沈璽龍，李永霞， 張群英

(貴州省植物園，貴州 貴陽 550000)

樹莓(Raspberry)為薔薇科(Rosaceae)懸鉤子屬(Rubus L.)多年生開花植物，中藥名為覆盆子，為藥食同源植物，是第三代水果的典型代表。其廣泛分布在歐洲、亞洲、北美洲等的溫帶氣候區(qū)，并且自公元4世紀(jì)便被作為食物和藥物使用[1]。其富含多種營(yíng)養(yǎng)、保健成分[2]，具有抗氧化、抗腫瘤、抑菌抗炎、降低血液膽固醇[3-5]等藥用功效。樹莓鞣花酸可提取于樹莓植株的莖、葉和果實(shí)，是樹莓提取物中所占比較重要的活性成分之一。樹莓鞣花酸的生物活性，現(xiàn)已成為研究的熱點(diǎn)，同時(shí)，對(duì)樹莓鞣花酸不同提取與純化方法的建立與優(yōu)化也備受關(guān)注。本文就近年來樹莓鞣花酸的提取、純化、含量測(cè)定以及生物活性等方面對(duì)樹莓鞣花酸的研究作一綜述。

1 樹莓鞣花酸的制備

1.1 粗提

鞣花酸提取方法有：乙酸乙酯萃取法[6]、酸水解法[7]、分離沉淀法[8]等，但大都提取過程復(fù)雜耗時(shí)較長(zhǎng)，且在提取過程中鞣花酸容易分解，耗時(shí)長(zhǎng)、得率低。近年來隨著技術(shù)的發(fā)展，鞣花酸的提取方法也有了極大改善，將溶劑提取與微波輔助相結(jié)合的微波輔助溶劑浸提法已成為現(xiàn)今鞣花酸提取的主流[9]。微波輔助溶劑浸提法耗時(shí)較少，且相對(duì)簡(jiǎn)便快捷，在減少提取用時(shí)的同時(shí)，又能保護(hù)鞣花酸防止分解，大大提取高鞣花酸得率。

李小萍[10]等使用丙酮、甲醇、乙醇、鹽酸作為紅樹莓果實(shí)中鞣花酸提取的提取溶劑，對(duì)比不同溶劑條件下紅樹莓果實(shí)中鞣花酸的提取效果。通過實(shí)驗(yàn)對(duì)比，確定丙酮提取的效果較其他三種提取溶劑好。將丙酮作為鞣花酸提取溶劑，通過單因素正交試驗(yàn)分析得出紅樹莓中鞣花酸提取的最佳條件為：提取液85%丙酮、料液比1∶12、時(shí)間90min、溫度80℃。在此條件下提取紅樹莓果實(shí)中的鞣花酸，得到的鞣花酸含量為322μg/g。王佳慧[9]等在試驗(yàn)中使用超聲波輔助溶劑浸提法提取樹莓中的鞣花酸，將無水乙醇作為鞣花酸的提取溶劑，超聲波輔助提取。響應(yīng)面分析法對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行優(yōu)化組合分析，確定了鞣花酸提取的最佳工藝為溫度80.02℃、提取時(shí)間19.72min、料液比1∶14.04，在此條件下提取得到的樹莓鞣花酸可以達(dá)到670.28μg/g。進(jìn)一步確定影響樹莓中鞣花酸提取的主要因素，利用單因素試驗(yàn)驗(yàn)證溫度、提取時(shí)間、料液比等條件下鞣花酸得率，最終得出料液比對(duì)鞣花酸得率的影響要超過提取溫度、提取時(shí)間對(duì)鞣花酸得率的影響，確定了料液比是影響樹莓中鞣花酸提取的主要因素。崔珊珊[11]通過對(duì)比微波輔助溶劑浸提法與鹽酸水解法得到的鞣花酸提取物的抗氧化能力，發(fā)現(xiàn)微波輔助溶劑浸提法獲得的樹莓鞣花酸提取物對(duì)羥自由基、DPPH·自由基的清除能力，要顯著高于傳統(tǒng)的鹽酸作為提取溶劑得到的鞣花酸。這表明微波輔助溶劑浸提法在提起過程中，更好的保護(hù)了樹莓鞣花酸提取物的生物活性。

1.2 分離與純化

目前國(guó)內(nèi)關(guān)于樹莓功能性成分提取技術(shù)的研究尚處于實(shí)驗(yàn)室水平階段，在實(shí)驗(yàn)室研究中大多利用色譜來分離純化鞣花酸粗提液中的鞣花酸，使用色譜分離純化鞣花酸優(yōu)點(diǎn)是得率高、操作便捷。在工業(yè)生產(chǎn)中，目前對(duì)樹莓的大多數(shù)功能性成還分無法實(shí)現(xiàn)大規(guī)模的工業(yè)提取與純化。

在對(duì)鞣花酸的分離純化研究中，辛秀蘭等[12]以正丁醇-異丙醇-水(體積比)2∶1∶3為兩項(xiàng)溶劑，進(jìn)樣量為20mL，檢測(cè)波長(zhǎng)254nm，建立一種高速逆流色譜(HSCCC)分離純化紅樹莓果中鞣花酸的新方法。且在鞣花酸的分離過程中，為了達(dá)到更好的洗脫效果，使粗提物中的鞣花酸與水溶性易于分離，將傳統(tǒng)的高效液相洗脫方式改為采用梯度洗脫的方式。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，新的分離純化方法取得了良好的分離效果，能夠更好的分離粗提液中的鞣花酸，最終得到的鞣花酸純度為81.6%。魏小聰?shù)萚13]在研究中利用高效液相法測(cè)定了樹莓葉片和果實(shí)中鞣花酸的含量，改進(jìn)了兩項(xiàng)溶液，流動(dòng)相A：磷酸∶水=0.5∶99.5；B相：乙腈∶水∶冰醋酸=49.5∶50∶0.5，在對(duì)樹莓鞣花酸含量的測(cè)定實(shí)驗(yàn)中，該方法穩(wěn)定性、重復(fù)性良好。測(cè)得果實(shí)中鞣花酸含量最高達(dá)849mg/kg，樹莓鮮葉中鞣花酸含量為57mg/kg，不同部位鞣花酸含量依次為樹莓果實(shí)>樹莓干葉>樹莓鮮葉。相較于返滴定法、分光光度法，高效液相色譜法表現(xiàn)出了明顯的簡(jiǎn)便、快速的優(yōu)點(diǎn)，其測(cè)試結(jié)果也更加的可靠。

2 理化性質(zhì)

鞣花酸屬于多酚二內(nèi)酯類化合物，含有4個(gè)羥基、2個(gè)內(nèi)酯環(huán)[14]，呈反式?jīng)]食子酸單寧結(jié)構(gòu)，是沒食子酸的二聚衍生物[15]。純鞣花酸是一種黃色針狀晶體，熔點(diǎn)約為360℃，微溶于水、醇等。鞣花酸與不同物質(zhì)反應(yīng)呈現(xiàn)不同顏色，與三氯化鐵反應(yīng)呈藍(lán)色，遇硫酸則呈現(xiàn)黃色。鞣花酸存在于多種植物的果實(shí)、葉片中，如樹莓、草莓、藍(lán)莓等。

3 樹莓鞣花酸的生物活性

3.1 抗氧化

李小萍[16]在對(duì)紅樹莓鞣花酸提取物的生物活性的研究中，通過研究鞣花酸的抗油脂氧化能力及鞣花酸的還原能力的試驗(yàn)，并通過樹莓提取物鞣花酸對(duì)羥自由基(·OH)、DPPH·自由基的清除能力的試驗(yàn)，驗(yàn)證了樹莓提取物中的鞣花酸有很強(qiáng)的清除自由基及抗油脂抗氧化能力，進(jìn)一步驗(yàn)證了樹莓鞣花酸提取物具有很強(qiáng)的抗氧化能力。一種物質(zhì)所具有的還原能力的大小，影響著這種物質(zhì)清除自由基能力的大小。李小萍在對(duì)樹莓鞣花酸提取物還原能力的試驗(yàn)中選用還原鐵系統(tǒng)作為驗(yàn)證對(duì)象，將維生素C的還原能力作為參照物，通過對(duì)比驗(yàn)證鞣花酸提取物的還原能力。通過實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，鞣花酸提取物與維生素C的還原能力均隨著其濃度的升高而增加，同時(shí)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)也進(jìn)一步表明，維生素C的還原能力要強(qiáng)于鞣花酸。當(dāng)鞣花酸提取物的濃度達(dá)到1.0mg/mL時(shí)，此濃度下鞣花酸提取物的還原能力與0.5mg/mL的維生素C還原能力相當(dāng)。但當(dāng)兩者濃度均超過5mg/mL后，兩者的還原能力增大均已不太明顯。通過對(duì)比實(shí)驗(yàn)證實(shí)了樹莓中的鞣花酸提取物具有較強(qiáng)的還原能力，但其還原能力要弱于維生素C。在鞣花酸對(duì)油脂的抗氧化實(shí)驗(yàn)中表明，樹莓鞣花酸提取液對(duì)油脂類有很明顯的抗氧化作用，并且隨著紅樹莓鞣花酸提取物濃度的提高，其抗氧化性能就越強(qiáng)。在樹莓鞣花酸提取物的清除DPPH·自由基，F(xiàn)enton法清除羥自由基的實(shí)驗(yàn)中均證實(shí)了，樹莓鞣花酸提取物在體外有獨(dú)特的抗氧化能力，其抗氧化能力隨著鞣花酸濃度的增加而提高，但當(dāng)濃度達(dá)到一定程度后其抗氧化能力增加已不明顯。且在樹莓鞣花酸提取物清除自由基的試驗(yàn)中表明，鞣花酸對(duì)DPPH·自由基的清除能力要強(qiáng)于清除羥自由基的能力。從保健方面綜合利用考慮，鞣花酸的抗氧化能力對(duì)防衰老等功能品的開發(fā)有重要的參考價(jià)值。崔珊珊[11]對(duì)不同溶劑提取的樹莓鞣花酸的抗氧化能力的研究表明，不同提取方法、提取溶劑得到的鞣花酸的抗氧化活性有顯著差異。實(shí)驗(yàn)也在提醒我們，在提取過程中對(duì)生物活性的物質(zhì)保護(hù)是研究的基礎(chǔ)，也為后續(xù)功能性食品的開發(fā)提供了一定的研究基礎(chǔ)。

3.2 抗腫瘤

大量的研究表明樹莓中所含有的鞣花酸量居現(xiàn)已探明的各類可食用植物之首，樹莓中鞣花酸含量約為1.5mg·100g/mf～2.0mg·100g/mf[17]。研究證實(shí)在抗腫瘤方面鞣花酸有突出的表現(xiàn)，對(duì)化學(xué)物質(zhì)誘導(dǎo)的癌變及其他原因?qū)е碌陌┳冇忻黠@的抑制作用，其中對(duì)結(jié)腸癌、食管癌、肺癌、舌及皮膚腫瘤、乳腺癌、肝癌、胰腺癌等[18-20]有很好的抑制作用。楊洪亮等[21]用鞣花酸處理體外培養(yǎng)的小鼠乳腺癌細(xì)胞EMT6、人肝癌細(xì)胞SMMC-7721和正常肝細(xì)L-02，研究發(fā)現(xiàn)鞣花酸對(duì)小鼠乳腺癌細(xì)胞、人肝癌細(xì)胞的增殖有顯著的抑制作用，當(dāng)IC50=5μg/mL時(shí)，劑量、時(shí)間對(duì)細(xì)胞的抑制起雙重效果。在研究中發(fā)現(xiàn)鞣花酸特別是對(duì)肝癌、肺癌等的抑制作用更為顯著[22]，在進(jìn)一步研究鞣花酸對(duì)癌細(xì)胞的作用機(jī)制中發(fā)現(xiàn)，鞣花酸抑制了腫瘤細(xì)胞DNA的合成。細(xì)胞增殖過程中，鞣花酸阻滯細(xì)胞有絲分裂的G0/G1期的轉(zhuǎn)變，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，同時(shí)不會(huì)影響正常細(xì)胞的繁殖。KUMARA D等[23]研究發(fā)現(xiàn)鞣花酸能夠與姜黃素協(xié)同作用，共同誘導(dǎo)ROS的產(chǎn)生，使宮頸癌細(xì)胞上的P53蛋白大量積累，P53蛋白的累計(jì)誘導(dǎo)了癌細(xì)胞的大量凋亡。在對(duì)鞣花酸治療癌癥的應(yīng)用中，V.Arulmozhi等[24]通過離子凝膠法將鞣花酸制備成一種膠囊藥劑，將其用于治療口腔癌。

3.3 抑菌性

辛秀蘭等[25]通過鞣花酸提取物的抑菌試驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，紅樹莓果實(shí)中鞣花酸的提取物物對(duì)大腸桿菌、志賀氏菌、沙門氏菌、枯草桿菌等致病菌有較好的抑制作用，且當(dāng)鞣花酸提取物濃度為8mg/mL時(shí)，其抑菌效果頗為明顯，研究證實(shí)鞣花酸的抑菌效果是隨著鞣花酸濃度增加而提高。同時(shí)在研究中也發(fā)現(xiàn)，鞣花酸提取物對(duì)米曲霉、黑曲霉、酵母菌等受試菌有抑制效果，但抑制效果相較其他受試菌作用不明顯，僅在鞣花酸的濃度增加到6mg/mL或8mg/mL時(shí)，才出現(xiàn)直徑不超過5.5mm的抑菌圈。

3.4 其他生物活性

鞣花酸的生物活性除具有抗氧化、抗癌等活性外，還發(fā)現(xiàn)鞣花酸能夠起到抑制黃褐斑形成的作用。鞣花酸能夠通過降低或消除酪氨酸酶和過氧化氫酶的活性，從而降低或消除黑色素細(xì)胞的活性，從而起到抑制黃褐斑的形成的作用。徐冰等[26]通過研究發(fā)現(xiàn)，自愿受試者連續(xù)服用覆盆子提取物30天以后，其身體黃褐斑面積明顯減少，顏色沉寂效果也有所下降，且在此后的跟蹤研究中發(fā)現(xiàn)，受試者體表沒有新的黃褐斑出現(xiàn)。

4 發(fā)展前景

目前對(duì)樹莓鞣花酸生物活性的研究多集中在抗氧化、抗腫瘤等能力，在保健和醫(yī)療等方面，樹莓鞣花酸具有非常廣闊的發(fā)展前景。鞣花酸的抗氧化能力強(qiáng)，可作為天然抗氧化劑進(jìn)行開發(fā)利用；樹莓果實(shí)濃縮提取物中的鞣花酸保健食品，在世界發(fā)達(dá)國(guó)家中，是暢銷的抗癌保健品，而在國(guó)內(nèi)有關(guān)樹莓活性物質(zhì)的保健品開發(fā)卻還甚少，有巨大的發(fā)展前景。深入研究樹莓鞣花酸的理化特性、生物活性，對(duì)樹莓鞣花酸的高效開發(fā)及利用有重要意義，未來研究可以朝著擴(kuò)大樹莓活性成分藥理作用的應(yīng)用范圍展開。改進(jìn)鞣花酸的提取純化技術(shù)，提高樹莓鞣花酸的提取效率，使其展現(xiàn)出強(qiáng)大的生命力，為保健品的開發(fā)注入新鮮血液，促進(jìn)我國(guó)樹莓產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。