高凡丁，張成庭，蔡圣寶

(昆明理工大學，云南省食品安全研究院，云南 昆明，650500)

自由基在人體系統(tǒng)中是必不可少的，適量的自由基可以維持健康和生理平衡；然而，一旦自由基沒有及時清除、超出正常范圍，就會攻擊體內(nèi)一些正常的重要分子，對一些健康細胞造成損傷，使細胞老化、病變，甚至會增加心血管疾病、神經(jīng)性退行疾病和癌癥等疾病的發(fā)病率[1-2]。因此，現(xiàn)在許多研究都致力于尋找天然抗氧化劑來清除體內(nèi)過量的自由基。

青刺果是一種多年生的木本油料植物，大多數(shù)生長在中國和北印度高原地區(qū)，屬于特色經(jīng)濟作物，也是被廣泛使用的一種食療藥物。其解毒、抗炎的特性，可緩解肛門及牙齦相關(guān)的疾病。此外，青刺果的嫩莖和葉都可以食用，一些少數(shù)民族還將青刺果視為“吉祥物”或“花之王”[3]。由于青刺果的種子經(jīng)常被用來榨油，因此，目前青刺果的相關(guān)報道主要集中在對其果油的研究。青刺果油在市場上已經(jīng)開始大規(guī)模生產(chǎn)及銷售，食用青刺果果油能減輕肌肉和身體疼痛，并能夠預(yù)防一些疾病的發(fā)生[4]，所以青刺果正逐漸引起我們的重視。但目前對青刺果種子的研究仍然較少，特別是對其營養(yǎng)成分、酚類物質(zhì)組成及含量和抗氧化活性等方面的研究仍不夠全面。油粕是種子提取油后的副產(chǎn)品，少有人關(guān)注，目前報道的只有青刺果油粕提取物抗菌作用的研究[5]，而關(guān)于青刺果油粕的營養(yǎng)成分等相關(guān)研究未見報道，這嚴重限制了青刺果的開發(fā)與綜合利用。

因此，本研究的目的是評估和比較青刺果種子和油粕中的營養(yǎng)物質(zhì)、酚類成分和以及抗氧化活性，為青刺果的進一步研究和發(fā)展成為功能食品或保健品提供一定的相關(guān)數(shù)據(jù)和應(yīng)用基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

青刺果的種子，購買于云南省麗江市；油粕，購自當?shù)卣ビ蛷S。Folin Ciocalteu試劑購自默克(Darmstadt，德國)；2,2 -二苯基-1-三硝基苯肼(DPPH)、2′-聯(lián)氨-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸(ABTS)、三氯乙酸(TCA)均購自Sigma(Sigma-Aldrich，上海，中國)；標準氨基酸溶液均在Wako公司(日本)購買；本研究中使用的所有標準品均購自成都曼斯特生物科技有限公司(成都，中國)；所用的其他化學品和溶劑均為分析純。

1.2 原料前處理

將買來的種子和油粕凍干、粉碎，放于-20 ℃儲存，以便后續(xù)進一步進行營養(yǎng)成分的檢測。取5 g干燥后的種子和油粕干粉分別加入25 mL的80%甲醇，利用超聲輔助提取30 min，然后過濾取上清；在相同條件下再重復(fù)提取2次，以確保充分提取。合并濾液，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀除去有機溶劑并濃縮，濃縮液凍干放于-20 ℃保存，用以后續(xù)總酚和總黃酮含量的測定、酚類成分分析和清除DPPH和ABTS自由基能力的實驗。

1.3 總酚含量測定

用福林酚法[6]測定青刺果種子和油粕中的的總酚含量。分別取種子和油粕提取物10 mg溶于5 mL 80%甲醇作為樣品溶液。然后取0.5 mL樣品溶液，加入0.25 mL的福林酚試劑，靜置幾分鐘。隨后加入0.75 mL 質(zhì)量濃度為200 g/L 的Na2CO3溶液，并用蒸餾水定容至5 mL?；靹蚝?，在70 ℃水浴中孵育10 min。隨后用酶標儀測定其在765 nm處的吸光值?？偡拥臉藴是€是以沒食子酸為當量，將沒食子酸稀釋成5個濃度，按照以上步驟，測定反應(yīng)后的吸光值并繪制標準曲線。

1.4 總黃酮含量測定

青刺果種子和油粕中總黃酮的測定方法是參照以往報道的文獻并進行了細微的改動[7]。分別取種子和油粕提取物10 mg溶于20 mL 80%(體積分數(shù))的甲醇制成樣品溶液，然后取制好的樣品溶液0.5 mL，先后加入2.5 mL 70% 的乙醇，0.15 mL 5% 的NaNO2以及0.15 mL 10% 的Al(NO3)3。6 min后，加入1 mL 1 mol/L的NaOH，最后加入70% 的乙醇使反應(yīng)液總體積達到5 mL。混勻，室溫反應(yīng)30 min，用酶標儀測定500 nm處的吸光值?？傸S酮的標準曲線是用蘆丁作為參照物，將蘆丁稀釋成5個不同濃度，按照以上步驟測定并繪制標準曲線。

1.5 營養(yǎng)物質(zhì)分析

1.5.1 基本營養(yǎng)物質(zhì)組分分析

基本營養(yǎng)物質(zhì)組分的分析包括對青刺果種子及油粕中粗脂肪、粗蛋白和粗纖維含量的測定。參照AOAC中的方法960.39[8]測定粗脂肪含量；粗蛋白含量按照AOAC中的方法976.05[9]測定；總膳食纖維和可溶性膳食纖維按照AOAC方法985.29和AOAC方法993.19進行測定[10-11]。

1.5.2 氨基酸成分分析

參照KIM等的方法[12]對游離氨基酸進行分析。即分別取0.1 g的種子和油粕加入10 mL 5%(體積分數(shù))的三氯乙酸(TCA)。在室溫放置1 h，然后以轉(zhuǎn)速n=10 000 r/min離心10 min，收集上清液，用0.45 μm的濾頭過濾，濾液用于游離氨基酸分析。樣品經(jīng)過110 ℃、6 mol/L HCl的條件進行氨基酸水解，處理24 h后，在L-8900高速氨基酸分析儀(Hitachi，日本)進行分析，以5% 的乙醇和茚三酮溶液為流動相，游離氨基酸和水解氨基酸分別用# 2622 SC-PF和# 2622 SC-PH兩種柱子進行分析。

1.5.3 脂肪酸成分分析

樣品中的脂肪酸用GC-MS-QP2010儀器(島津，日本)進行分析。采用索氏提取法對種子和油粕進行提取，首先將提取物進行甲基化，即加入300 μL己烷，700 μL 1 mol/L酸化甲醇，85 ℃的條件下水浴，待樣品溫度降至室溫后，于-20 ℃下放置20 min后取出，再向混合液中加入375 μL 0.9% 的KCl和100 μL的正己烷。

取0.6 μL樣液，使用OV-1柱(30 m×0.25 mm id)進行氣相色譜分析，進樣溫度設(shè)為280 ℃。溫度梯度為130～180 ℃，升溫速度為10 ℃/min，180 ℃保持20 min；180～220 ℃，升溫速度為5 ℃/min， 220 ℃保持2 min；220～250 ℃，升溫速度為30 ℃/min，250 ℃保持5 min。用QP2010質(zhì)譜儀進行質(zhì)譜檢測，氦氣作為載氣，進樣速率為1.2 mL/min。電子碰撞電壓為70 eV，檢測器電壓設(shè)為900 V，發(fā)射源溫度200 ℃和掃描范圍為m/z35～800。

1.5.4 礦物質(zhì)元素分析

用AOAC中的標準[13]對樣品進行礦物質(zhì)元素分析，將提取物用去離子水稀釋為15 mL，用火焰原子吸收光譜法進行檢測(Analytikjena，novAA 400P)。

1.6 酚類物質(zhì)的定性定量分析

用高分辨液質(zhì)聯(lián)用儀(Thermo Fisher Ultimate 3000 UHPLC system)檢測青刺果種子和油粕的酚類物質(zhì)組成。采用Reprospher 100 C18柱(1.8 mm×100 mm, 2 μm, Dr. Maisch, Germany)，以0.1%甲酸水為流動相A，乙腈為流動相B，流動相的濃度梯度為：0～5 min, 10% B; 5～15 min, 10%～15% B; 15～25 min, 15%～35% B; 25～30 min, 35%～50% B；30～32 min, 50%～100% B。進樣量為3 μL，流速為0.2 mL/min，柱溫設(shè)為30 ℃。

ESI-HRMS/MS檢測時使用模式為陰離子模式，掃描范圍150m/z～2 000m/z。種子和油粕中酚類化合物的二級譜圖信息是由Q-Exactive Orbitrap mass spectrometer (Thermo Fisher Scientific, Germany)檢測器檢測得到。其余質(zhì)譜參數(shù)設(shè)置如下：分辨率為70 000；鞘氣流速為32 L/min；輔助氣體流速為8 L/min；噴射源電壓為3.3 kV；S-lens射頻水平為50%；輔助氣體加熱器溫度為350 ℃；毛細管溫度為320 ℃。

根據(jù)液質(zhì)分析鑒定出的種子和油粕中的酚類化合物，準確稱取相應(yīng)或結(jié)構(gòu)相似的酚類物質(zhì)標準品，分別配成5個濃度梯度，然后用相同的液相液質(zhì)條件進行分析，得到標品各濃度的峰面積。以標品的濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標繪制出標準曲線。然后，根據(jù)種子和油粕中各酚類物質(zhì)的峰面積，進行定量分析。

1.7 DPPH自由基清除能力測定

種子和油粕對DPPH自由基的清除能力的實驗參考DUDONNE等的方法[14]進行測定。用甲醇溶解提取物的干粉，并按照提取率計算，將樣品濃度分別稀釋為400、600、800、1 000、1 200 μg干重/mL，各取0.5 mL,分別加入2 mL 0.1 mmol/L DPPH的甲醇溶液；對照組加入0.5 mL甲醇和2 mL DPPH?；旌暇鶆?，室溫放置30 min，于517 nm波長下測定吸光度。樣品組和對照組均設(shè)立空白對照。

1.8 ABTS自由基清除能力測定

參照已有文獻[15]對樣品清除ABTS自由基的能力進行測定。ABTS工作液配置如下：取 7 mmol/L ABTS 5 mL加入88 μL 40 mmol/L的過硫化鉀溶液，室溫放置12～16 h，混合后用乙醇稀釋，于734 nm處測定吸光值，工作液的吸光值應(yīng)為0.7±0.02。樣品前處理同DPPH相同，0.5 mL樣品，加入ABTS工作液4 mL：對照組為0.5 mL甲醇和ABTS工作液4 mL，混勻。于734 nm處用酶標儀測定吸光值。樣品組和對照組均設(shè)立空白對照。

1.9 數(shù)據(jù)分析

所有數(shù)據(jù)以平均值±標準誤差表示，每組實驗進行3次平行。采用Turkey單因素方差分析(P<0.05)。所有數(shù)據(jù)均用Origin 8.5(OriginLab, MA, USA)進行數(shù)據(jù)處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 青刺果種子和油粕中總酚總黃酮含量

青刺果種子和油粕酚類物質(zhì)的提取率如表1所示，油粕的提取率略高于種子，但沒有顯著性差異(P>0.05)。根據(jù)提取物得率，青刺果種子和油粕的總酚和總黃酮含量以原料干重表示并進行比較分析，結(jié)果如表1所示。

表1 青刺果種子和油粕中總酚總黃酮含量(n=3)Table 1 Total phenolic and flavonoids contents in seeds and pomace of Prinsepia utilis Royle(n=3)

注：結(jié)果是以原料(種子或油粕)干重計，并且數(shù)值均帶有SD值。表中的不同字母表示顯著差異(P<0.05)。

從表1可知，種子中的總酚含量顯著高于油粕(P<0.05)，這可能是由于榨油過程中種子中的一些酚類物質(zhì)發(fā)生了氧化分解，或是一些極性較低的酚類物質(zhì)在榨油后溶于油中所致。有研究發(fā)現(xiàn)，橄欖在經(jīng)過榨油加工后，其油粕的總酚含量比橄欖中下降了約73%[16]。植物果實或種子往往富含酚類物質(zhì)，對高生灌木的漿果CoriandrumsativumL.種子的研究發(fā)現(xiàn)其總酚含量為410 mg/100g干重[17]，這與青刺果種子中總酚的含量相當。但是，SURVESWARAN等[18]研究了133個植物樣本的總酚含量，如大蒜種子(150 mg/100 g干重)、鷹葉刺種子(130 mg/100 g干重) 和黃瓜種子中(70 mg/100 g干重)，這些植物中的總酚含量均低于青刺果種子和油粕。種子中的總黃酮含量也顯著高于油粕(P<0.05)，其原因可能與總酚含量變化相同。種子和油粕中總黃酮含量與生姜的葉子和根莖中的含量相近[19]。有報道研究番茄中總黃酮的含量為80 mg/100 g干重[20]，而本研究中青刺果種子的總黃酮含量比其高了5倍多。當前的研究結(jié)果說明青刺果種子和油粕的酚類物質(zhì)含量較為豐富，可以作為膳食酚類物質(zhì)的良好來源。

2.2 營養(yǎng)物質(zhì)分析結(jié)果

2.2.1 基本營養(yǎng)物質(zhì)組分分析結(jié)果

青刺果種子和油粕中粗脂肪、粗蛋白和膳食纖維的含量如表2所示。

表2 青刺果種子和油粕中粗脂肪、粗蛋白和膳食纖維含量(n=3) 單位：g/100 g干重Table 2 Crude fat, protein, and fiber contents in seeds and pomace of Prinsepia utilis Royle in seeds and pomace(n=3)

注：結(jié)果均帶有SD值并且結(jié)果是以干重計。列中的不同字母表示顯著差異(P<0.05)。

2.2.2 氨基酸組成成分結(jié)果

表3表示種子和油粕中氨基酸的組成。由表3可知，比起種子，油粕中含有更多的游離氨基酸，這可能是煉油的過程造成的。種子和油粕中都沒有檢測到色氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺和脯氨酸。在這些游離氨基酸中，精氨酸的含量在種子中占了一半，油粕中含量最高的是谷氨酸。水解之后的氨基酸組成如表4所示，水解之后在種子和油粕中都檢測到了包括脯氨酸在內(nèi)的17種氨基酸，包括除色氨酸外的，人體和動物自身所不能合成的8種必需氨基酸[26]。天冬酰胺和亮氨酸的含量在水解之后都增加了。種子中天冬酰胺和精氨酸的含量最高，甲硫氨酸含量最低，油粕中谷氨酸含量最高的，甲硫氨酸的含量同樣最低(P<0.05)。

表3 青刺果種子和油粕中游離氨基酸含量(n=3) 單位：g/100 g干重Table 3 Free amino acid in seeds and pomace of Prinsepia utilis Royle (n=3)

注：結(jié)果均帶有SD值并且結(jié)果是以干重計。種子和油粕中的不同字母表示顯著差異(P<0.05)。

表4 青刺果種子和油粕中水解氨基酸含量(n=3) 單位：g/100 g干重Table 4 Hydrolytic amino acid in seeds and pomace of Prinsepia utilis Royle (n=3)

注：結(jié)果均帶有SD值并且結(jié)果是以干重計。種子和油粕中的不同字母表示顯著差異(P<0.05)。

2.2.3 脂肪酸含量結(jié)果

青刺果種子和油粕中脂肪酸組成的結(jié)果如表5所示，共檢測出了14種脂肪酸，包括7種不飽和脂肪酸。不飽和脂肪酸對人體具有重要的生理功能，尤其是亞麻酸和亞油酸。而在青刺果的種子和油粕中也檢出了有較多的不飽和脂肪酸，如油酸和亞油酸。種子中C18∶0的含量幾乎等于椰子油中的含量(2 g/100g干重)，而C16∶0含量與花生油中的含量接近(6 g/100g干重)[27]。說明青刺果種子和油粕含有比較豐富的脂肪酸。

表5 青刺果種子和油粕中脂肪酸含量(n=3) 單位：g/100 g干重Table 5 Fatty acid composition in seeds and pomace of Prinsepia utilis Royle (n=3)

注：結(jié)果均帶有SD值并且結(jié)果是以干重計。種子和油粕中的不同字母表示顯著差異(P<0.05)。

2.2.4 礦物質(zhì)含量檢測結(jié)果

青刺果種子和油粕中的礦物質(zhì)含量如表6所示。在礦物質(zhì)含量的分析中，一共檢測出了6種元素，其中鉀和鈣含量最高，鋅元素的含量最低(P<0.05)。過量的氯化鈉攝入或由于不良飲食引起的鉀/鈉比值過低都會引起高血壓，而實驗發(fā)現(xiàn)青刺果種子和油粕的鉀/鈉分別為2.94和3.06，與水果和蔬菜以及人類健康的膳食標準一致(鉀/鈉比>2)。鈣是骨骼生長、肌肉和神經(jīng)功能的重要元素，而青刺果種子和油粕中含有較多的鈣元素，其含量分別為384.6和553.2 mg/100 g，甚至顯著高于原鱒魚(632 mg/kg)[28]中鈣的含量。二價鎂離子是許多酶活性的輔助因子，青刺果種子和油粕中也含有大量的鎂，其含量與草莓中的鎂含量相近[29]。礦物質(zhì)含量分析表明，青刺果的種子和油粕可以作為一個很好的礦物質(zhì)元素的來源。

表6 青刺果種子和油粕中礦物質(zhì)含量(n=3) 單位：g/100 g干重Table 6 Mineral contents in seeds and pomace of Prinsepia utilis Royle (n=3)

注：結(jié)果均帶有SD值并且結(jié)果是以干重計。列中的不同字母表示顯著差異(P<0.05)。

2.3 青刺果種子和油粕中酚類物質(zhì)定性定量結(jié)果

采用高分辨液相質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)對青刺果種子和油粕中酚類化合物的性質(zhì)進行分析。青刺果種子和油粕液質(zhì)分析的總離子流圖如圖1所示。

圖1 青刺果種子和油粕的總離子流圖Fig.1 The total ion chromatogram of seeds and pomace of Prinsepia utilis Royle

其酚類物質(zhì)的定性定量結(jié)果如表7所示。種子和油粕中共檢測出7種相同的酚類物質(zhì)，其中原兒茶酸([M-H]-=m/z153.018 0)為酚酸類化合物，其余6種均為黃酮類化合物。水仙苷又名異鼠李素-3-O-蕓香糖苷，失去蕓香糖苷其二級特征產(chǎn)物離子為m/z315.051 0，山奈酚-7-O-葡萄糖苷和蘆丁的二級特征產(chǎn)物離子分別為m/z284.031 8和300.026 9，這也是由于失去相關(guān)糖苷部分所致。原兒茶酸的二級為[M-CHO2]-m/z128.020 1，槲皮素的特征離子為[M-C8H6O3]-m/z151.002 2，而芹菜素和圣草酚的二級碎片均是[M-C7H4O4]-,其碎片分子質(zhì)量分別為m/z117.033 0和m/z135.043 7。對這7種酚類物質(zhì)的定量結(jié)果表明(表7)，種子和油粕之間的含量存在顯著差異(P<0.05)，其中山奈酚-7-O-葡萄糖苷和芹菜素在種子中的含量高于油粕，其而他5種酚類物質(zhì)的含量，油粕要高于種子。但總的來說，水仙苷在種子和油粕中的含量都較高。

2.4 抗氧化性結(jié)果分析

青刺果種子和油粕對DPPH自由基清除結(jié)果如圖2-A所示。其對DPPH自由基的清除能力隨著樣品濃度的增加而增強。相同濃度下，種子清除DPPH自由基的能力顯著高于油粕(P<0.05)。青刺果種子和油粕對DPPH自由基清除的IC50值分別為871.31和1 131.98 μg原料干重/mL。在同一反應(yīng)體系下，陽性對照Vc清除DPPH自由基的IC50值為3.41 μg/mL。青刺果種子和油粕對ABTS自由基清除能力如圖2-B所示，ABTS自由基清除率也與樣品濃度呈現(xiàn)一定的劑量效應(yīng)。結(jié)果表明，種子與油粕對ABTS自由基的清除能力存在顯著差異(P<0.05)。在相同濃度下，種子清除ABTS自由基的能力顯著強于油粕。在1 200 μg原料干重/mL時，種子和油粕對ABTS自由基清除率分別為94.27%和55.07%。其IC50值分別為496.86和1 100.92 μg原料干重/mL，陽性對照Vc清除ABTS自由基的IC50值為3.47 μg/mL。種子和油粕對ABTS自由基清除率的IC50值低于其清除DPPH自由基的IC50值，特別是種子，幾乎少了一半，這表明相較于清除DPPH自由基，種子和油粕可能有更強的清除ABTS自由基的能力?？傮w來看，青刺果種子的抗氧化能力(包括對DPPH和ABTS自由基的清除能力)強于其油粕，推測可能是由于在榨油的加工過程中一些加工因素導(dǎo)致種子中的還原性物質(zhì)發(fā)生氧化分解，使其抗氧化能力減弱，正如表1所示，油粕中的總酚總黃酮含量均顯著少于青刺果種子。

表7 青刺果種子和油粕中多酚類物質(zhì)定性定量結(jié)果* (n = 3)Table 7 Phenolic compositions detected and characterized in seeds and pomace of Prinsepia utilis Royle*

注：*所有分類物質(zhì)用標準品鑒定,序號按出峰時間排列，如圖1所示；數(shù)據(jù)以原料(種子或油粕)干重計，表示為平均值±SD值；每行中的不同字母表示存在顯著差異(P<0.05)。

圖2 青刺果種子和油粕對DPPH自由基清除率(A)和ABTS自由基的清除率(B)Fig.2 DPPH radical scavenging ratio (A) and ABTS radical scavenging ratio (B) of seeds and pomace of Prinsepia utilis Royle注：結(jié)果均帶有SD值并且結(jié)果是以干重計。同一濃度下不同字母表示顯著性差異(P<0.05)。

GOLDSMITH等[16]研究了橄欖在榨油過程中酚類物質(zhì)的變化，發(fā)現(xiàn)榨油過程中橄欖的酚類物質(zhì)及抗氧化能力均出現(xiàn)下降。劉琴等[30]對油菜籽多酚在加工過程中變化的研究也發(fā)現(xiàn)，高溫榨油會導(dǎo)致其抗氧化能力顯著下降?？寡趸钚越Y(jié)果表明，青刺果種子和油粕都具有良好的清除自由基的能力，可能有助于減少氧化應(yīng)激相關(guān)疾病的發(fā)病率。另外，通過總酚含量和抗氧化數(shù)據(jù)分析，可以看出，隨著酚類物質(zhì)濃度的升高，其抗氧化能力加強，呈現(xiàn)量效關(guān)系，推測可能是酚類物質(zhì)在樣品抗氧化中發(fā)揮重要作用。

3 結(jié)論

在本次研究中，研究了青刺果種子和油粕中的營養(yǎng)成分、酚類物質(zhì)組成及其抗氧化活性。青刺果種子和油粕的總酚總黃酮含量存在顯著差異。種子中的總酚總黃酮相對于油粕含量較高。營養(yǎng)成分的分析結(jié)果表明，種子中粗脂肪含量明顯高于油粕，而粗蛋白，總膳食纖維和可溶性膳食纖維的含量在種子榨油后顯著增加，尤其是總膳食纖維的含量提升最為明顯。種子和油粕中還含有豐富的氨基酸，包括12種游離氨基酸和17種水解氨基酸。在青刺果種子和油粕中均檢出了14種脂肪酸，含量最高的為油酸和亞油酸。在種子和油粕中還檢出了6種礦物質(zhì)元素，其中鉀和鈣含量最高。此外，在種子和油粕中檢出了7種酚類物質(zhì)，其中水仙苷是主要的酚類化合物。青刺果的種子和油粕都具有較強的清除自由基的能力，種子和油粕對DPPH自由基清除的IC50值分別為871.31、1 131.98 μg原料干重/mL，而對ABTS自由基清除的IC50值分別為496.86、1 100.92 μg原料干重/mL。總的來說，青刺果種子和油粕中均含有較多的營養(yǎng)物質(zhì)，并具有較強的清除自由基的能力，說明了青刺果種子作為營養(yǎng)食品和功能性食品原材料的可能性；同時也為青刺果油粕的進一步回收利用提供理論基礎(chǔ)。