李 丹，梁錫宏，李政威，金 垚，吳重德，周榮清

(四川大學(xué) 輕紡與食品學(xué)院 皮革化學(xué)與工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 成都 610065)

目前，最常用的脫氮方法是在好氧條件下利用自養(yǎng)菌進(jìn)行硝化，在厭氧條件下利用異養(yǎng)菌進(jìn)行反硝化[1]。然而，獨(dú)立的硝化反硝化池占地面積大、耗時(shí)長(zhǎng)、花費(fèi)高，且操作不便[2]。同時(shí)，由于自養(yǎng)硝化菌生長(zhǎng)緩慢，易受高濃度的氨、有機(jī)物和其他化學(xué)元素的影響，使得硝化成為了脫氮過(guò)程的限速步驟[3]。近年來(lái)，研究人員從環(huán)境中分離獲得了異養(yǎng)硝化-反硝化菌[4-6]，這些異養(yǎng)菌比自養(yǎng)菌生長(zhǎng)更快，能夠利用有機(jī)物作為碳源，同時(shí)在好氧條件下將含氮物質(zhì)轉(zhuǎn)變成N2。在同一個(gè)反應(yīng)器中進(jìn)行硝化-反硝化可以降低操作費(fèi)用，提高氮的去除率，而對(duì)同步異養(yǎng)硝化-好氧反硝化菌研究的不斷深入，能為更好地實(shí)現(xiàn)同步硝化-反硝化提供更多的理論和實(shí)踐依據(jù)[7]。

活性污泥胞外聚合物(EPS)來(lái)源于細(xì)胞的分泌溶解、大分子水解以及廢水中吸附的有機(jī)物[8]，對(duì)活性污泥的形成、污泥絮體結(jié)構(gòu)、脫水沉降性能以及重金屬的吸附具有重要的影響[9]。據(jù)報(bào)道，EPS還會(huì)與水體中的各種元素發(fā)生生物、化學(xué)和物理反應(yīng)，如配位、吸附、吸收和絮凝反應(yīng)等，對(duì)研究水體與生物之間物質(zhì)輸送和交換的途徑具有重要影響[10]。此外，胞外聚合物還能提高微生物對(duì)重金屬的抗性和吸附[11]。目前，對(duì)菌體胞外聚合物的研究多集中在人體口腔微生物[12]和益生菌等腸道微生物[13]，而針對(duì)硝化-反硝化菌EPS的研究很少。此外，硝化反硝化菌EPS是硝化池和反硝化池中活性污泥能否形成絮凝體的關(guān)鍵。

本文中，筆者研究了1株脫氮菌的硝化反硝化性能和自聚集性能，并對(duì)其產(chǎn)生絮凝性的胞外聚合物特性進(jìn)行研究，以期為未來(lái)的硝化反硝化菌胞外聚合物研究提供重要參考。

1 材料與方法

1.1 菌株

克雷伯氏菌(Klebsiellasp.TN-10)，從制革廢水中篩選得到，保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號(hào)為CCTCC NO:M2017193。

1.2 培養(yǎng)基及菌種培養(yǎng)

硝化培養(yǎng)基(g/L)：丙酮酸鈉7、(NH4)2SO40.5、NaCl 1、MgSO40.5、EDTA 0.8、FeSO40.4、K2HPO41；pH 7.0。

反硝化培養(yǎng)基Ⅰ(g/L)：丙酮酸鈉7、NaNO30.5、NaCl 1、MgSO40.5、EDTA 0.8、FeSO40.4、K2HPO41；pH 7.0。

反硝化培養(yǎng)基Ⅱ(g/L)：丙酮酸鈉7、NaNO20.5、NaCl 1、MgSO40.5、EDTA 0.8、FeSO40.4、K2HPO41；pH 7.0。

從甘油管中將菌種TN-10接種到含50 mL培養(yǎng)基的三角瓶中，在150 r/min、30 ℃條件下培養(yǎng)12 h，將種子液按1%(體積分?jǐn)?shù))接種量接種到100 mL的上述培養(yǎng)基中，在150 r/min、30 ℃的搖床中進(jìn)行培養(yǎng)。

1.3 硝化-反硝化能力測(cè)定

菌體反硝化性能的測(cè)定：將TN-10接種到反硝化培養(yǎng)基Ⅰ和Ⅱ中，培養(yǎng)條件同上，間隔8 h取樣，用同樣的方式處理樣品，測(cè)定TN-10在反硝化培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)和氮的降解情況。

1.4 自聚集性能測(cè)定

將活化12 h的種子液按照體積分?jǐn)?shù)1%的接種量接種到硝化培養(yǎng)基中，分別收集培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期、穩(wěn)定期和衰亡期的發(fā)酵液。將樣品在10 000 r/min、4 ℃下離心5 min，去除上清液，并用H3PO4緩沖液(PBS)清洗2次，重懸到PBS中，調(diào)整菌體OD600至0.6。將30 mL菌懸液放入50 mL離心管中，每間隔1 h取樣，測(cè)定上清液的OD600，菌體的自聚集性計(jì)算可以采用式(1)[14]。

自聚集性=(1-At)/A0×100%

(1)

式中：At為t時(shí)刻的OD600；t分別為1、2、3、4和5 h；A0為0時(shí)刻的吸光值。

菌體的聚集過(guò)程可以看成是可逆的化學(xué)反應(yīng)。使用偽一級(jí)動(dòng)力學(xué)方程來(lái)描述[15]，見(jiàn)式(2)。

At=Ae(1-e-tk1)

(2)

式中：k1=h-1；Ae代表平衡時(shí)的自聚集性；At表示t時(shí)刻的OD600，與式(1)一致。

1.5 胞外聚合物(EPS)的提取與測(cè)定

采用陽(yáng)離子交換樹(shù)脂法對(duì)菌體胞外聚合物進(jìn)行提取。將40 mL在硝化培養(yǎng)基中培養(yǎng)12 h的菌體在10 000 r/min、4 ℃下離心5 min，棄上清液，收集菌體。使用超純水將菌體洗滌2遍并重懸到超純水中。將細(xì)胞懸液放入250 mL三角瓶中并加入一定量的樹(shù)脂(每克干菌體中加70 g樹(shù)脂)。將三角瓶放入搖床培養(yǎng)，在150 r/min條件下提取8 h后，離心收集上清液并過(guò)0.45 μm濾膜，測(cè)定EPS提取液中的蛋白和多糖含量，胞外聚合物的含量以蛋白質(zhì)和多糖含量表征[16]。多糖的測(cè)定采用蒽酮-H2SO4法[17]，蛋白質(zhì)的測(cè)定采用改良的BCA法[18]。

1.6 傅里葉紅外光譜分析

將EPS提取液使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮，在冷凍干燥儀中進(jìn)行冷凍干燥，得到干燥的固體結(jié)晶。使用傅里葉紅外光譜儀對(duì)EPS組成進(jìn)行分析。干燥的EPS與溴化鉀按1∶ 100(質(zhì)量比)混勻，在瑪瑙研缽中研磨，并放入壓片機(jī)進(jìn)行壓片后，用Nicolet380型傅里葉紅外光譜儀(美國(guó)THERMO Fisher Scientific)對(duì)樣品進(jìn)行掃描，分辨率為0.4 cm-1，測(cè)定波數(shù)范圍為4 000～400 cm-1。

1.7 蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的測(cè)定與分析

使用J-715型圓二色光譜儀(JASCO公司)對(duì)EPS溶液進(jìn)行掃描。掃描范圍為190～250 nm，在1 mm石英比色皿中以超純水做空白，每間隔1 nm記錄一次數(shù)據(jù)。使用CD pro程序包中的SELON和CONTIN處理CD譜數(shù)據(jù)，計(jì)算蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)[19]。

2 結(jié)果與討論

2.1 TN-10的硝化-反硝化能力

圖1 TN-10的硝化-反硝化性能Fig.1 The nitrifying-denitrifying characteristics of TN-10

2.2 自聚集性能

為了解菌體的自聚集性能，筆者測(cè)定了菌體的生長(zhǎng)曲線(xiàn)和在不同生長(zhǎng)周期的自聚集性能變化情況，結(jié)果如圖2所示。由圖2(a)可知：TN-10從4 h起進(jìn)入對(duì)數(shù)期，在24 h到達(dá)穩(wěn)定期，從32 h開(kāi)始進(jìn)入衰亡期。收集處于12 h(對(duì)數(shù)期)、24 h(穩(wěn)定期)和36 h(衰亡期)的菌體，測(cè)定菌體的自聚集率。由圖2(b)可知：TN-10表現(xiàn)出較好的自聚集性，其自聚集率達(dá)到20%左右，但在不同時(shí)期，菌體的自聚集性無(wú)顯著差異。隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，菌體的自聚集性呈現(xiàn)緩慢增加的趨勢(shì)，到達(dá)衰亡期，菌體的自聚集率最高。這可能是因?yàn)榧?xì)菌在增殖或衰亡時(shí)，會(huì)脫落外膜和釋放周質(zhì)蛋白，衰亡期的細(xì)胞存在因細(xì)胞自融釋放的胞內(nèi)蛋白，使得菌體外的聚合物較對(duì)數(shù)期和穩(wěn)定期多[24]。Wang等[16]研究了Enterobactersp.strain FL在不同時(shí)間的自聚集性，發(fā)現(xiàn)在培養(yǎng)12 h時(shí)自聚集率大約為18%，但隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，自聚集性能逐漸增加，在培養(yǎng)48 h時(shí)，自聚集率能達(dá)到50%。由此可見(jiàn)，菌體的自聚集率與菌體的生長(zhǎng)周期相關(guān)。

圖2 TN-10的生長(zhǎng)曲線(xiàn)與自聚集性能Fig.2 Growth curve and auto-aggregationability of TN-10

菌體的自聚集動(dòng)力學(xué)表明菌體克服靜電排斥后的自聚集能力。本實(shí)驗(yàn)中，筆者對(duì)菌體的自聚集動(dòng)力學(xué)進(jìn)行研究，結(jié)果如圖2(c)所示。由圖2(c)可知：不同時(shí)期的菌體聚集率隨時(shí)間的增加而呈現(xiàn)緩慢上升的趨勢(shì)，但菌體的聚集性在5 h時(shí)還未達(dá)到完全平衡。同時(shí)，從0～5 h，衰亡期菌體的自聚集率始終比對(duì)數(shù)期和穩(wěn)定期菌體的自聚集率高，其原因可能是處在不同時(shí)期的菌體胞外聚合物性質(zhì)不同。不同條件下的菌體聚集動(dòng)力學(xué)也相差較大。Zhang等[25]研究活性污泥的自聚集性發(fā)現(xiàn)，其自聚集率最大為50%左右，在3 h后保持穩(wěn)定。

2.3 胞外聚合物組成

為研究菌體呈現(xiàn)出自聚集性能的原因，對(duì)菌體的胞外聚合物進(jìn)行研究。為避免胞內(nèi)蛋白溢出和細(xì)胞外膜脫落對(duì)菌體胞外聚合物成分測(cè)定的干擾，收集對(duì)數(shù)期的菌體對(duì)其胞外聚合物組成進(jìn)行研究，結(jié)果如表1所示。由于胞外聚合物的主要成分為蛋白質(zhì)、多糖等，測(cè)定蛋白質(zhì)和多糖的含量來(lái)表征EPS[26]。由表1可知：蛋白質(zhì)含量為每克干細(xì)胞中23.84 mg(相當(dāng)于15.11 mg/L)，多糖的含量為每克干細(xì)胞中18.64 mg(11.81 mg/L)，胞外聚合物以蛋白質(zhì)和多糖的總量計(jì)為每克干細(xì)胞中42.48 mg(26.81 mg/L)。TN-10的EPS中的蛋白質(zhì)含量高于多糖含量，蛋白質(zhì)和多糖含量的差異與菌體的生長(zhǎng)特性和絮凝性相關(guān)。很多菌體EPS的多糖含量高于蛋白質(zhì)含量，特別是在活性污泥的研究中，但有部分菌體的蛋白質(zhì)含量高于多糖含量，如Acinetobactersp.YY-5[27]和Brevibacillussp.[26]等。王亮等[28]對(duì)1株白腐真菌(Phanerochaetechrysosporium)的EPS進(jìn)行了研究，結(jié)果表明穩(wěn)定期時(shí)的EPS為125 mg/L，其中蛋白質(zhì)占30%，糖類(lèi)占50%。Wang等[16]研究了1株異養(yǎng)反硝化菌(Enterobactersp.strain FL)的自聚集性能和胞外聚合物的關(guān)系，結(jié)果表明，該菌在12 h的自聚集率為17%左右，提取該菌的EPS發(fā)現(xiàn)，其蛋白質(zhì)含量為每克干細(xì)胞中210 mg，多糖含量為每克干細(xì)胞中10 mg，其原因可能是該菌會(huì)產(chǎn)生較多的胞外酶。

表1 TN-10 EPS 中的蛋白質(zhì)和多糖含量

注：以每克干細(xì)胞質(zhì)量計(jì)。

2.4 胞外聚合物紅外光譜圖

圖3 EPS的紅外特征光譜Fig.3 FT-IR spectra of EPS

圖4 EPS的圓二色譜圖Fig.4 Circular dichroism spectra of EPS

2.5 圓二色譜測(cè)蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)

由于EPS中的蛋白質(zhì)比多糖對(duì)絮凝性起著更重要的作用[16]，而TN-10的EPS溶液中蛋白質(zhì)含量高于多糖含量，使用圓二色譜對(duì)提取的胞外聚合物中蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行研究，結(jié)果如圖4所示。由圖4可知：在208和222 nm處的明顯雙峰是α-螺旋結(jié)構(gòu)的特征峰，β-折疊在195和217 nm處有特征吸收峰，無(wú)規(guī)則卷曲在195 nm處有負(fù)的吸收峰[33]。利用CD pro程序包對(duì)圓二色譜的數(shù)據(jù)進(jìn)行計(jì)算，其結(jié)果見(jiàn)表2。由表2可知：蛋白質(zhì)中α-螺旋結(jié)構(gòu)占主要比例，含量為55.08%。β-折疊和β-轉(zhuǎn)角所占的比例分別為7.31和13.72%。菌體的絮凝性和自聚集能力與β-折疊、α-螺旋和三螺旋結(jié)構(gòu)結(jié)構(gòu)所占的比例成正相關(guān)，但是會(huì)受到無(wú)規(guī)則卷曲和β-反向折疊的抑制[34]。在TN-10的EPS中對(duì)絮凝性起促進(jìn)作用的α-螺旋和β-折疊所占比例之和為62.39%，高于對(duì)絮凝性起抑制作用的無(wú)規(guī)則卷曲所占比例23.89%，這也是TN-10具有良好絮凝性的原因。

表2 EPS中蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)

3 結(jié)論

筆者以1株硝化-反硝化菌Klebsiellasp.TN-10為研究對(duì)象，對(duì)其硝化-反硝化性能進(jìn)行了考察，并對(duì)其絮凝性能進(jìn)行了研究，主要研究結(jié)論如下。

2)研究了菌體的自聚集能力和聚集動(dòng)力學(xué)，發(fā)現(xiàn)菌體在衰亡期的自聚集能力最強(qiáng)。

3)提取TN-10的胞外聚合物，測(cè)定其組成和含量，其中蛋白質(zhì)含量為23.84 mg、多糖含量為18.64 mg(以每克干細(xì)胞質(zhì)量計(jì)算)。

4)測(cè)定了EPS的紅外光譜，并對(duì)EPS溶液中的蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行測(cè)定，其組成為α-螺旋55.08%、β-折疊7.31%、β-轉(zhuǎn)角13.72%和無(wú)規(guī)則卷曲23.89%。