hes1蛋白表達(dá)檢測(cè) 凋亡蛋白Caspase-3、Bax及Notch1和Hes1蛋白表達(dá)參照1.4方法檢測(cè)。

1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS21.0軟件，計(jì)量資料多組差異比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1肺癌細(xì)胞TRAF4的表達(dá) 人胚肺成纖維細(xì)胞MRC5及肺癌SPC-A-1、A549、H322、H1299細(xì)胞中TRAF4 mRNA表達(dá)分別為1、(4.557±0.423)、(5.001±0.462)、(3.889±0.387)、(4.002±0.402)，TRAF4在4個(gè)肺癌細(xì)胞中的表達(dá)均顯著高于在MRC5細(xì)胞中的表達(dá)(P<0.05)。

2.2TRAF4的siRNA轉(zhuǎn)染肺癌A549細(xì)胞的效果 陰性對(duì)照組TRAF4的mRNA及蛋白表達(dá)與空白對(duì)照組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，而TRAF4-siRNA組TRAF4的mRNA及蛋白表達(dá)均顯著低于空白對(duì)照組(P<0.05)。見(jiàn)圖1，表1。

圖1 Western印跡檢測(cè)TRAF4 siRNA 轉(zhuǎn)染后肺癌A549細(xì)胞TRAF4蛋白表達(dá)

組別TRAF4 mRNATRAF4蛋白空白對(duì)照組10.765±0.076陰性對(duì)照組0.982±0.0730.718±0.071TRAF4-siRNA組0.421±0.0521)0.121±0.0151)F/P值121.428/0.000105.056/0.000

與空白對(duì)照組比較：1)P<0.05

2.3TRAF4的siRNA轉(zhuǎn)染增強(qiáng)替莫唑胺對(duì)肺癌A549細(xì)胞活力的抑制作用 TRAF4-siRNA組(0.394±0.045)和替莫唑胺組(0.351±0.040)OD值均顯著低于空白對(duì)照組(0.587±0.067，均P<0.05)，高于TRAF4-siRNA+替莫唑胺組(0.226±0.032，均P<0.05)。

2.4TRAF4的siRNA轉(zhuǎn)染增強(qiáng)替莫唑胺對(duì)肺癌A549細(xì)胞凋亡的促進(jìn)作用 與空白對(duì)照組〔(2.67±0.45)%〕比較，TRAF4-siRNA組〔(7.86±0.75)%〕和替莫唑胺組細(xì)胞凋亡率〔(11.23±0.94)%〕均顯著升高(均P<0.05)，而TRAF4-siRNA+替莫唑胺組細(xì)胞凋亡率〔(15.02±1.12)%〕顯著高于TRAF4-siRNA組和替莫唑胺組(均P<0.05)。

2.5各組細(xì)胞中Caspase-3、Bax、Notch1、Hes1蛋白表達(dá)檢測(cè)結(jié)果 TRAF4-siRNA組和替莫唑胺組Caspase-3和Bax的表達(dá)均顯著高于空白對(duì)照組(均P<0.05)，Notch1和Hes1表達(dá)顯著低于空白對(duì)照組(均P<0.05)，TRAF4-siRNA+替莫唑胺組Caspase-3和Bax的表達(dá)顯著高于TRAF4-siRNA組和替莫唑胺組(P<0.05)，Notch1和Hes1表達(dá)顯著低于TRAF4-siRNA組和替莫唑胺組(P<0.05)。見(jiàn)圖2，表2。

1：空白對(duì)照組；2：TRAF4-siRNA組；3：替莫唑胺組；4：TRAF4-siRNA+替莫唑胺組圖2 各組細(xì)胞中Caspase-3、Bax、Notch1、Hes1的蛋白表達(dá)

組別Caspase-3BaxNotch1Hes1空白對(duì)照組0.103±0.0110.116±0.0140.582±0.0680.315±0.039TRAF4-siRNA組0.171±0.0181)2)0.215±0.0251)2)0.322±0.0371)2)0.214±0.0271)2)替莫唑胺組0.206±0.0231)2)0.362±0.0421)2)0.203±0.0281)2)0.195±0.0211)2)TRAF4-siRNA+替莫唑胺組0.421±0.0450.568±0.0650.110±0.0130.106±0.012F/P值75.461/0.00068.029/0.00072.240/0.00031.121/0.000

與空白對(duì)照組比較:1)P<0.05；與TRAF4-siRNA+替莫唑胺組比較:2)P<0.05

3 討 論

研究發(fā)現(xiàn)，包括肺癌在內(nèi)的腫瘤中出現(xiàn)抑癌基因表達(dá)降低或缺失、癌基因表達(dá)升高等變化；且隨著腫瘤惡性程度變化，基因的表達(dá)量升高或降低〔7〕。這提示在肺癌治療中可采用分子靶向治療途徑。TRAF是重要的一類(lèi)胞質(zhì)銜接蛋白，主要參與腫瘤壞死因子受體(TNFR)家族的信號(hào)傳導(dǎo)。TRAF4是TNFR家族中參與腫瘤調(diào)控的因子之一，在多種腫瘤中出現(xiàn)過(guò)表達(dá)。有研究發(fā)現(xiàn)，TRAF4可通過(guò)調(diào)控Wnt信號(hào)，增強(qiáng)口腔鱗狀細(xì)胞癌的生長(zhǎng)、遷移和侵襲能力〔8〕；食管癌中通過(guò)RNA干擾靶向抑制TRAF4表達(dá)可降低癌細(xì)胞的增殖、誘導(dǎo)凋亡，并阻滯細(xì)胞周期〔9〕。TRAF4對(duì)肺癌影響的研究不多，有研究發(fā)現(xiàn)，miR-615-5p可通過(guò)靶定TRAF4，下調(diào)TRAF4表達(dá)而抑制非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞增殖〔10〕；在異種移植小鼠模型中，敲除TRAF4表達(dá)可降低肺癌的惡性表型〔11〕。這提示TRAF4可能是肺癌發(fā)生發(fā)展中的一個(gè)促進(jìn)因子。

替莫唑胺為一種化療藥物，可影響肺癌、乳腺癌、肝癌等腫瘤的發(fā)生發(fā)展〔12,13〕。RNA干擾是近些年發(fā)展起來(lái)的能夠特異性和高效性地使體內(nèi)特定基因表達(dá)阻斷的技術(shù)，目前已廣泛應(yīng)用〔14,15〕。本研究發(fā)現(xiàn)TRAF4的表達(dá)抑制及替莫唑胺均可降低肺癌細(xì)胞活力，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，兩者聯(lián)合使用效果更強(qiáng)。Caspase-3是Caspase家族的凋亡效應(yīng)子，位于Caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)的下游，可被上游的始動(dòng)子激活，Caspase-3的激活可引起細(xì)胞發(fā)生凋亡〔16〕。有研究發(fā)現(xiàn)，肺癌中Caspase-3表達(dá)降低，上調(diào)其表達(dá)可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡〔17〕。Bax是Bcl-2家族的促凋亡基因，大多數(shù)肺腫瘤細(xì)胞株中Bax表達(dá)高于正常細(xì)胞，肺癌細(xì)胞中Bax的高表達(dá)可激活Caspase，抑制細(xì)胞增殖及誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡〔18,19〕。Notch1信號(hào)通路進(jìn)化保守，在細(xì)胞的增殖、分化、凋亡、發(fā)育等過(guò)程中發(fā)揮重要作用，其異常表達(dá)與多種腫瘤發(fā)生有關(guān)〔20〕。Notch1的表達(dá)與肺癌的發(fā)生發(fā)展、轉(zhuǎn)移和浸潤(rùn)有關(guān)，抑制其表達(dá)可降低肺癌的發(fā)生發(fā)展〔21〕。本研究發(fā)現(xiàn)，TRAF4的表達(dá)抑制及替莫唑胺均可上調(diào)Caspase-3和Bax表達(dá)，下調(diào)Notch1及下游重要靶基因Hes1表達(dá)，而兩者聯(lián)合使用效果更優(yōu)。

綜上所述，抑制肺癌細(xì)胞TRAF4表達(dá)可通過(guò)下調(diào)Notch1信號(hào)通路降低癌細(xì)胞活力及誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，并可增強(qiáng)替莫唑胺化療敏感性；其中細(xì)胞凋亡的調(diào)控方式是上調(diào)Caspase-3和Bax表達(dá)。TRAF4可能是肺癌分子治療的有效靶點(diǎn)，但鑒于TRAF4在肺癌中的研究較少，且本研究也只對(duì)細(xì)胞的增殖及凋亡情況進(jìn)行檢測(cè)，因此還需更多的實(shí)驗(yàn)研究及臨床研究證實(shí)。