王鵬飛,郭康,沈娟章,譚衛(wèi)紅

(中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院 林產(chǎn)化學(xué)工業(yè)研究所，生物質(zhì)化學(xué)利用國(guó)家工程實(shí)驗(yàn)室，國(guó)家林業(yè)局林產(chǎn)化學(xué)工程重點(diǎn)開(kāi)放性實(shí)驗(yàn)室，江蘇省生物質(zhì)能源與材料重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南京，210042)

我國(guó)是核桃的生產(chǎn)大國(guó)，主要產(chǎn)區(qū)有新疆、云南、廣西、河北、湖北、陜西、安徽等省。核桃營(yíng)養(yǎng)價(jià)值極高，富含優(yōu)質(zhì)的脂肪、蛋白質(zhì)、維生素以及微量元素，具有健腦益智、降血脂、抗氧化、降血糖、預(yù)防癌癥等功能[1]。核桃的品質(zhì)受到產(chǎn)地的影響，具有很強(qiáng)的地域特征。有學(xué)者研究表明，不同產(chǎn)區(qū)的核桃受土壤、氣候、濕度等環(huán)境因素影響，使得核桃的營(yíng)養(yǎng)成分不同[2]。因此有必要保護(hù)地域特色食品，我國(guó)頒布的《地理標(biāo)志產(chǎn)品保護(hù)規(guī)定》明確規(guī)定特定地域，具有質(zhì)量、聲譽(yù)的產(chǎn)品受法律保護(hù)，目前也有相關(guān)的核桃地理標(biāo)志，但是如何鑒別確認(rèn)不同產(chǎn)地的核桃是當(dāng)前需要解決的問(wèn)題。

近年來(lái)，穩(wěn)定同位素技術(shù)發(fā)展快速，該技術(shù)利用生物體內(nèi)同位素組成受氣候、土壤、地形以及自身代謝等因素影響的特征[3]，在農(nóng)產(chǎn)品產(chǎn)地溯源和摻假檢測(cè)等許多領(lǐng)域逐漸得到應(yīng)用，目前已經(jīng)成功應(yīng)用于茶葉[4]、黑加侖[5]、橄欖油[6]、甜椒[7]等產(chǎn)品的產(chǎn)地溯源。有時(shí)為了提高產(chǎn)地溯源的判別率，可通過(guò)將穩(wěn)定同位素結(jié)合產(chǎn)品的其他檢測(cè)指標(biāo)，如有機(jī)成分[8]，無(wú)機(jī)元素[9-10]，有機(jī)、無(wú)機(jī)元素相結(jié)合[11]等。虎海防等[12]利用核桃中碳水化合物含量的差異對(duì)新疆不同產(chǎn)地的核桃進(jìn)行鑒別，而利用穩(wěn)定同位素技術(shù)和有機(jī)成分聯(lián)合判別核桃產(chǎn)地來(lái)源，目前還未見(jiàn)報(bào)道。實(shí)驗(yàn)的創(chuàng)新點(diǎn)在于將穩(wěn)定同位素技術(shù)應(yīng)用于核桃產(chǎn)地溯源中，主要內(nèi)容是研究核桃的碳、氫、氧、氮同位素組成以及粗脂肪、粗蛋白含量在不同地區(qū)的差異，并利用粗脂肪、粗蛋白含量輔助穩(wěn)定同位素指標(biāo)對(duì)不同產(chǎn)地的核桃進(jìn)行判別分析。

1 材料與方法

1.1 主要儀器與材料

元素分析-穩(wěn)定同位素質(zhì)譜聯(lián)用儀(美國(guó)Thermo Fisher公司)；FLASH 2000 HT型元素分析儀；連續(xù)流接口裝置Conflo IV；DELTA V ADVANTAGE穩(wěn)定同位素質(zhì)譜儀；DHG-9146A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱。

碳、氮同位素標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)咖啡因(IAEA-600，δ13C：-27.771‰±0.043‰，δ15N：+1.000‰±0.2‰)；氫同位素標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)聚乙烯(IAEA-CH-7，δ2H：-100.3‰±2.2‰)；氧同位素標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)苯甲酸(IAEA-601，δ18O：+23.330‰±0.3‰)，均購(gòu)于奧地利維也納國(guó)際原子能機(jī)構(gòu)。

實(shí)驗(yàn)涉及到氣體均為高純氣體，購(gòu)于南京麥克斯韋氣體有限公司。

實(shí)驗(yàn)收集344個(gè)核桃樣品，其中河南省121個(gè)，甘肅80個(gè)，云南省23個(gè)，四川省20個(gè)，陜西省20個(gè)，新疆20個(gè)，湖北20個(gè)，河北20個(gè)，廣西20個(gè)，樣品的具體地域信息見(jiàn)表1。

1.2 樣品預(yù)處理

核桃去殼，核桃仁用研缽磨碎，置于60 ℃烘箱干燥24 h除去水分，于0 ℃密封儲(chǔ)存待測(cè)。

1.3 樣品測(cè)定

1.3.1 粗脂肪含量

參照GB/T.5009.6—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中脂肪的測(cè)定 》，采用索式提取法測(cè)定。

表1 核桃采樣地域信息Table 1 Walnut sampling area information

1.3.2 粗蛋白含量

用EA2400 SeriesⅡ元素分析儀測(cè)定氮元素含量，粗蛋白含量為氮元素含量乘以6.25[13]。

1.3.3 穩(wěn)定碳、氮同位素測(cè)定

稱取0.25～0.3 mg待測(cè)樣品，用錫杯包裹，由元素分析儀自動(dòng)進(jìn)樣器將樣品送入動(dòng)態(tài)快速燃燒爐。在裝有純氧、氧化還原劑的燃燒爐中，樣品的中的碳元素轉(zhuǎn)化為CO2，氮元素轉(zhuǎn)化為N2。經(jīng)過(guò)吸水柱除水干燥，然后經(jīng)過(guò)CO2、N2分離色譜柱分離，最后經(jīng)Conflo IV稀釋后進(jìn)入同位素比率質(zhì)譜儀測(cè)試。

檢測(cè)條件：氧化爐溫度為960 ℃，載氣流速為100 mL/min，樣品吹掃氣流速為225 mL/min，氧氣流速為175 mL/min，注氧時(shí)間為3 s，氣相色譜柱溫度為50 ℃。

1.3.4 穩(wěn)定氫、氧同位素測(cè)定

稱取約0.25～0.3 mg待測(cè)樣品，用銀杯包裹好置于元素分析儀自動(dòng)進(jìn)樣器中，樣品送入高溫裂解爐，裂解爐中的玻璃碳直接將樣品中H和O元素轉(zhuǎn)化成H2和CO，經(jīng)過(guò)H2、CO分離色譜柱分離后，最后經(jīng)過(guò)Conflo IV稀釋后進(jìn)入質(zhì)譜系統(tǒng)。

檢測(cè)條件：裂解爐溫度為1 400 ℃，載氣流速為100 mL/min，樣品吹掃氣流速150 mL/min，氣相色譜柱溫度為90 ℃。

1.3.5 數(shù)據(jù)處理

使用Isodat 3.0軟件對(duì)穩(wěn)定同位素比值進(jìn)行計(jì)算，用統(tǒng)計(jì)產(chǎn)品與服務(wù)解決方案SPSS20.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析，單因素顯著性差異分析并作圖，利用線性判別分析各產(chǎn)地的判別率。線性判別分析是常用的判別方法，其原理是根據(jù)樣本的類內(nèi)方差最小和類間方差最大的原則，構(gòu)建2個(gè)判別函數(shù)，利用這2個(gè)判別函數(shù)對(duì)樣本進(jìn)行分類。

2 結(jié)果與討論

2.1 地域差異分析

2.1.1 碳同位素

由表2可知，不同地區(qū)核桃中δ13C值在-27.474‰～-25.718‰，樣品的變化幅度較小，δ13C值由小到大的順序?yàn)楹?新疆<河北<云南<甘肅<四川<廣西<河南<陜西。從圖1-a發(fā)現(xiàn)，新疆、河北、湖北、云南4省的樣品與河南、甘肅、陜西、四川的樣品重疊部分較少，區(qū)分明顯；而廣西樣品δ13C值波動(dòng)范圍最大，與其余各地都存在重疊，較難區(qū)分。

表2 不同省份間核桃各組分的測(cè)定結(jié)果Table 2 Determination of different components of walnut in different provinces

注：數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差；不同小寫字母表示顯著性差異(P<0.05)。下同。

圖1 不同地區(qū)核桃穩(wěn)定同位素及有機(jī)成分箱圖Fig.1 Different regions of walnut stable isotopes and organic composition box map

在河南省的亞地區(qū)中發(fā)現(xiàn)，δ13C值的變化順序?yàn)闈?jì)源市<內(nèi)鄉(xiāng)縣<林州市<嵩縣<盧氏縣，結(jié)合樣品采樣地域信息表3發(fā)現(xiàn)，δ13C值隨海拔高度的增加而增加，這與周詠春等[14]的研究結(jié)果一致?？赡苁且?yàn)殡S著海拔的增高，大氣壓降低，導(dǎo)致植物葉片內(nèi)外CO2的分壓降低，碳同位素的分餾作用減小，從而造成這一變化趨勢(shì)[15]。但這一變化趨勢(shì)在各省之間沒(méi)有體現(xiàn)出來(lái)，因?yàn)槌撕０?，碳同位素還受到溫度、光照、土壤含水量[16-18]等影響。

表3 河南省亞地區(qū)核桃各組分含量Table 3 The content of walnut in sub-region of Henan province

2.1.2 氫同位素

各地區(qū)δ2H值的范圍在-214.377‰～-162.501‰，其中以河北樣品最高，云南樣品最低。從圖1-b中看出各省的δ2H值分布為3個(gè)梯度，新疆與河北樣品有較大的重疊，兩者之間難以區(qū)分，但與其他地區(qū)區(qū)別顯著。河南、甘肅、陜西樣品的δ2H均值都在-177‰附近，重疊最大，無(wú)顯著性差異(P>0.05)。四川、湖北、甘肅樣品的δ2H值逐漸減小且少有重疊，三者之間容易區(qū)分。廣西省樣品的δ2H值波動(dòng)范圍較大，除與云南、湖北樣品有少許重疊外，與其他各省的區(qū)別明顯。由圖1-b能夠看出核桃中的δ2H值大體上有著隨緯度的降低而減小的趨勢(shì)，這與馬奕顏等[19]的報(bào)道一致。而在河南省的亞地區(qū)發(fā)現(xiàn)，隨著緯度的降低，δ2H值呈現(xiàn)出先減小后增大的趨勢(shì)。氫同位素的分餾并不僅受到緯度的影響，同時(shí)也與溫度[20]、降水[21]、海拔[22]等因素影響有關(guān)。結(jié)合表1和圖1-b發(fā)現(xiàn)新疆阿克蘇的緯度高于河北，但是新疆的樣品的δ2H值卻低于河北樣品，同樣的情況還出現(xiàn)在廣西和云南之間。研究表明在水汽輸送過(guò)程中，由于重同位素先于輕同位素下降，δ2H值由海岸向內(nèi)陸方向呈遞減的趨勢(shì)，即大陸效應(yīng)[23]。新疆相對(duì)河北在遙遠(yuǎn)的內(nèi)陸，有可能此時(shí)的大陸效應(yīng)強(qiáng)于緯度效應(yīng)，導(dǎo)致新疆樣品的δ2H值小于河北樣品。此外，植物中的δ2H值隨海拔的升高而降低[19]，云南省核桃產(chǎn)區(qū)的平均海拔約為1 541 m，遠(yuǎn)大于廣西省的138 m，因此有可能δ2H值受到海拔的影響較為顯著，導(dǎo)致云南省樣品的δ2H值小于廣西省。

2.1.3 氧同位素

δ18O值的范圍在13.574‰～25.107‰，以廣西核桃最低，新疆核桃最高。河北樣品的δ2H值波動(dòng)最大，與新疆樣品的重疊最多，兩者之間無(wú)顯著性差異(P>0.05)難以區(qū)分，但是兩者與其余各省的樣品區(qū)別明顯。此外，陜西樣品與河南、甘肅樣品也有較多的重疊。根據(jù)表1和圖1-c發(fā)現(xiàn)，不同產(chǎn)地核桃的δ18O值隨緯度的減小而減小，其趨勢(shì)與δ2H值變化相似。這也符合由于氫和氧都是水的組成元素，在水循環(huán)過(guò)程中兩者具有相似的分餾作用這一觀點(diǎn)[23]。但是在河南省的亞地區(qū)發(fā)現(xiàn)δ18O值隨緯度的減小，呈現(xiàn)出先增大后減小的趨勢(shì)，這與亞地區(qū)氫同位素的變化趨勢(shì)相反，還需深入研究。

2.1.4 氮同位素

由圖1-d知，不同來(lái)源的核桃δ15N值變化幅度較大，在-2.735‰～4.115‰，依次排序?yàn)楹幽?甘肅<四川<河北<新疆<陜西<云南<廣西<湖北。河南樣品的δ15N值最低，且與其他各省的樣品都沒(méi)有重疊。四川與甘肅之間重疊較多，不易區(qū)分，但兩者與其余各地的差異較為明顯。氮元素的分布與碳、氫、氧同位素的分布差異較大。這是因?yàn)橹参镏械摩?5N值主要受到土壤中氮元素的影響，而土壤中的氮?jiǎng)t取決于氣候、地理?xiàng)l件以及農(nóng)業(yè)施肥[24]。土壤中δ15N值與土壤的濕度相關(guān)，濕度大的區(qū)域δ15N值小，干旱的地區(qū)δ15N值較高[25]。農(nóng)業(yè)施肥受到人為因素的影響較大，化學(xué)肥料的δ15N值在-2‰～2‰，而有機(jī)肥料的δ15N值在0.6‰～36.7‰，過(guò)多的使用化學(xué)肥料也會(huì)導(dǎo)致土壤中δ15N值貧化[26]。

2.1.5 有機(jī)成分

由圖1-e、1-f可知不同產(chǎn)地的核桃粗脂肪含量多數(shù)集中在70%附近，其中云南省樣品的粗脂肪含量最高，平均含量為(73.75±6.54)%，廣西省樣品的粗脂肪含量最低，平均含量為(60.75±5.69)%，廣西省與其他各省沒(méi)有重疊差異。單因素方差分析顯示，除廣西省外，其余各省之間無(wú)顯著性差異(P>0.05)。不同地區(qū)核桃的粗蛋白含量集中在21%附近，河南省樣品中的粗蛋白含量最高，平均含量為(22.40±3.20)%，甘肅省樣品的粗蛋白含量最低，平均含量為(19.40±4.77)%， 各省之間也無(wú)顯著性差異(P>0.05)。

2.2 判別分析

2.2.1 對(duì)不同省份核桃的判別分析

利用線性判別分析法分析各指標(biāo)對(duì)核桃產(chǎn)地的判別影響，結(jié)果如圖2所示。利用δ13C、δ2H、δ18O、δ15N值對(duì)核桃產(chǎn)地進(jìn)行判別時(shí)，對(duì)河南省樣品的正確判別率最高，為87.6%，甘肅省最低，只有41.3%。其他省份的正確判別率依次為新疆70.0%，河北60.0%，陜西80.0%，四川85.0%，湖北78.9%，云南73.9%，廣西70.0%，總體正確判別率為71.1%。

圖2 不同省份間核桃產(chǎn)地判別結(jié)果Fig.2 Discrimination results of walnut origin in different provinces

將核桃的δ13C、δ2H、δ18O、δ15N值與粗脂肪、粗蛋白結(jié)合判別分析，可以看到各產(chǎn)地有兩個(gè)省的正確判別率達(dá)到了90.0%以上，分別為新疆95.0%，廣西90.0%。其余各省的正確判別率也有不同幅度的提升，河北70.0%，河南88.4%，陜西85.0%，四川85.0%，湖北78.9%，云南87.0%，甘肅省樣品的判別率仍然最低，但也提升到57.5%?？傮w的正確判別率提升到了79.6%，說(shuō)明穩(wěn)定同位素結(jié)合有機(jī)成分能提高對(duì)核桃產(chǎn)地的判別效果。

2.2.2 對(duì)河南省亞地區(qū)核桃的判別分析

如圖3，在利用δ13C、δ2H、δ18O、δ15N值對(duì)河南省亞地區(qū)核桃產(chǎn)地判別時(shí)，發(fā)現(xiàn)亞地區(qū)的正確判別沒(méi)有省份之間的高。在河南省的亞地區(qū)中，嵩縣樣品的正確判別率最高，也才達(dá)到68.2%，其余各亞地區(qū)的判別率為盧氏縣56.0%，林州市48.0%，濟(jì)源市60.0%，內(nèi)鄉(xiāng)縣57.9%，總體的正確判別率為57.9%。在結(jié)合了有機(jī)成分判別后，5個(gè)地區(qū)的總體正確判別率提高至68.6%，其中林州市提升最多，達(dá)到72.0%，其余各地的正確判別率為：嵩縣77.3%，盧氏縣60.0%，濟(jì)源市66.7%，內(nèi)鄉(xiāng)縣68.4%。可見(jiàn)，相比于各省之間，河南省亞地區(qū)的判別率要低，可能是由于各地區(qū)之間距離較近，同位素與有機(jī)成分的差異不明顯所致。

圖3 河南省亞地區(qū)核桃產(chǎn)地判別結(jié)果 Fig.3 Discrimination results of walnut origin in sub-region of Henan Province

3 結(jié)論

不同地區(qū)核桃的碳、氫、氧、氮同位素具有明顯的地域特征，在結(jié)合核桃的粗脂肪、粗蛋白含量后，能顯著提高各地區(qū)的正確判別率，說(shuō)明穩(wěn)定同位素結(jié)合有機(jī)成分這一方法能夠較為有效地用于核桃產(chǎn)地的區(qū)分。