趙寧，王玉川，易萍，閆巧娟，江正強(qiáng)*

1(中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與營(yíng)養(yǎng)工程學(xué)院，北京，100083)2(中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué) 工學(xué)院，北京，100083)

α-淀粉酶廣泛應(yīng)用于食品、飼料、造紙等工業(yè)中，在整個(gè)酶制劑市場(chǎng)中約占25%份額[1]。微生物是α-淀粉酶的主要來(lái)源，其中產(chǎn)α-淀粉酶的細(xì)菌主要是芽孢桿菌屬微生物[2]，真菌主要是曲霉和青霉屬[3]，此外還有一些嗜熱真菌產(chǎn)α-淀粉酶，如Scytalidiumthermophilum[4]和Thermomyceslanuginosus[5]。細(xì)菌α-淀粉酶的最適溫度和最適pH分布廣泛，真菌α-淀粉酶的作用條件較溫和，最適溫度一般在50～60 ℃，最適pH一般在5.0～6.0[3]。HAN等[6]研究了嗜熱真菌樟絨枝霉(Malbrancheacinnamomea)產(chǎn)α-淀粉酶的產(chǎn)酶條件、純化及性質(zhì)，但產(chǎn)酶水平低，無(wú)法工業(yè)生產(chǎn)應(yīng)用。

構(gòu)建工程菌株是實(shí)現(xiàn)外源基因高效表達(dá)的有效途徑，巴斯德畢赤酵母作為較完善的真核表達(dá)系統(tǒng)，目前，已有多種來(lái)源α-淀粉酶在畢赤酵母中高效表達(dá)。WANG等[7]將地衣芽孢桿菌(Bacilluslicheniformis)α-淀粉酶在畢赤酵母高效表達(dá)，經(jīng)5 L發(fā)酵罐分批補(bǔ)料發(fā)酵168 h，α-淀粉酶產(chǎn)量為8.3 mg/mL，在 50 L發(fā)酵罐中α-淀粉酶產(chǎn)量為12.2 mg/mL；PARASHAR等[8]克隆來(lái)源于Bacillusacidicola和Geobacillusthermoleovorans嵌合的α-淀粉酶基因，成功表達(dá)于畢赤酵母，在7 L發(fā)酵罐中發(fā)酵，最終α-淀粉酶表達(dá)量為0.120 mg/mL，比酶活為1 180 U/mg(DNS法，每分鐘反應(yīng)產(chǎn)生1 μmol麥芽糖定義為1個(gè)酶活單位)?？梢钥闯靓?淀粉酶在畢赤酵母中高效表達(dá)具有較大應(yīng)用潛力，但是目前關(guān)于嗜熱真菌α-淀粉酶在畢赤酵母中表達(dá)的報(bào)道較少，僅有Rhizomucorpusillus來(lái)源α-淀粉酶。ZHANG等[9]將Rhizomucorpusillus來(lái)源α-淀粉酶和糖化酶在畢赤酵母共表達(dá)，與單一表達(dá)糖化酶相比，共表達(dá)淀粉酶的糖化活力提高了79%。

在麥芽糖漿的工業(yè)生產(chǎn)中，淀粉需經(jīng)液化和糖化兩個(gè)步驟，液化主要采用耐高溫α-淀粉酶，糖化采用β-淀粉酶、真菌α-淀粉酶等糖化酶。真菌α-淀粉酶作為生產(chǎn)麥芽糖漿的關(guān)鍵酶之一，已廣泛應(yīng)運(yùn)于生產(chǎn)，如以大米淀粉為原料，經(jīng)真菌α-淀粉酶水解制備得麥芽糖含量為45.18%的麥芽糖漿[10]。為制備高麥芽糖漿，常將α-淀粉酶與普魯蘭酶、β-淀粉酶等復(fù)配，亢潘潘[11]等將真菌α-淀粉酶與β-淀粉酶復(fù)配，制備得到麥芽糖含量為62.1%的麥芽糖漿。此外還采用色譜分離、酵母發(fā)酵等方法提高麥芽糖含量，黃偉紅[12]等將色譜分離后的麥芽糖漿經(jīng)活性干酵母發(fā)酵，制備得到麥芽糖含量為99%的超高麥芽糖漿。本文將嗜熱真菌樟絨枝霉α-淀粉酶基因McAmyA在畢赤酵母GS115中高效表達(dá)和高密度發(fā)酵，研究重組α-淀粉酶McAmyA的酶學(xué)性質(zhì)，并直接以工業(yè)化生產(chǎn)的液化產(chǎn)物為底物，研究該酶在制備麥芽糖漿中的應(yīng)用。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)材料

菌株：樟絨枝霉S168由本實(shí)驗(yàn)室保存，大腸桿菌E.coliDH5α，購(gòu)于北京博邁德生物技術(shù)有限公司，畢赤酵母GS115和質(zhì)粒pPIC9K，購(gòu)于美國(guó)Invitrogen公司，淀粉液化液由山東隆科特酶制劑有限公司提供(玉米淀粉為底物，細(xì)菌α-淀粉酶高溫液化制得)。

液化液原液：干物質(zhì)含量32%，DE值32，葡萄糖、麥芽糖、麥芽三糖、麥芽四糖的含量分別為(以干物質(zhì)計(jì))：1.5%、11.8%、14.1%、8.7%，殘留液化酶活為150 U/mL。

1.1.2培養(yǎng)基

LB、YPD、MD、BMGY、BMMY等培養(yǎng)基的配制方法參照Invitrogen公司的《畢赤酵母表達(dá)操作手冊(cè)》。

PTM1(g /L)：CuSO4·5H2O 6，NaI 0.08，MnSO4·H2O 3，Na2MoO4·2H2O 0.2，H3BO30.02，CoCl20.5，F(xiàn)eSO4·7 H2O 65，生物素 0.2，濃硫酸 5 mL。

1.2 方法

1.2.1 樟絨枝霉α-淀粉酶基因McAmyA的克隆和表達(dá)載體構(gòu)建

根據(jù)HAN等[6]的報(bào)道，以cDNA為模板，設(shè)計(jì)引物McAmyADNAF(5′—ATGGTTTCAACAGCACTATTCCT—3′)和McAmyADNAR(5′—TCAGTTCTCGCAAAGCCCGGA—3′)，克隆樟絨枝霉α-淀粉酶基因McAmyA，然后將PCR擴(kuò)增回收的DNA片段和巴斯德畢赤酵母表達(dá)載體pPIC9K雙酶切，酶切位點(diǎn)為SnaBI和AvrⅡ，用試劑盒回收DNA片段和表達(dá)載體pPIC9K，T4連接酶連接目的基因片段和表達(dá)載體后，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α，涂布于含氨芐青霉素的LB抗性平板培養(yǎng)基，挑取轉(zhuǎn)化子進(jìn)行菌落PCR和雙酶切驗(yàn)證，陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子命名為pPIC9K-McAmyA。

1.2.2 α-淀粉酶基因McAmyA在畢赤酵母中表達(dá)

提取陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子質(zhì)粒，進(jìn)行線性化，電轉(zhuǎn)化至畢赤酵母感受態(tài)GS115，涂布于MD平板培養(yǎng)基，30 ℃培養(yǎng)4 d，待轉(zhuǎn)化子長(zhǎng)出后，將其涂布在含不同濃度遺傳霉素G418的平板培養(yǎng)基。長(zhǎng)出酵母后，挑取單菌落到BMGY培養(yǎng)基，30 ℃恒溫?fù)u床培養(yǎng)至OD600=2～6，離心收集菌體，用BMMY培養(yǎng)基重懸并接種至BMMY培養(yǎng)基，使OD600達(dá)1.0，30 ℃恒溫?fù)u床誘導(dǎo)3 d，每24 h補(bǔ)充甲醇，使甲醇終體積分?jǐn)?shù)為0.5%。

1.2.3 畢赤酵母高密度發(fā)酵

選取搖瓶發(fā)酵酶活最高的菌株，在5 L發(fā)酵罐進(jìn)行高密度發(fā)酵，工作體積為1.5 L，發(fā)酵方法和發(fā)酵培養(yǎng)基的配制參照PichiaFermentation Guidelines (Version B，053002，Invitrogen)。發(fā)酵過程主要分為分批培養(yǎng)、甘油流加培養(yǎng)和甲醇誘導(dǎo)培養(yǎng)3個(gè)階段。

分批培養(yǎng)：裝1.5 L基本培養(yǎng)基，滅菌發(fā)酵罐，28%濃氨水調(diào)節(jié)pH至4.0，加入PTM14.35 mL/L，接種量10%，起始轉(zhuǎn)速600 r/min，溫度30 ℃，發(fā)酵18～24 h。

甘油流加培養(yǎng)：待分批培養(yǎng)至培養(yǎng)基中的甘油耗盡，流加50%甘油，28%濃氨水調(diào)節(jié)pH至5.0，流速為18.4 mL/(h·L)，流加時(shí)間4～5 h，待OD600達(dá)180～220，停止流加甘油。

甲醇誘導(dǎo)培養(yǎng)：停止流加甘油后，饑餓30 min左右，28%濃氨水調(diào)節(jié)pH至6.0，轉(zhuǎn)速調(diào)為800 r/min，流加甲醇，誘導(dǎo)產(chǎn)酶，監(jiān)控溶氧變化，保持DO>20%，發(fā)酵過程中取樣分析菌體濕重、酶活力和蛋白含量。

1.2.4 α-淀粉酶活力及蛋白含量的測(cè)定

α-淀粉酶活力測(cè)定：采用DNS法[13]測(cè)定酶活力，將900 μL用緩沖液配置的10 g/L可溶性淀粉，于一定溫度水浴鍋中預(yù)熱5 min后加入100 μL適當(dāng)稀釋的酶液，在一定溫度下，水浴反應(yīng)10 min，加入1 mL DNS終止反應(yīng)，沸水浴10 min后測(cè)吸光值OD540，以葡萄糖作為標(biāo)準(zhǔn)品。酶活定義：每分鐘反應(yīng)生成1 μmol葡萄糖所需要的酶量定義為1個(gè)酶活力單位。

另外，同時(shí)采用輕工行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)(QB 2526—2001)測(cè)定酶活，將10 mL可溶性淀粉溶液在40 ℃水浴鍋中預(yù)熱10 min，加入適當(dāng)稀釋的酶液1 mL，40 ℃準(zhǔn)確加熱30 min后，加入費(fèi)林試劑4 mL使酶失活，硫代硫酸鈉滴定測(cè)定生成的還原糖。酶活定義：反應(yīng)30 min，反應(yīng)液中產(chǎn)生相當(dāng)于10 mg葡萄糖的還原糖所需的酶量，定義為1個(gè)淀粉糖化酶活力單位。

蛋白含量測(cè)定：參照LOWRY等的方法[14]，以牛血清蛋白(BSA)作為標(biāo)準(zhǔn)蛋白。

1.2.5 重組α-淀粉酶McAmyA的純化

重組α-淀粉酶McAmyA經(jīng)甲醇誘導(dǎo)168 h后，10 000 r/min 離心5 min收集上清液，用50 mmol/L Tris-HCl (pH 8.0)在4 ℃條件下透析過夜，然后10 000 r/min離心10 min，收集上清液即為粗酶液。將粗酶液過QSFF強(qiáng)陰離子交換柱(50 mmol/L pH 8.0 Tris-HCl緩沖液平衡)，流速為1.0 mL/min，用0～500 mmol/L 的NaCl溶液洗脫，收集有α-淀粉酶活性的組分，采用SDS-PAGE分析蛋白純度。

1.2.6 最適pH和最適溫度測(cè)定

最適pH的測(cè)定：選擇不同pH的50 mmol/L 6種緩沖液，包括檸檬酸-檸檬酸鈉(pH3.0～6.0)、醋酸-醋酸鈉(pH4.0～6.0)、MES(pH5.5～7.0)、MOPS(pH6.5～8.0)、CHES(pH8.0～10.0)和CAPS(pH10.0～11.0)，配制1%可溶性淀粉底物，在65 ℃條件下，按照DNS法，測(cè)定重組α-淀粉酶McAmyA在不同緩沖體系中的酶活，測(cè)定酶活最高點(diǎn)設(shè)為100%。

最適溫度的測(cè)定：用最適pH緩沖液配制1%可溶性淀粉底物，在40～90 ℃條件下，按照DNS法測(cè)定重組α-淀粉酶McAmyA酶活，測(cè)定酶活最高點(diǎn)設(shè)為100%。

1.2.7 重組α-淀粉酶McAmyA水解液化液制備麥芽糖漿

1.2.7.1 重組α-淀粉酶McAmyA加酶量對(duì)麥芽糖含量的影響

以液化液為底物，在60 ℃和自然pH(pH 5.9)下，按照液化液質(zhì)量分別添加α-淀粉酶40、60、80、100、120、140、160、180 U/g，水解8 h，HPLC檢測(cè)麥芽糖含量，考察重組α-淀粉酶McAmyA加酶量對(duì)麥芽糖含量的影響，并計(jì)算在最優(yōu)加酶量下的水解率。

1.2.7.2 水解溫度對(duì)麥芽糖含量的影響

以液化液為底物，按照120 U/g的加酶量，自然pH(pH 5.9)，水解溫度分別為50、55、60、65、70、75 ℃下水解8 h，HPLC檢測(cè)麥芽糖含量，考察水解溫度對(duì)麥芽糖含量的影響，并計(jì)算在最佳水解溫度下的水解率。

1.2.7.3 水解時(shí)間對(duì)麥芽糖含量的影響

以液化液為底物，在加酶量為120 U/g、溫度60 ℃和自然pH(pH 5.9)的條件下分別水解8、10、12、14、16、20、24 h，HPLC檢測(cè)麥芽糖含量，考察水解時(shí)間對(duì)麥芽糖含量的影響，并計(jì)算在最佳水解時(shí)間下的水解率。

1.2.7.4 糖含量測(cè)定和水解率計(jì)算

糖含量采用高效液相(HPLC)測(cè)定。

色譜柱：氨基鍵合柱(4.6×250 mm，5 μm)；檢測(cè)器：ELSD 2424 蒸發(fā)光檢測(cè)器；柱溫：45 ℃；流動(dòng)相：乙腈∶水=60∶ 40，流速1 mL/min，進(jìn)樣體積10 μL，糖化液過0.22 μm濾膜，稀釋一定倍數(shù)備用。

水解液中各糖含量和水解率的計(jì)算如下：

(1)

(2)

干物質(zhì)質(zhì)量測(cè)定：阿貝折光儀直接測(cè)定(GB/T 20885—2007)。

2 結(jié)果與分析

2.1 α-淀粉酶基因McAmyA的畢赤酵母表達(dá)和高密度發(fā)酵

α-淀粉酶基因McAmyA在畢赤酵母GS115中成功表達(dá)，高拷貝篩選酶活最高的菌株進(jìn)行5 L發(fā)酵罐高密度發(fā)酵，測(cè)定發(fā)酵液的酶活、蛋白含量和菌體濕重，并對(duì)發(fā)酵上清液進(jìn)行SDS-PAGE分析，結(jié)果如圖1所示。

M-低分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)蛋白；1-7分別為甲醇誘導(dǎo)24、48、72、96、118、144、168 h的發(fā)酵上清液圖1 畢赤酵母表達(dá)重組α-淀粉酶McAmyA的高密度發(fā)酵歷程(A)及SDS-PAGE(B)Fig.1 Time-course of recombinantα-amylase (McAmyA) expression in Pichia pastoris by high cell density fermention (A) and SDS-PAGE analysis of curde enzyme (B)

隨甲醇誘導(dǎo)時(shí)間增加，菌體濕重、蛋白含量和α-淀粉酶酶活力逐漸上升(圖1-A)，由SDS-PAGE可看出，目標(biāo)蛋白條帶隨發(fā)酵時(shí)間增加逐漸變粗(圖1-B)。甲醇誘導(dǎo)168 h時(shí)，菌體濕重為470 g/L，胞外酶活力達(dá)13 440 U/mL(QB 2526—2001法測(cè)定酶活為：253.6 U/mL)，蛋白含量為13.2 mg/mL，酶活力相比最初搖瓶發(fā)酵(554 U/mL)，提高了24.3倍。

野生型樟絨枝霉菌株產(chǎn)α-淀粉酶活力低(308.5 U/mL)，α-淀粉酶基因McAmyA在畢赤酵母GS115中成功表達(dá)，進(jìn)行高密度發(fā)酵后，相對(duì)于原始菌株發(fā)酵，酶活提高了43.6 倍。已報(bào)道畢赤酵母表達(dá)中α-淀粉酶的表達(dá)水平較低。米曲霉(Rhizopusoryzae)α-淀粉酶在畢赤酵母中表達(dá)，分批補(bǔ)料發(fā)酵140 h后，蛋白表達(dá)量為0.382 mg/mL[15]。地衣芽孢桿菌(Bacilluslicheniformis)α-淀粉酶在畢赤酵母中表達(dá)，經(jīng)5 L發(fā)酵罐發(fā)酵168 h，蛋白表達(dá)量為8.3 mg/mL(酶活8 100 U/mL，DNS法，每分鐘水解1 mg淀粉定義為1個(gè)酶活單位)[7]。本研究中樟絨枝霉α-淀粉酶在畢赤酵母GS115中高效表達(dá)，表達(dá)量在α-淀粉酶研究中處于較高水平。

2.2 重組α-淀粉酶McAmyA的純化

重組α-淀粉酶McAmyA的純化表如表1所示。

表1 重組α-淀粉酶McAmyA純化表Table 1 Purification summary of McAmyA

注：a酶活測(cè)定條件：可溶性淀粉為底物，MES緩沖液(pH 6.5)，65 ℃；b蛋白質(zhì)測(cè)定采用Lowry法，以牛血清蛋白(BSA)為標(biāo)準(zhǔn)品。

發(fā)酵粗酶液經(jīng)QSFF強(qiáng)陰離子交換柱后一步純化得到電泳級(jí)純酶，純化倍數(shù)為1.2，比酶活為1 230.2 U/mg，酶活力回收率為63.5%，純酶在SDS-PAGE上顯示為單一蛋白條帶(見圖2)，分子質(zhì)量約為55 kDa。基因序列預(yù)測(cè)該蛋白分子質(zhì)量為51.9 kDa，含有1個(gè)可能的N-糖基化位點(diǎn)，純酶經(jīng)Endo H處理后，分子質(zhì)量沒有發(fā)生明顯變化，說(shuō)明該蛋白可能未發(fā)生糖基化。

M-低分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)蛋白；1-純酶液；2-經(jīng)Endo H酶切除糖基后的蛋白圖2 重組α-淀粉酶McAmyA的SDS-PAGE分析Fig.2 SDS-PAGE of recombinant α-amylase McAmyA

2.3 重組α-淀粉酶McAmyA的最適pH和最適溫度

重組α-淀粉酶McAmyA的最適pH和最適溫度見圖3。α-淀粉酶McAmyA的最適pH為6.5 (圖3-A)，最適反應(yīng)溫度為65 ℃(圖3-B)，大于65 ℃，酶活降低，在90 ℃基本失活。

圖3 重組α-淀粉酶McAmyA的最適pH(A)和最適溫度(B)Fig.3 Optimal pH (A) and optimal temperature (B) of McAmyA

重組α-淀粉酶McAmyA與野生型樟絨枝霉α-淀粉酶的最適pH和最適溫度一致，最適pH接近于Fusicoccumsp.來(lái)源的α-淀粉酶[16](pH 7.0)，高于Paecilomycessp.來(lái)源的α-淀粉酶[17](pH 4.0)。最適溫度低于Fusicoccumsp.[16]來(lái)源的α-淀粉酶(70 ℃)，高于Geomycespannorum來(lái)源的α-淀粉酶[18](40 ℃)。

2.4 重組α-淀粉酶McAmyA制備麥芽糖漿

2.4.1 重組α-淀粉酶McAmyA加酶量對(duì)麥芽糖含量的影響

工業(yè)生產(chǎn)中，淀粉液化后直接進(jìn)入糖化階段，因此選用液化液為底物，在溫度60 ℃和自然pH的條件下水解8 h，重組α-淀粉酶McAmyA加酶量對(duì)麥芽糖含量的影響如圖4所示。

圖4 重組α-淀粉酶McAmyA加酶量對(duì)麥芽糖含量的影響Fig.4 Effect of recombinant α-amylase McAmyA dosage on maltose content

加酶量小于120 U/g時(shí)，隨加酶量增加，麥芽糖含量明顯增加，加酶量大于120 U/g后，麥芽糖含量增加緩慢，同時(shí)考慮生產(chǎn)成本和糖化效率，選擇120 U/g為最適加酶量，此時(shí)的麥芽糖含量為44.3%，葡萄糖含量為14.4%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))，水解率為54.6%。

2.4.2 水解溫度對(duì)麥芽糖含量的影響

以液化液為底物，在加酶量120 U/g，水解8 h的條件下，水解溫度對(duì)麥芽糖含量的影響見圖5。

圖5 水解溫度對(duì)麥芽糖含量的影響Fig.5 Effect of hydrolysis temperature on maltose content

溫度小于60 ℃時(shí)，隨溫度升高，麥芽糖含量增加，糖化溫度60 ℃時(shí)，麥芽糖含量達(dá)到最大，最大為43.3%，葡萄糖含量為15.7%，此時(shí)水解率為54.9%，溫度大于60 ℃后，酶活穩(wěn)定性差，水解率降低，麥芽糖含量減少。

2.4.3 水解時(shí)間對(duì)麥芽糖含量的影響

以液化液為底物，在加酶量120 U/g和水解溫度60 ℃的條件下，水解時(shí)間對(duì)麥芽糖含量的影響結(jié)果如圖6所示。隨水解時(shí)間增加，麥芽糖含量逐漸增加(圖6-A)，水解時(shí)間大于14 h，麥芽糖含量增加緩慢，水解24 h時(shí)，主要產(chǎn)物是葡萄糖、麥芽糖、麥芽三糖和少量麥芽四糖(圖6-B)，麥芽糖含量為50.0%(圖6-B)，葡萄糖含量為40.4%，此時(shí)的水解率為83.44%，達(dá)到GB/T 20883—2007對(duì)麥芽糖漿的要求，即麥芽糖含量≥50%。

圖6 水解時(shí)間對(duì)麥芽糖含量的影響(A)和水解24 h糖化液的HPLC色譜圖(B)Fig.6 Effect of time on maltose content (A) and HPLC chromatogram of maltose syrup at the optimal condition (B)

與已報(bào)道制備麥芽糖漿的研究相比，如張正文等[19]利用真菌α-淀粉酶在60 ℃和pH 5.5的條件下，水解40 h制備得麥芽糖含量為60%，葡萄糖含量為9.0%的啤酒用麥芽糖漿。易翠平等[10]以大米淀粉為原料，利用真菌淀粉酶在58 ℃下，水解10 h，制備得麥芽糖含量為45.18%，葡萄糖含量為4.75%的麥芽糖漿。郭俊珍等[20]在55 ℃下，水解44 h制備得76.8%的麥芽糖漿。重組α-淀粉酶McAmyA制備的麥芽糖漿中葡萄糖雖然含量較高，但是糖化溫度較高，時(shí)間較短，在糖化過程中具有一定優(yōu)勢(shì)。

3 結(jié)論

將嗜熱真菌樟絨枝霉α-淀粉酶基因McAmyA在畢赤酵母中高效表達(dá)，高密度發(fā)酵168 h時(shí)，蛋白表達(dá)量為13.2 mg/mL，胞外酶活力達(dá)13 440 U/mL。重組α-淀粉酶McAmyA粗酶液經(jīng)強(qiáng)陰離子交換層析純化得到電泳級(jí)純酶，酶學(xué)性質(zhì)研究表明，重組α-淀粉酶McAmyA的最適pH和最適溫度分別為6.5 和65 ℃。以淀粉液化液為底物，在60 ℃、加酶量120 U/g和自然pH的條件下，水解24 h，重組α-淀粉酶McAmyA制備得麥芽糖含量為50.0%的麥芽糖漿。表明該酶在制備麥芽糖漿中具有很大應(yīng)用潛力。