肖 敏，吳又多，薛 闖

(大連理工大學(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，遼寧 大連 116024)

隨著人們生活水平的提高和生產(chǎn)工業(yè)的發(fā)展，化石燃料需求量日益增長(zhǎng)，導(dǎo)致原油資源逐漸枯竭且價(jià)格逐步上升，同時(shí)，化石燃料的大量使用也加劇了一系列環(huán)境問(wèn)題，如全球氣候變暖和大氣污染等[1]。2009年，美國(guó)環(huán)境保護(hù)局出臺(tái)了可再生燃料標(biāo)準(zhǔn)計(jì)劃(RFS2)，發(fā)展可再生生物燃料作為替代能源已成為全球趨勢(shì)[2]。丁醇是繼燃料乙醇之后另一個(gè)備受矚目的可再生生物燃料，其優(yōu)越的理化性能使其成為潛在的優(yōu)良替代能源。丁醇通常通過(guò)生物發(fā)酵法制備得到，生物發(fā)酵法產(chǎn)丁醇的流程一般分為原料選擇、原料預(yù)處理、纖維素酶酶解和丁醇發(fā)酵4個(gè)部分，本文中，筆者圍繞這4個(gè)方面總結(jié)了近年來(lái)國(guó)內(nèi)外在生物丁醇領(lǐng)域的研究成果。此外，本文重點(diǎn)分析丁醇生產(chǎn)的主要瓶頸，并總結(jié)相關(guān)研究進(jìn)展，以期為相關(guān)研究人員提供參考。

1 生物丁醇簡(jiǎn)介

Weizmann[3]曾在第一次世界大戰(zhàn)期間開創(chuàng)了生物發(fā)酵法生產(chǎn)丙酮-丁醇-乙醇(acetone-butanol-ethanol，ABE)，主要利用丙酮為化工原料生產(chǎn)彈藥，而丁醇則用來(lái)生產(chǎn)涂漆。然而在20世紀(jì)五六十年代石化合成方法的競(jìng)爭(zhēng)下，歐洲和北美的ABE發(fā)酵工業(yè)完全停止。

中國(guó)的ABE發(fā)酵產(chǎn)業(yè)最早建立于20世紀(jì)50年代，同樣在石化產(chǎn)業(yè)的沖擊下，20世紀(jì)末所有的ABE生產(chǎn)工廠被關(guān)閉[4]。直到近年來(lái)，由于石油資源的短缺和環(huán)境問(wèn)題的凸顯，丁醇作為極具前景的第二代生物燃料再次成為研究熱點(diǎn)。與燃料乙醇相比，生物丁醇有天然的性能優(yōu)勢(shì)：①丁醇烷基鏈較長(zhǎng)且能量密度高，可與柴油或汽油等傳統(tǒng)化石燃料較好的混溶；②丁醇和商用柴油具有較為接近的黏度值及表面張力值，可在發(fā)動(dòng)機(jī)內(nèi)部快速霧化，且無(wú)需改造現(xiàn)有發(fā)動(dòng)機(jī)構(gòu)造而直接加入使用[5-6]；③丁醇含氧量為22%，這使得丁醇的燃燒更加清潔，Zhang等[7]和Nigam等[8]也發(fā)現(xiàn)丁醇的添加有助于減少重型柴油機(jī)的污染物排放；④丁醇還具有吸濕性小和腐蝕性小的優(yōu)點(diǎn)，不會(huì)腐蝕現(xiàn)有的汽油存儲(chǔ)和運(yùn)輸?shù)幕A(chǔ)設(shè)施[8-9]。

生物丁醇可通過(guò)厭氧發(fā)酵各類可再生生物質(zhì)資源中的碳源得到，發(fā)酵微生物主要是一些產(chǎn)溶劑梭菌，如丙酮丁醇梭菌(Clostridiumacetobutylicum)和拜氏梭菌(Clostridiumbeijerinckii)等，它們是革蘭氏陽(yáng)性和專性厭氧微生物，能夠利用多種碳源代謝，包括多糖、二糖、己糖及戊糖等。以葡萄糖為例，菌株先通過(guò)糖酵解途徑將糖轉(zhuǎn)化為丙酮酸，同時(shí)生成大量對(duì)菌體對(duì)數(shù)生長(zhǎng)及后期產(chǎn)溶劑代謝至關(guān)重要的儲(chǔ)能化合物ATP及還原力NADH。碳流經(jīng)糖酵解催化轉(zhuǎn)化后進(jìn)入產(chǎn)酸期，菌體對(duì)數(shù)生長(zhǎng)狀態(tài)進(jìn)一步增強(qiáng)，乙酸和丁酸快速積累，引發(fā)發(fā)酵體系pH水平迅速下降，同時(shí)氣體產(chǎn)物CO2與H2大量釋放。當(dāng)酸積累到一定水平時(shí)，ABE發(fā)酵進(jìn)入產(chǎn)溶劑階段，以3∶ 6∶ 1的體積比生產(chǎn)丙酮、丁醇和乙醇。以可再生生物質(zhì)資源為發(fā)酵原料的丁醇生產(chǎn)不僅有助于農(nóng)業(yè)廢物的資源化利用，而且可降低生產(chǎn)成本。但是，有些生物質(zhì)資源具有剛性結(jié)構(gòu)，直接纖維素酶水解獲得可發(fā)酵糖的效率較低，必須經(jīng)過(guò)預(yù)處理后，再進(jìn)行酶解發(fā)酵。

2 生物發(fā)酵法產(chǎn)丁醇的工藝路線

2.1 原料的選擇

目前用于丁醇生產(chǎn)的原料主要來(lái)源于淀粉質(zhì)和糖質(zhì)原料。淀粉質(zhì)原料主要是一些塊莖作物，如甘薯、木薯和菊芋等，它們不是主要的糧食作物，且均含有大量碳水化合物。其中，菊芋是一種耐寒耐旱、適應(yīng)性強(qiáng)的植物，因其產(chǎn)量較高而成為有前景的丁醇生產(chǎn)原料[10]。據(jù)報(bào)道，在控制pH的條件下，使用菊芋酶水解液發(fā)酵可得到23～24 g/L 總?cè)軇11]。另一種產(chǎn)量較高的淀粉質(zhì)原料是木薯，Li等[12]利用100 g/L木薯粉發(fā)酵產(chǎn)出18.3 g/L丁醇和29.2 g/L 總?cè)軇Ａ硗?，Luo等[13]還發(fā)現(xiàn)小麥淀粉廢水的添加可以提高木薯粉產(chǎn)丁醇的濃度，同時(shí)也可降低生產(chǎn)成本。

用于丁醇生產(chǎn)的糖質(zhì)原料則主要有甘蔗、甜菜和糖蜜等，這些原料無(wú)需預(yù)處理，壓榨得到的汁液可直接用于酶解發(fā)酵，一定程度降低了生產(chǎn)丁醇的成本[14-16]。Wechgama等[17]曾比較甜高粱莖稈汁、蔗糖汁和甘蔗糖蜜作為原料的發(fā)酵，結(jié)果發(fā)現(xiàn)甘蔗糖蜜是最適合丁醇生產(chǎn)的發(fā)酵基質(zhì)。為了從甘蔗糖蜜發(fā)酵獲得更高的丁醇產(chǎn)量，Wechgama等[18]又對(duì)發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，在最優(yōu)條件下發(fā)酵得到12.55 g/L丁醇和17.96 g/L 總?cè)軇ｋm然這些淀粉質(zhì)原料和糖質(zhì)原料含有大量的碳水化合物，且處理方式簡(jiǎn)單，但原料來(lái)源受限，價(jià)格偏高，大量種植會(huì)產(chǎn)生與糧爭(zhēng)地的問(wèn)題，因此近年來(lái)逐步轉(zhuǎn)向以廉價(jià)的纖維質(zhì)資源為原料的丁醇生產(chǎn)工藝，這類原料大致可分為木質(zhì)生物質(zhì)、海洋藻類和農(nóng)業(yè)廢棄物三大類。

木質(zhì)生物質(zhì)可以分為軟木和硬木。硬木是被子植物，大多是落葉樹，包括楊樹、柳樹等樹木，它們主要存在于北半球。與硬木不同，軟木來(lái)源于針葉樹和裸子植物的樹木，生長(zhǎng)速度較快、密度較低[26]。木質(zhì)生物質(zhì)具有更靈活的收獲時(shí)間，不需要長(zhǎng)時(shí)間儲(chǔ)存[27]，同時(shí)還具有密度高、灰分含量小和戊糖含量低的特性，這使得木質(zhì)生物質(zhì)的運(yùn)輸更加經(jīng)濟(jì)有效[27]。但是，木質(zhì)生物質(zhì)較高的木質(zhì)素含量使其對(duì)微生物和纖維素酶具有更強(qiáng)的抵抗力，因此需要在預(yù)處理過(guò)程中投入更多能量來(lái)克服木質(zhì)生物質(zhì)的“頑固性”，這也使得成本大大提高。

海洋藻類作為第三代生物燃料的原料，具有不與糧食作物爭(zhēng)地、無(wú)需淡水栽培的優(yōu)點(diǎn)，且在生長(zhǎng)過(guò)程中可以消耗大量CO2，具有突出的環(huán)境效益。此外，海洋藻類生長(zhǎng)快速，含有高組分的碳水化合物和少量木質(zhì)素，甚至有些藻類不含木質(zhì)素，比如紅藻，這進(jìn)一步降低了預(yù)處理成本[28-30]。目前，一些大型藻類，如綠藻和褐藻，已經(jīng)用于梭菌發(fā)酵產(chǎn)丁醇，Potts等[31]以綠藻為原料，在酸水解后提取藻多糖進(jìn)行發(fā)酵，丁醇產(chǎn)率達(dá)到0.29 g/g。

農(nóng)業(yè)廢棄物是目前最具潛力的一類原料，以農(nóng)作物秸稈和一些廢渣為代表，如玉米秸稈、小麥秸稈和甘蔗渣等，表1列出了幾種代表性的農(nóng)業(yè)廢棄物的組分。與木質(zhì)生物質(zhì)相比，農(nóng)業(yè)廢棄物含有較少的纖維素組分(大約30%～40%)和木質(zhì)素組分(大約15%～20%)以及更多的半纖維素組分(大約15%～30%)，這使得農(nóng)業(yè)廢棄物在處理過(guò)程中消耗的能量較少[32]。此外，農(nóng)業(yè)廢棄物的資源化利用不僅有助于環(huán)境保護(hù)，還可以避免對(duì)木質(zhì)生物質(zhì)原料的依賴，從而減少森林砍伐。因此，目前國(guó)內(nèi)外研發(fā)重點(diǎn)主要集中在秸稈類農(nóng)業(yè)廢棄物的高效生物煉制方面。

表1 3種國(guó)內(nèi)常見(jiàn)農(nóng)業(yè)廢棄物的組分

2.2 原料預(yù)處理

木質(zhì)生物質(zhì)主要由纖維素、半纖維素和木質(zhì)素構(gòu)成，半纖維素和木質(zhì)素將纖維素包裹在內(nèi)部。預(yù)處理可以將纖維素暴露，增加纖維素酶的可及性，從而提高酶解效果。因而，有效的預(yù)處理對(duì)于成功的酶水解和下游操作是至關(guān)重要的[33]。

圖1展示了目前普遍使用的原料預(yù)處理方法，主要包括生物法、物理法、物理化學(xué)法和化學(xué)法。

圖1 常用的原料預(yù)處理方法Fig.1 Common methods used for feedstocks pretreatment

其中，生物法預(yù)處理采用微生物降解可再生生物質(zhì)，從而改變其化學(xué)組成，這些微生物包括白腐菌、褐腐菌、軟腐菌和細(xì)菌[34-36]。其中，白腐菌被認(rèn)為是處理木質(zhì)纖維素最有前景的微生物。Zhang等[37]篩選了35株白腐菌，用于處理竹子，他們觀察到Echinodontiumtaxodii2538、TrametesversicolorG20和CoriolusversicolorB1是一類高選擇性降解木質(zhì)素的白腐菌，可以顯著改善酶促糖化效率[38]。盡管生物預(yù)處理具有許多優(yōu)點(diǎn)，如能耗低、處理?xiàng)l件溫和，但菌株生長(zhǎng)緩慢、預(yù)處理時(shí)間長(zhǎng)且需要控制生長(zhǎng)條件。因此，生物預(yù)處理面臨著技術(shù)經(jīng)濟(jì)挑戰(zhàn)，在工業(yè)生產(chǎn)上不具有吸引力。

物理法預(yù)處理主要是通過(guò)碾磨、研磨、切片、超聲和射線等方式來(lái)破壞植物細(xì)胞的細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)，減小原料的尺寸，這可以提高下游預(yù)處理的效率。但是，在研磨階段能量消耗較高，且若研磨成很小的顆粒反而會(huì)對(duì)隨后的預(yù)處理產(chǎn)生負(fù)面影響，導(dǎo)致預(yù)處理結(jié)果并不理想。值得注意的是，超聲和射線預(yù)處理方法本質(zhì)上屬于物理預(yù)處理方法，由于這2種方法不能去除木質(zhì)纖維素材料中的半纖維素或木質(zhì)素，所以常將這幾種方法作為其他預(yù)處理方法的輔助工藝。其中，射線預(yù)處理由于安裝成本太高，很少用于工業(yè)生產(chǎn)[39]。

常用的物理化學(xué)法預(yù)處理主要有微波、水熱和爆破。其中，微波處理可以盡可能減小微晶纖維素的粒徑(<4 mm)，從而提高糖的產(chǎn)量[40]。Ma等[41]用微波處理稻草，在最佳條件下，纖維素含量從33.4%增加到41.8%，酸溶性木質(zhì)素含量從2.1%減少到1.9%，總糖化率增加了30.3%。水熱預(yù)處理可以在纖維素降解之前去除大部分半纖維素和部分木質(zhì)素，具有反應(yīng)器成本低、較少發(fā)酵抑制物形成以及可以直接使用濕物料的優(yōu)點(diǎn)。由于纖維素在高于240 ℃的溫度下會(huì)發(fā)生嚴(yán)重降解，因此處理溫度通常為160～240 ℃[42-43]。此外，為了提高半纖維素或木質(zhì)素的去除率，水熱預(yù)處理也可以在化學(xué)物質(zhì)催化下進(jìn)行[44-45]。爆破主要包括蒸汽爆破和氨纖維爆破(AFEX)，它們對(duì)環(huán)境的污染較小、產(chǎn)生的毒性物質(zhì)也較少[46-48]，Horn等[46]在210 ℃下蒸汽爆破處理小麥秸稈10 min時(shí)，酶水解產(chǎn)率達(dá)到最高。另外，經(jīng)氨纖維爆破處理過(guò)的百慕大草的酶解糖產(chǎn)量也可以達(dá)到理論糖得率的94.8%[48]。

化學(xué)法預(yù)處理大致可以分為酸、堿、有機(jī)溶劑和離子液體預(yù)處理4種。

由于半纖維素和纖維素的糖苷鍵對(duì)酸敏感，酸預(yù)處理可溶解木質(zhì)纖維素材料中的部分半纖維素，從而改善纖維素酶的可及性。在酸處理中，稀H2SO4預(yù)處理工藝的經(jīng)濟(jì)性最佳，一直是國(guó)內(nèi)外研究的熱點(diǎn)。Deshavath等[49]在最佳條件(0.2 mol/L H2SO4、121 ℃、120 min)下處理高粱秸稈，97.6%的半纖維素轉(zhuǎn)化為木二糖、木糖和阿拉伯糖，且糠醛產(chǎn)率僅為4.6 mg/g。

堿預(yù)處理過(guò)程使得木質(zhì)纖維素原料中半纖維素和木質(zhì)素間的酯鍵斷裂，從而促進(jìn)半纖維素和木質(zhì)素溶解，使纖維素暴露出來(lái)[50]。用于堿處理的試劑主要有NaOH、KOH、Ca(OH)2、Na2CO3和氨水，其中尤以Ca(OH)2預(yù)處理方法的效果最優(yōu)，Kim等[51]曾使用此方法去除了87.5%的木質(zhì)素。與此同時(shí)，氨預(yù)處理因氨易于回收、腐蝕性小、無(wú)毒等優(yōu)點(diǎn)也被廣泛研究[52]，它除了可以去除木質(zhì)素，還可以通過(guò)引發(fā)原料膨脹，增加比表面積，使其易于被纖維素酶水解[53]。

有機(jī)溶劑預(yù)處理則是通過(guò)有機(jī)溶劑在酸或堿的催化下破壞木質(zhì)素和半纖維素之間的化學(xué)鍵，從生物質(zhì)中提取木質(zhì)素[54]。這個(gè)過(guò)程的優(yōu)點(diǎn)是溶劑易于回收，提取的木質(zhì)素也可以被用來(lái)生產(chǎn)其他化學(xué)品[39,55]。迄今為止，甲醇[56]、乙醇[57]、丙酮[58]和乙二醇[59]等溶劑被用來(lái)預(yù)處理操作，其中，乙醇由于其低毒性更安全[60-61]。但是，有機(jī)溶劑的價(jià)格較高，且由于其高揮發(fā)性，需要高壓設(shè)備支持，因而難以用于工業(yè)生產(chǎn)中。

相比之下，離子液體是一種高效且“綠色”的纖維素溶劑，離子液體與纖維素分子中的羥基相互作用使得纖維素分子鏈間的氫鍵斷裂，溶解纖維素形成均勻的溶液[61-63]。溶解的纖維素可以在一些抗溶劑中快速沉淀而被回收，如水、乙醇、甲醇或丙酮，Zhu等[64]發(fā)現(xiàn)回收的纖維素與初始纖維素具有不同的宏觀和微觀結(jié)構(gòu)，特別是結(jié)晶度降低。此外，再生的木質(zhì)纖維素的酶水解速率可以提高數(shù)倍至數(shù)十倍[65]。但是，由于大多數(shù)離子液體都非常昂貴，且預(yù)處理需要較嚴(yán)格的條件，造成工藝成本很高。

2.3 纖維素酶水解

高效的預(yù)處理是成功酶解的基礎(chǔ)，而使用合適的纖維素酶進(jìn)行水解可以有效從可再生生物質(zhì)中釋放出單糖。纖維素酶是一系列協(xié)同將纖維素轉(zhuǎn)化為葡萄糖的酶的混合物，典型的纖維素酶系統(tǒng)至少需要3種酶來(lái)行使這個(gè)功能，包括內(nèi)切-1-4-β-葡聚糖酶(EC 3.2.1.4)、外切葡聚糖酶(EC 3.2.1.91)和β-葡糖苷酶(EC 3.2.1.21)[66-67]。纖維素酶通過(guò)吸附、生物降解和解吸3個(gè)步驟發(fā)揮作用，然而在水解過(guò)程中，纖維素酶活性會(huì)降低，這可能是由于其對(duì)纖維素的不可逆吸附作用。木質(zhì)素對(duì)酶的非生產(chǎn)性吸附也會(huì)對(duì)纖維素酶的活性產(chǎn)生不良影響。因此，一些研究確定了幾種消除纖維素酶抑制的方法。Liu等[68]已經(jīng)證明添加的金屬離子(Ca2+和Mg2+)可以與木質(zhì)素形成絡(luò)合物，增強(qiáng)酶水解。表面活性劑也可以改變纖維素表面的特性，減少酶對(duì)纖維素的不可逆結(jié)合，防止纖維素酶變性以及與木質(zhì)素的非生產(chǎn)性結(jié)合，Tween 20被證明是可以增強(qiáng)纖維素酶促水解最有效的非離子表面活性劑[69-70]。此外，Erickson等[71]報(bào)道了牛血清白蛋白(BSA)可以阻斷木質(zhì)素與纖維素酶的相互作用從而保護(hù)酶活性。Sewalt等[72]則發(fā)現(xiàn)木質(zhì)素對(duì)纖維素酶的不利影響可以通過(guò)木質(zhì)素的氨化和各種含氮化合物的添加來(lái)克服。

預(yù)處理產(chǎn)生的發(fā)酵抑制物會(huì)對(duì)酶解過(guò)程產(chǎn)生不利影響，需要首先對(duì)水解液進(jìn)行脫毒處理來(lái)提高酶解效率。水解液脫毒方法可以分為物理法、化學(xué)法和生物法。

物理法脫毒主要包括蒸發(fā)[73]、有機(jī)溶劑萃取[74]、離子交換樹脂[75]、活性炭吸附[76]和膜分離[77]，其中最常用的方法是活性炭吸附。Liu等[78]發(fā)現(xiàn)活性炭可以吸附25%的可溶性發(fā)酵抑制物，即羥甲基糠醛(HMF)、糠醛和酚類化合物，用活性炭脫毒后的水解液發(fā)酵可得到13 g/L丁醇，而未經(jīng)脫毒的水解液發(fā)酵生產(chǎn)的丁醇質(zhì)量濃度僅為1 g/L。

化學(xué)法脫毒是在特定的pH下沉淀有毒化合物或使發(fā)酵抑制物電離，后者能夠改變化合物的毒性程度[79-80]。常見(jiàn)的用來(lái)進(jìn)行化學(xué)脫毒的試劑有Ca(OH)2、NaOH和KOH等，其中Ca(OH)2的脫毒效果最佳。

生物法脫毒方分為兩大類：微生物酶的使用和可以改變發(fā)酵抑制物結(jié)構(gòu)的生物試劑的使用[81]。在最近的研究中，Morozova等[82]為了提高丁醇產(chǎn)量，使用了一種微生物聯(lián)合體的活性污泥，它只利用木質(zhì)纖維素水解液中的有毒成分而不消耗碳源，從水解產(chǎn)物中去除了98%的HMF和99%的糠醛。

2.4 纖維素丁醇發(fā)酵工藝

發(fā)酵工藝是決定丁醇產(chǎn)量的重要因素，合適的發(fā)酵策略的選擇能夠大大提高丁醇產(chǎn)量，目前廣泛使用的丁醇發(fā)酵工藝主要有：分步水解發(fā)酵(SHF)、同步糖化發(fā)酵(SSF)和同步糖化共發(fā)酵(SSCF)，其中SHF和SSF是丁醇生物煉制過(guò)程中常用的2個(gè)工藝。

SHF工藝是將水解和發(fā)酵在各自的最佳條件下分別進(jìn)行，首先將預(yù)處理的可再生生物質(zhì)通過(guò)纖維素酶轉(zhuǎn)化為可發(fā)酵的糖，然后將可發(fā)酵糖進(jìn)行滅菌后作為發(fā)酵碳源用于微生物發(fā)酵。目前，大部分研究都是利用SHF工藝來(lái)生產(chǎn)生物丁醇，但是，SHF工藝具有一些明顯的缺點(diǎn)。首先，在酶解過(guò)程中葡萄糖的積累會(huì)對(duì)β-葡萄糖苷酶產(chǎn)生抑制作用，導(dǎo)致酶解效果不佳；其次，在SHF工藝中，高溫滅菌不僅會(huì)破壞酶解液中的一些營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，還會(huì)產(chǎn)生少量糠醛和5-羥甲基糠醛[83]。因此，為了克服SHF工藝的缺點(diǎn)，Gauss等[84]開發(fā)了同步糖化發(fā)酵的方法，已在生物乙醇的生產(chǎn)中被廣泛研究，最近開始用于生物丁醇的生產(chǎn)。

SSF工藝是在一個(gè)容器中同時(shí)進(jìn)行水解和發(fā)酵，水解過(guò)程中產(chǎn)生的糖立即發(fā)酵成丁醇，避免了糖積累對(duì)纖維素酶的抑制，從而提高了酶解效率[85]，獲得更高的丁醇產(chǎn)率[86]，有效降低總操作成本。Dong等[87]以玉米秸稈為原料分別采用SHF工藝和SSF工藝進(jìn)行丁醇發(fā)酵，SSF工藝發(fā)酵得到12.3 g/L丁醇，比SHF工藝發(fā)酵得到的丁醇濃度高出20.6%。另外，Sasaki等[88]以木屑為原料，通過(guò)SSF工藝獲得了100%的ABE轉(zhuǎn)化率。

但是，SSF工藝也有一定的缺點(diǎn)，即酶解和發(fā)酵過(guò)程的最佳溫度不同，這可能導(dǎo)致酶解或發(fā)酵效果不佳。Qureshi等[89]評(píng)估了在35 ℃、pH 6.8條件下，利用稀酸預(yù)處理的小麥秸稈生產(chǎn)ABE的同步糖化發(fā)酵工藝，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，SSF工藝生產(chǎn)的ABE質(zhì)量濃度為12 g/L，而SHF工藝生產(chǎn)的ABE質(zhì)量濃度為13 g/L，產(chǎn)生這樣的結(jié)果是由于酶解產(chǎn)糖速度低于梭菌消耗糖的速度。因此，該研究提出了改進(jìn)SSF工藝的方法，即在較高溫度和較低pH下進(jìn)行SSF，使環(huán)境有利于纖維素酶水解。此外，Guan等[90]發(fā)現(xiàn)，在SSF的過(guò)程中，隨著固載量的增加，發(fā)酵液因變得黏稠而產(chǎn)生了“固體效應(yīng)”，這會(huì)使得發(fā)酵效果變差，丁醇得率大大降低。在SSF工藝中，為實(shí)現(xiàn)溶劑產(chǎn)量最大化，使用50 g/L的固載量為最佳，當(dāng)固載量增加到70 g/L時(shí)，會(huì)由于酶水解受到阻礙而使得丁醇產(chǎn)量下降，由此可知，很難利用SSF工藝得到高濃度的溶劑[90]。

SSCF工藝是SSF的改進(jìn)，這個(gè)過(guò)程通常需要通過(guò)對(duì)菌株進(jìn)行基因改造，使其可以同時(shí)利用葡萄糖和戊糖，提高酶解發(fā)酵效率，也可以同時(shí)使用幾種菌株進(jìn)行共發(fā)酵來(lái)提高糖利用率。SSCF工藝大多是用于生物乙醇的發(fā)酵中，Jafari等[91]首次評(píng)估了SSCF工藝對(duì)溶劑產(chǎn)量的影響，對(duì)比了同步糖化發(fā)酵和同步糖化共發(fā)酵生產(chǎn)溶劑的效果，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與SSF相比，SSCF工藝使溶劑產(chǎn)量增加了27%～36%。

3 生物丁醇的研究進(jìn)展

3.1 生物丁醇的主要瓶頸

盡管ABE發(fā)酵是最古老的大規(guī)模發(fā)酵過(guò)程之一，但目前仍面臨許多困難。首先，產(chǎn)溶劑梭菌可以發(fā)酵各種己糖和戊糖，但其優(yōu)先利用的底物是葡萄糖，對(duì)其他糖類的利用率較低。如前所述，生物丁醇可由不同種類的原料生產(chǎn)得到，但由于它們含糖的種類不同，菌株很難有效地利用水解液中所有的可發(fā)酵糖，這使得丁醇產(chǎn)率較低。其次，盡管預(yù)處理大大提高了酶解效率，是將可再生生物質(zhì)轉(zhuǎn)化為生物丁醇的重要步驟，但是在預(yù)處理時(shí)會(huì)產(chǎn)生一些降解副產(chǎn)物，作為纖維素酶和發(fā)酵菌株的抑制物，這些副產(chǎn)物積累到一定程度會(huì)給整個(gè)過(guò)程帶來(lái)不利的影響。再次，丁醇對(duì)宿主細(xì)胞的毒性較高，積累到一定程度會(huì)導(dǎo)致微生物自溶，據(jù)報(bào)道，菌株以可再生生物質(zhì)作為原料發(fā)酵產(chǎn)生的總?cè)軇┵|(zhì)量濃度通常僅有20 g/L左右[92]，Ezeji等[93]也發(fā)現(xiàn)，在反應(yīng)器中，當(dāng)總?cè)軇┵|(zhì)量濃度高于16 g/L時(shí)，細(xì)胞的生長(zhǎng)開始受到抑制。最后，在傳統(tǒng)的ABE發(fā)酵中，副產(chǎn)物丙酮、乙醇和有機(jī)酸的產(chǎn)生也影響了丁醇生產(chǎn)的經(jīng)濟(jì)性，分離這幾種產(chǎn)品會(huì)增加成本。因此，針對(duì)這些丁醇生產(chǎn)的瓶頸，常利用菌株改造和丁醇分離這2種方法來(lái)提高丁醇產(chǎn)量。

3.2 菌株改造

3.2.1 提高菌株對(duì)底物的利用

用于生產(chǎn)丁醇的原料中大多含有不同種類的己糖和戊糖，針對(duì)這些原料進(jìn)行菌株適應(yīng)性改造有助于提高糖的利用率和丁醇產(chǎn)量。Li等[94]用低能離子束和N-甲基-N-硝基-N-亞硝基胍對(duì)C.beijerinckiiL175進(jìn)行誘變后分離出突變菌株MUT3，并以甘蔗糖蜜作為底物進(jìn)行丁醇發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)MUT3可有效利用底物中的葡萄糖、果糖和蔗糖，且丁醇質(zhì)量濃度最大能達(dá)到14.9 g/L。此外，在最近的研究中，Zhang等[95]構(gòu)建的基因工程菌株C.tyrobutyricumCt(Δack)-pscrBAK在以甘蔗汁為底物的發(fā)酵中表現(xiàn)出對(duì)蔗糖的高利用率。對(duì)于木質(zhì)生物質(zhì)和農(nóng)業(yè)廢棄物來(lái)說(shuō)，其主要的單糖單元為葡萄糖和木糖，由于產(chǎn)溶劑梭菌對(duì)木糖的利用率較低，因此需要提高菌株對(duì)木糖的利用率。Gu等[96]通過(guò)破壞C.beijerinckii中編碼D-木糖阻遏物XylR的基因cbei2385使得D-木糖的消耗顯著增加。Xiao等[97]將C.acetobutylicumATCC 824中編碼D-木糖質(zhì)子同向轉(zhuǎn)運(yùn)體、D-木糖異構(gòu)酶和木酮糖激酶的基因cac1345、cac2610和cac2612過(guò)表達(dá)后，對(duì)D-葡萄糖、D-木糖和L-阿拉伯糖的混合物進(jìn)行發(fā)酵，得到的總?cè)軇┍纫吧途旮吡?4%。這些策略都使得梭菌更適合利用木質(zhì)纖維素材料生產(chǎn)丁醇。對(duì)于海洋大型藻類來(lái)說(shuō)，它們含有一些不被梭菌利用的糖成分，如L-鼠李糖、半乳糖和3,6-脫水-L-半乳糖，這些糖是綠色和紅色大型藻類的主要成分，因此必須通過(guò)代謝工程來(lái)克服這一障礙，但目前相關(guān)的研究還比較少。

3.2.2 提高菌株對(duì)丁醇的耐受性

為了克服丁醇對(duì)宿主細(xì)胞的高毒性，已經(jīng)在產(chǎn)溶劑梭菌中嘗試了各種代謝工程策略。熱激蛋白(HSP)，也稱為分子伴侶，是細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)相關(guān)的重要蛋白，在蛋白質(zhì)的合成、轉(zhuǎn)運(yùn)、折疊和降解中發(fā)揮重要作用。HSP的表達(dá)可以由很多種應(yīng)激物誘導(dǎo)，包括溶劑和其他生物體內(nèi)的有毒化學(xué)物質(zhì)[98-101]。熱激蛋白的過(guò)表達(dá)使得菌株在應(yīng)激狀態(tài)下具有更高的存活率。在丙酮丁醇梭菌中，groESL過(guò)表達(dá)將丁醇脅迫引起的生長(zhǎng)抑制降低了85%，細(xì)胞代謝時(shí)間延長(zhǎng)了2.5倍[102]。在后續(xù)工作中，Tomas等[101]又證明當(dāng)細(xì)胞受丁醇脅迫時(shí)，groESL過(guò)表達(dá)會(huì)使得其他幾種HSP編碼基因的表達(dá)增加，包括dnaKJ、hsp18和hsp90。此外，Spo0A是一種反應(yīng)調(diào)節(jié)因子，可作為基因表達(dá)的激活因子和抑制因子，Alsaker等[99]發(fā)現(xiàn)spo0A過(guò)表達(dá)使得與應(yīng)激反應(yīng)相關(guān)的一些基因表達(dá)上調(diào)，菌株響應(yīng)丁醇脅迫的耐受性增加且代謝時(shí)間延長(zhǎng)。Zhu等[103]通過(guò)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在培養(yǎng)基中添加谷胱甘肽可以提高細(xì)胞的存活率，提出了另一種基因改造的方法，即引入大腸桿菌gshAB基因，使得C.acetobutylicumDSM1731產(chǎn)生谷胱甘肽，以此來(lái)賦予宿主菌株更強(qiáng)的丁醇耐受性。為了解決丁醇耐受性的問(wèn)題，還有一些研究直接轉(zhuǎn)向其他具有較高丁醇耐受性的菌株，以它們作為平臺(tái)宿主來(lái)異源表達(dá)生物丁醇相關(guān)的基因。迄今為止，已開發(fā)出許多非天然丁醇生產(chǎn)菌株，如大腸桿菌[104-105]、釀酒酵母[106]和短乳桿菌[94]等。

3.2.3 提高菌株產(chǎn)丁醇的比例

開發(fā)高丁醇比例或僅含丁醇的產(chǎn)溶劑梭菌可以顯著改善ABE發(fā)酵的經(jīng)濟(jì)性，一些研究希望通過(guò)敲除產(chǎn)丙酮和酸途徑的相關(guān)基因，或是過(guò)表達(dá)與產(chǎn)丁醇相關(guān)的一些基因，來(lái)提高梭菌產(chǎn)丁醇的比例。例如，adc、ctfA和ctfB這3個(gè)基因在丙丁梭菌中負(fù)責(zé)將乙酰乙酰-CoA轉(zhuǎn)化為丙酮，在ctfA、ctfB和adc單敲除突變體中完全沒(méi)有丙酮的形成也證實(shí)了這點(diǎn)[107-110]。然而，在ctfA、ctfB和adc單敲除突變體發(fā)酵實(shí)驗(yàn)中，丁醇產(chǎn)量也減少，而乙酸和丁酸產(chǎn)量則增加，這表明丙酮生成途徑對(duì)酸重吸收起到重要作用。Jiang等[108]破壞了工程菌株C.acetobutylicumEA 2018中的adc基因后，丙酮產(chǎn)量?jī)H有0.21 g/L，再通過(guò)調(diào)節(jié)pH和添加甲基紫精的手段控制電子流向，使得菌株產(chǎn)丁醇的比例達(dá)到82%。另外，還有一些研究是通過(guò)敲除與產(chǎn)乙酸和丁酸的相關(guān)基因來(lái)提高菌株產(chǎn)丁醇的比例，這些基因分別是pta、ack、ptb和buk。Jang等[111]發(fā)現(xiàn)pta和buk單敲除突變體發(fā)酵的丁醇質(zhì)量濃度為17.2和15.2 g/L，與野生型C.acetobutylicumATCC 824的11.8 g/L相比，產(chǎn)量有所增加。Shao等[112]發(fā)現(xiàn)buk單敲除也可以提高丁醇產(chǎn)量，基于這個(gè)事實(shí)，Jang等[111]將pta和buk同時(shí)敲除，發(fā)現(xiàn)丁醇占總?cè)軇┑谋壤岣叩?.8，丁醇濃度進(jìn)一步提高。

3.3 丁醇分離

丁醇分離通常采用發(fā)酵分離耦合的方法，在發(fā)酵的同時(shí)將丁醇分離出來(lái)，一方面可以得到高濃度丁醇，另一方面可以將丁醇從發(fā)酵液中移除，減輕丁醇對(duì)微生物的毒性，從而提高丁醇產(chǎn)量。目前常用的丁醇分離方法主要有吸附、氣提、液-液萃取和滲透汽化等。

吸附是指液體或氣體混合物的其中一種顆粒優(yōu)先附著在固體表面的過(guò)程，介孔碳、活性炭、大孔吸附樹脂、高二氧化硅沸石和硅沸石等都可以吸附丁醇，從而達(dá)到回收的目的[113-116]。最近，Xue等[117]開發(fā)了一種有效的方法，將細(xì)胞固定在纖維基質(zhì)中，并用活性炭吸附丁醇，在整個(gè)原位吸附發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)生了54.6 g/L丁醇，通過(guò)熱解吸得到含約167 g/L丁醇的冷凝物。雖然吸附具有高選擇性和易操作性，但當(dāng)吸附劑重復(fù)使用時(shí)，細(xì)菌和培養(yǎng)基中的營(yíng)養(yǎng)成分會(huì)吸附在吸附劑上，導(dǎo)致吸附效率的降低。

氣提是通過(guò)鼓泡將氣體介質(zhì)釋放到生物反應(yīng)器或塔中，然后通過(guò)冷凝器的冷凝從發(fā)酵液中回收揮發(fā)性溶劑的方法。代表性研究是采用間歇式氣提在補(bǔ)料分批發(fā)酵中產(chǎn)生高濃度的丁醇[118]，在此研究中，發(fā)酵共產(chǎn)生113.3 g/L丁醇與172 g/L 總?cè)軇?dāng)發(fā)酵液中丁醇質(zhì)量濃度大于8 g/L時(shí)進(jìn)行氣提，自發(fā)相分離后最終產(chǎn)物中含有大于600 g/L的丁醇。此外，發(fā)酵時(shí)產(chǎn)生的H2和CO2可以經(jīng)回收后用到氣提中，并在生物反應(yīng)器和冷凝器之間的閉合回路中循環(huán)利用[93]。與其他分離技術(shù)相比，氣提具有操作簡(jiǎn)單、成本低，效率不會(huì)因生物質(zhì)的堵塞而受影響的優(yōu)點(diǎn)[93,119]。但是，氣提過(guò)程中需要防止氣泡過(guò)多或其直徑太大而影響傳質(zhì)效果。

液-液萃取是使萃取劑與發(fā)酵液接觸，通過(guò)分配系數(shù)的不同而使目標(biāo)產(chǎn)物溶解在萃取劑中的一種方法。許多萃取劑，如油醇[120]、生物柴油[121]、癸醇[122]和甲基化粗棕櫚油[123]，已經(jīng)被用來(lái)從水溶液或發(fā)酵液中提取ABE。在各種萃取劑中，油醇的分配系數(shù)相對(duì)較高且對(duì)微生物無(wú)毒性。當(dāng)以木薯為原料用C.acetobutylicumATCC824發(fā)酵時(shí)，使用油醇作為萃取劑產(chǎn)生了35.9 g/L丁醇[124]。原位萃取發(fā)酵是最節(jié)能的一種工藝，但是由于分配系數(shù)低，萃取相中的丁醇濃度通常遠(yuǎn)低于使用其他技術(shù)回收得到的丁醇濃度。此外，在發(fā)酵過(guò)程中直接提取丁醇可能會(huì)形成乳液并產(chǎn)生萃取劑結(jié)垢的問(wèn)題，導(dǎo)致不完全的相分離和發(fā)酵液污染。

滲透汽化是建立在膜分離技術(shù)基礎(chǔ)上的，進(jìn)料溶液直接與膜的選擇性層接觸，然后將滲透物在冷阱中冷凝回收。很多研究者已經(jīng)評(píng)估了各種聚合物膜的丁醇回收效率，其中聚二甲基硅氧烷(PDMS)復(fù)合膜由于其超疏水性、良好的熱穩(wěn)定性和力學(xué)穩(wěn)定性而被廣泛研究[125-127]。許多研究希望通過(guò)制造疏水性填料混合的復(fù)合膜或多層復(fù)合膜來(lái)改善膜性能。例如，Xue等[128]發(fā)現(xiàn)當(dāng)沸石混合的PDMS膜整合在發(fā)酵系統(tǒng)中用于丁醇回收時(shí)，丁醇產(chǎn)量提高至34.5 g/L，回收后得到含有169.6 g/L丁醇的冷凝物。在最新的研究中，Yang等[129]開發(fā)出了垂直定向兩端開口的碳納米管-聚二甲基硅氧烷復(fù)合膜，有效提高了乙醇和丁醇的分離效率。滲透汽化被認(rèn)為是丁醇回收最具潛力的方法，因?yàn)樗哂懈叻蛛x因子且對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)沒(méi)有影響，但生物分子、培養(yǎng)基組分和細(xì)胞會(huì)引起膜污染，導(dǎo)致滲透汽化性能的降低。

最近，汽化滲透過(guò)程開始被提出，這個(gè)過(guò)程是在生物反應(yīng)器中通過(guò)氣提將揮發(fā)性溶劑以蒸汽的形式選擇性地滲透過(guò)分離膜，實(shí)現(xiàn)與水脫離，獲得目標(biāo)產(chǎn)物。Xue等[130]在ABE發(fā)酵期間利用汽化滲透，對(duì)含有約10 g/L丁醇和17 g/L 總?cè)軇┑挠衩捉斩挵l(fā)酵液進(jìn)行原位產(chǎn)物回收，最終獲得含有212.0～232.0 g/L丁醇、86.3～115.5 g/L丙酮和8.3～8.6 g/L乙醇的回收冷凝物，而經(jīng)滲透汽化過(guò)程回收的冷凝物中僅含有71.5～77.4 g/L丁醇，35.0～39.8 g/L丙酮和6.3～6.7 g/L乙醇。當(dāng)使用相同的膜時(shí)，汽化滲透過(guò)程對(duì)ABE溶劑的選擇性比滲透汽化更高，它更像是氣提和滲透汽化的組合，使ABE回收更加高效[130]。

4 展望

生物丁醇具有潔凈、熱值高和腐蝕性小等特點(diǎn)，是最具前景的可再生生物燃料。由于木質(zhì)纖維素難分解、預(yù)處理產(chǎn)生的發(fā)酵抑制物和丁醇毒性等問(wèn)題使得生產(chǎn)成本較高、丁醇產(chǎn)量較低。其中，預(yù)處理的能量消耗是丁醇生產(chǎn)成本較高的主要原因，至今仍未開發(fā)出環(huán)保、經(jīng)濟(jì)、有效的預(yù)處理方法，為了尋求適當(dāng)?shù)念A(yù)處理策略，未來(lái)研究的重點(diǎn)應(yīng)集中在以下幾個(gè)方面。首先，應(yīng)盡可能減少能量輸入，減少化學(xué)品和水的使用；其次，開發(fā)清潔的去木質(zhì)素劑，最大程度保留己糖和戊糖；最后，減少糠醛、5-HMF和乙酸等發(fā)酵抑制物的產(chǎn)生，避免增加脫毒環(huán)節(jié)。此外，盡管各種丁醇分離技術(shù)可以減輕丁醇的抑制作用并提高產(chǎn)率，但設(shè)施的建造和分離過(guò)程中能量的消耗都會(huì)增加丁醇的生產(chǎn)成本。因此，菌株改造成為降低成本的關(guān)鍵。一方面，提高菌株對(duì)碳源利用，尤其是對(duì)戊糖的利用，來(lái)提高原料利用率；第二方面，開發(fā)出穩(wěn)健的丁醇高產(chǎn)菌種，同時(shí)將經(jīng)典ABE發(fā)酵轉(zhuǎn)化為單一丁醇產(chǎn)品的發(fā)酵，可減少不必要的碳流失，有效提高原料轉(zhuǎn)化率；第三方面，提高菌株對(duì)發(fā)酵抑制物和丁醇的耐受性，開發(fā)適用于無(wú)需脫毒處理的纖維素料液的生產(chǎn)菌株，節(jié)約能耗并減少?gòu)U水產(chǎn)生?？傮w而言，生物丁醇的煉制工藝需要適當(dāng)整合預(yù)處理方法、菌株改造和丁醇分離技術(shù)，通過(guò)大量的協(xié)調(diào)研究進(jìn)行優(yōu)化，從而獲得高產(chǎn)量、高濃度的生物丁醇以及增值副產(chǎn)品。