陳震龍，支巧明，匡玉庭

(蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院，江蘇蘇州215000)

結(jié)腸癌的發(fā)生發(fā)展主要與遺傳、炎性腸病、低纖維飲食、大量飲酒、吸煙和肥胖等因素有關(guān)[1]。因?yàn)榄h(huán)境污染、飲食結(jié)構(gòu)不合理、生活壓力大等，近年來(lái)結(jié)腸癌的發(fā)病率呈逐年上升趨勢(shì)，全球每年新發(fā)病例超過(guò)100萬(wàn)[2]。晚期結(jié)腸癌患者5年生存率較低[3]，腫瘤復(fù)發(fā)、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致患者死亡的主要原因[4]。因此探討結(jié)腸癌的轉(zhuǎn)移、侵襲機(jī)制并尋找新的治療靶標(biāo)非常必要。E2F7是近年來(lái)新發(fā)現(xiàn)的非典型E2F轉(zhuǎn)錄因子家族(E2Fs)成員，擁有2個(gè)獨(dú)特的DNA結(jié)合域，而缺乏典型的RB蛋白結(jié)合區(qū)域[5]。研究發(fā)現(xiàn)，E2F7在子宮內(nèi)膜癌[6]、卵巢癌[7]、皮膚鱗狀細(xì)胞癌[8]等多種惡性腫瘤組織中表達(dá)上調(diào)。miRNA-26a可靶向抑制E2F7表達(dá)，以促進(jìn)急性髓性白血病腫瘤細(xì)胞增殖并抑制單核細(xì)胞分化[9]。目前E2F7在結(jié)腸癌中的相關(guān)研究甚少，Liu等[10]發(fā)現(xiàn)敲低E2F7表達(dá)可以逆轉(zhuǎn)全反式維甲酸ATRA和miR-3666抑制劑對(duì)結(jié)直腸癌HCT116細(xì)胞惡性行為的聯(lián)合作用，抑制腫瘤的生長(zhǎng)、侵襲、轉(zhuǎn)移。本研究探討結(jié)腸癌組織中E2F7蛋白表達(dá)變化及其與上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 臨床材料 收集2017年1～12月本院收治的原發(fā)性結(jié)腸癌患者65例，均接受手術(shù)治療，術(shù)中取癌組織經(jīng)病理檢查確診；男34例、女31例，年齡31～82(54.5±10.8)歲；腫瘤高分化22例，中分化15例，低分化28例；TNM分期Ⅰ～Ⅱ期34例，Ⅲ～Ⅳ期31例；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移36例，遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移16例；術(shù)前均未接受輔助放化療及靶向藥物治療。另選取其中15例患者的癌旁正常組織(距腫瘤邊緣>5 cm)作為對(duì)照，男8例、女7例，年齡34～73(53.0±11.1)歲。兩種組織的患者性別、年齡均有可比性。切取的腫瘤組織與癌旁正常組織標(biāo)本均用甲醛固定?；颊呔炇鹬橥鈺?，且本研究獲蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 結(jié)腸癌組織及結(jié)腸正常組織中E2F7、E-cadherin及vimentin蛋白檢測(cè) 采用免疫組化法。組織標(biāo)本經(jīng)固定、石蠟包埋，制成4 μm厚的切片。石蠟切片用二甲苯脫蠟，梯度乙醇水化；用10 mmol/L檸檬酸鹽緩沖液(pH 6.0)進(jìn)行高壓抗原修復(fù)；3% H2O2中浸泡10 min，以消除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶活性；1×PBS洗滌后用10%胎牛血清封閉，37 ℃孵育1 h；滴加稀釋好的一抗，4 ℃過(guò)夜；1×PBS洗滌后用生物素化二抗處理樣品,二氨基聯(lián)苯胺顯像，蘇木素復(fù)染，封片。兔抗人E2F7多克隆抗體購(gòu)于英國(guó)Abcam公司，兔抗人EMT相關(guān)因子(E-cadherin、vimentin)多克隆抗體購(gòu)于美國(guó)Cell Signaling Technology公司，免疫組化試劑盒和DAB顯色試劑盒均訂購(gòu)于上海優(yōu)寧維生物科技股份有限公司，其他試劑和設(shè)備均由蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院中心試驗(yàn)室提供。陽(yáng)性結(jié)果判定：在400倍鏡下每張切片隨機(jī)選取5個(gè)視野進(jìn)行觀察，每個(gè)視野計(jì)數(shù)約100個(gè)細(xì)胞，以胞膜、胞質(zhì)或胞核含棕黃色顆粒判定為表達(dá)陽(yáng)性，并進(jìn)行評(píng)分。細(xì)胞染色強(qiáng)度評(píng)分：細(xì)胞未染色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。陽(yáng)性細(xì)胞比例評(píng)分：陽(yáng)性細(xì)胞比例<5%為0分，5%～25%為1分，26%～50%為2分，>50%為3分。兩項(xiàng)評(píng)分乘積≤2為表達(dá)陰性，>2為表達(dá)陽(yáng)性。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件。采用Mann-WhitneyU檢驗(yàn)比較結(jié)腸癌組織與癌旁正常組織中蛋白陽(yáng)性表達(dá)率，采用四格表卡方檢驗(yàn)或精確概率法分析E2F7蛋白表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系，用Spearman秩相關(guān)分析E2F7與E-cadherin、vimentin蛋白表達(dá)的相關(guān)性。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 結(jié)腸癌組織及結(jié)腸正常組織中E2F7、E-cadherin、vimentin蛋白表達(dá)比較 E2F7蛋白主要定位于細(xì)胞核中，E-cadherin蛋白主要定位于細(xì)胞膜上，vimentin蛋白主要定位于胞質(zhì)中。結(jié)腸癌組織及結(jié)腸正常組織中E2F7蛋白陽(yáng)性表達(dá)率分別為78.5%(51/65)、33.3%(5/15)，E-cadherin蛋白陽(yáng)性表達(dá)率分別為29.2%(19/65)、73.3%(11/15)，vimentin蛋白陽(yáng)性表達(dá)率分別為80%(52/65)、13%(2/15)。與結(jié)腸正常組織比較，結(jié)腸癌組織中E2F7、vimentin蛋白陽(yáng)性表達(dá)率高(P均<0.05)，E-cadherin蛋白陽(yáng)性表達(dá)率低(P<0.05)。

2.2 結(jié)腸癌組織中E2F7蛋白陽(yáng)性表達(dá)與患者臨床病理特征的關(guān)系 結(jié)腸癌組織中E2F7蛋白陽(yáng)性表達(dá)率與腫瘤直徑、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和TNM分期有關(guān)(P均<0.05)，與患者年齡、性別及組織分化程度無(wú)關(guān)(P均>0.05)。見表1。

2.3 結(jié)腸癌組織中E2F7蛋白表達(dá)與E-cadherin、vimentin蛋白表達(dá)的相關(guān)性 Spearman秩相關(guān)分析結(jié)果顯示，結(jié)腸癌組織中E2F7蛋白表達(dá)與E-cadherin蛋白表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(r=-0.39，P=0.001)，與vimentin蛋白表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.53，P<0.01)。

3 討論

研究發(fā)現(xiàn)，E2Fs參與細(xì)胞增殖、分化、凋亡、周期調(diào)控和DNA損傷應(yīng)答過(guò)程。迄今為止，已發(fā)現(xiàn)E2Fs的8個(gè)家族成員(E2F1～8)[11,12]。根據(jù)功能，E2Fs分為轉(zhuǎn)錄激活因子(E2F1～3)和轉(zhuǎn)錄抑制因子(E2F4～8)；根據(jù)其結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，則可分為典型E2Fs(E2F1～6)和非典型E2Fs(E2F7、8)。目前有關(guān)E2Fs成員在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中作用機(jī)制的研究已取得不錯(cuò)進(jìn)展，部分E2Fs成員在腫瘤診斷與治療等方面的臨床價(jià)值已得到肯定[13]。E2F7是近年來(lái)新發(fā)現(xiàn)的非典型E2Fs成員，與典型E2Fs不同，E2F7缺乏與同分化調(diào)控蛋白結(jié)合所需的DIM域以及介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)錄的反式激活結(jié)構(gòu)域，取而代之的是2個(gè)包含異二聚體殘基的非典型DNA結(jié)合域，因此E2F7可通過(guò)非DP蛋白依賴的方式與DNA結(jié)合，以發(fā)揮轉(zhuǎn)錄抑制作用[14,15]。

表1 結(jié)腸癌組織中E2F7蛋白陽(yáng)性表達(dá)與患者臨床病理特征的關(guān)系(例)

有研究認(rèn)為E2F7可通過(guò)抑制增殖相關(guān)miRNA的轉(zhuǎn)錄來(lái)抑制細(xì)胞的增殖能力[16]。但近年來(lái)隨著對(duì)E2F7深入研究，發(fā)現(xiàn)其在許多惡性腫瘤組織中可能發(fā)揮著促癌作用。E2F7在神經(jīng)膠質(zhì)瘤組織中表達(dá)上調(diào)，可作為神經(jīng)膠質(zhì)瘤的獨(dú)立預(yù)后標(biāo)記物[17]。Chu等[18]研究顯示在乳腺癌中過(guò)表達(dá)E2F7可以抑制miR-15a/16轉(zhuǎn)錄，使Cyclin E1和Bcl-2表達(dá)上調(diào)，進(jìn)而增強(qiáng)了乳腺癌細(xì)胞對(duì)他莫昔芬的耐藥性。也有研究表明在非小細(xì)胞肺癌組織中，miR-935可通過(guò)靶向抑制E2F7表達(dá)來(lái)抑制腫瘤的轉(zhuǎn)移和侵襲[19]。在膽囊癌組織中過(guò)表達(dá)E2F7可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的遷移，而抑制E2F7表達(dá)能同時(shí)增加E-cadherin表達(dá)并降低vimentin的表達(dá)，以推動(dòng)EMT過(guò)程[20]。提示E2F7可能參與腫瘤的侵襲和遷移，并影響EMT過(guò)程。

EMT是指上皮細(xì)胞在某些特定條件下發(fā)生轉(zhuǎn)化，失去細(xì)胞極性而獲得侵襲性、運(yùn)動(dòng)性、抗凋亡性等間充質(zhì)細(xì)胞表型特征的生物學(xué)過(guò)程，包含復(fù)雜的分子機(jī)制[21,22]。EMT不僅是胚胎發(fā)育的關(guān)鍵機(jī)制，還在成人慢性炎癥、組織再生、創(chuàng)傷修復(fù)和器官纖維化等生理病理過(guò)程中發(fā)揮重要作用[23]。研究表明，EMT是腫瘤細(xì)胞獲得侵襲能力的關(guān)鍵步驟，與腫瘤的轉(zhuǎn)移和侵襲密切相關(guān)[24]。E-cadherin是典型的上皮細(xì)胞標(biāo)志分子，參與維持細(xì)胞連接。研究表明E-cadherin缺失是EMT過(guò)程的一個(gè)早期事件，會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞急性復(fù)合體的破壞，這是細(xì)胞發(fā)生分裂、侵襲的前提[25]。vimentin是只存在于間質(zhì)細(xì)胞中的細(xì)胞骨架蛋白，其在各種惡性腫瘤中的表達(dá)與腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[26]。E-cadherin和vimentin都是EMT最具代表性的分子標(biāo)志物，E-cadherin表達(dá)失活和vimentin表達(dá)上調(diào)是EMT發(fā)生的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一[27,28]。

本研究發(fā)現(xiàn)，結(jié)腸癌組織中E2F7蛋白陽(yáng)性表達(dá)率明顯高于癌旁正常組織，提示E2F7在結(jié)腸癌組織中呈高表達(dá)；而E-cadherin和vimentin在結(jié)腸癌組織中的表達(dá)也與EMT基因表達(dá)譜相符。E2F7蛋白陽(yáng)性表達(dá)的結(jié)腸癌患者，其腫瘤直徑更大、TNM分期更晚，且更容易發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。表明E2F7可能具有促進(jìn)結(jié)腸癌生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移、侵襲的作用。為進(jìn)一步闡明E2F7參與腫瘤轉(zhuǎn)移和侵襲的作用機(jī)制，分析結(jié)腸癌組織中E2F7與E-cadherin及vimentin蛋白表達(dá)的相關(guān)性，結(jié)果表明E2F7與E-cadherin蛋白表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，而與vimentin蛋白表達(dá)呈正相關(guān)。提示E2F7參與推動(dòng)EMT的發(fā)生。

綜上所述，E2F7在結(jié)腸癌組織中呈高表達(dá)，E2F7高表達(dá)可能促進(jìn)結(jié)腸癌的生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移和侵襲，其對(duì)腫瘤轉(zhuǎn)移侵襲的促進(jìn)可能是通過(guò)EMT過(guò)程來(lái)實(shí)現(xiàn)的，E2F7可能成為結(jié)腸癌治療的新型靶標(biāo)。但本研究收集的樣本數(shù)量有限，需要增加樣本量來(lái)證實(shí)以上結(jié)果，并且E2F7在結(jié)腸癌中的作用通路有待進(jìn)一步闡明。