金湛 甘椿椿 陳高 胡高波 姚水洪

【關鍵詞】告達庭;血管生成

乳腺癌是世界三大最常見癌癥之一，并且是女性發(fā)病率最高的腫瘤。據最新統(tǒng)計，2012年全球約有1700萬人被診斷患有乳腺癌，而每年約有50萬死于乳腺癌。2018年全球乳腺癌新增病例占所有癌癥的11.6%，與肺癌并列第一，死亡人數多達62萬余人。所以乳腺癌的診斷和治療顯得尤為重要。目前對乳腺癌的治療手段主要有手術、放療、化療和內分泌治療等，早期診斷出乳腺癌一般可以治愈，然而乳腺癌仍是導致死亡的重要罪魁禍首，原因可能是由于生活方式改變和缺乏先進的診斷和治療手段。因此尋找和開發(fā)新的、低毒高效的治療乳腺癌藥物已刻不容緩。

從天然產物中發(fā)現(xiàn)新的藥物是新藥開發(fā)項目中的常見的策略，而且有很多藥物都是基于這一方式發(fā)現(xiàn)的，如紫杉醇、喜樹堿、嗎啡等。白首烏為蘿摩科鵝絨藤屬植物耳葉牛皮消（Cynanchumau-riculatumRoyle ex Wight）的干燥塊根，是傳統(tǒng)的補益中藥。中國長期以來自首烏通常被用作功能性食品和滋補劑，常規(guī)治療功效如補肝腎、強筋骨、黑須發(fā)及延年益壽等?，F(xiàn)代藥理研究表明，自首烏具有多種藥理作用，包括抗衰老、抗炎、抗腫瘤，抗氧化，免疫調節(jié)，保肝和脂質調節(jié)作用等。C21甾體苷類化合物通常被認為是自首烏的主要活性成分，研究表明其具有顯著抗腫瘤活性，從自首烏中分離得到的C21甾體苷元告達庭（Caudatin）對人多種腫瘤都具有顯著抑制作用，如胃癌、肝癌、肺癌等。然而在生物體中告達庭通常是以糖苷的形式存在，在我們前期研究中發(fā)現(xiàn)告達庭衍生物，告達庭-3-O-β-D-加拿大麻糖苷（3-O-β-D-cymaropyranoside）對乳腺癌生長具有良好抑制作用。本研究在前期研究基礎上繼續(xù)探討告達庭3-O-β-D-加拿大麻糖苷是否對乳腺癌細胞轉移能力具有抑制作用。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1細胞株：人乳腺癌細胞株MDA-MB-231購自中國科學院上海生命科學研究院細胞資源中心。

1.1.2藥物：告達庭3-O-β-D-加拿大麻糖苷（Ca-G）自制，純度>98%，配制成10mg/ml的母液，溶劑為DMSO，于-20℃分裝保存。

1.1.3試劑：DMEM培養(yǎng)液、胎牛血清購自美國Invitrogen公司;MTT、DMSO購自美國Sigma公司;H&E染色試劑盒、BCA蛋白濃度測定試劑盒購自碧云天公司;anti-cyclin Dl，anti-β-tubulin購自美國Cell Signaling Technology公司。

1.2方法

1.2.1細胞培養(yǎng)：人乳腺癌細胞株MDA-MB-231培養(yǎng)于含10%胎牛血清的完全DMEM/F12培養(yǎng)基中，于37℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，細胞呈貼壁生長，密度達90%左右時進行傳代。

1.2.2MTT法測定細胞活力：收集對數生長期的MDA-MB-231細胞，經胰酶消化并離心后，調整細胞懸液濃度，以3×103個/孔的密度接種于96孔培養(yǎng)板，每孔100μL。置于37℃、5%co恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，待細胞貼壁完全后，加入不同濃度的Ca-G，濃度梯度設置為2.5，5，10，15μg/mL，另外設置溶劑對照組（不加藥，加入DMSO）和空白調零組（只加培養(yǎng)液、不加細胞和藥物），均設4個復孔，繼續(xù)培養(yǎng)24h后，每孔加入5 mg/mL MTT溶液20μL，孵育4h，吸凈孔內液體，每孔加入150μL的DMSO，震蕩10min，使藍紫色結晶物甲瓚充分溶解，用酶標儀于570nm處測各孔吸光度（OD）值，并計算相對細胞存活率。相對細胞存活率（%）=（給藥孔-空白調零孔/對照孔-空白調零孔）×100%。

1.2.3創(chuàng)口愈合：收集對數生長期的MDA-MB-231細胞，經胰酶消化并離心后，調整細胞懸液濃度，接種于6孔培養(yǎng)板中，細胞密度為6×105個/皿，置于37℃、5%C02的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細胞貼壁90%以上后，用200 μ1槍頭沿滅菌尺垂直于孔板制造細胞劃痕。小心吸去細胞培養(yǎng)基，用PBS洗3遍以洗去劃痕產生的細胞碎片。更換成無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)，使細胞處于饑餓狀態(tài)，并加入不同濃度梯度藥物（0，5，10μg/mL）。分別于劃痕0，12，24 h在顯微鏡下拍照記錄創(chuàng)口愈合情況，運用ImageJ軟件計算創(chuàng)口愈合間距和相對創(chuàng)口愈合率（即細胞相對遷移率）。

1.2.4Transwell遷移實驗：收集對數生長期的MDA-MB-231細胞，經胰酶消化并離心后，調整細胞懸液濃度為5×105個/ml。在Transwell小室下室加入500μl含不同藥物濃度（0，5，10μg/mL）的10%FBS的完全培養(yǎng)基。上室加入取100μl細胞懸液。將細胞置于37℃，5%co2及飽和濕度的細胞培養(yǎng)箱中孵育。18h后終止培養(yǎng)，取出小室。用甲醇固定，蘇木素和尹紅各染5min，沖去殘余的染料。Transwell小室在正置顯微鏡下觀察，計算細胞相對遷移率。

1.2.5 westernblot：收集對數生長期的MDA-MB-231細胞，經胰酶消化并離心后，調整細胞懸液濃度，接種于6 cm的培養(yǎng)皿中。待細胞貼壁完全后，加入不同濃度藥物（0，5，10μ/mL），培養(yǎng)箱中孵育24 h后，收集各組細胞。加入適量RIPA裂解液裂解。按照碧云天BCA蛋白含量測定試劑盒說明書檢測樣品蛋白含量，并進行SDS-PAGE電泳、轉膜，封閉，孵育一抗，過夜。并加入二抗，按照ECL顯影液試劑盒說明書，放人化學發(fā)光成像系統(tǒng)，曝光。

1.2.6統(tǒng)計學分析：采用SPSS 12.0軟件進行統(tǒng)計分析，各組數據用均數±標準差（π±s）表示。組間均數的比較均采用t檢驗，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001具有統(tǒng)計學意義。

2結果

2.1 Ca-G對乳腺癌細胞活力的影響如圖1所示，MTT結果顯示不同濃度的Ca-G給藥24 h后，15μg/mL加藥組乳腺癌細胞株的活力明顯降低，而在15μg/mL以下濃度基本無細胞毒作用，故在接下來的實驗中選用5，10μg/mL的濃度作為實驗濃度。

2.2 Ca-G對細胞遷移的影響在Ca-G非細胞毒劑量下本研究檢測了Ca-G對乳腺癌細胞遷移的作用，創(chuàng)口愈合實驗結果如圖2所示，Ca-G能明顯抑制MDA-MB-231細胞向中心遷移，結果說明藥物在一定程度能夠抑制MDA-MB-231細胞遷移。而Transwell遷移實驗結果同樣顯示，在加入Ca-G后，從上室穿到下室的細胞量明顯減少，說明細胞的遷移率明顯下降，以上結果均表明Ca-G能夠抑制MDA-MB-231細胞遷移。

2.3 Ca-G對血管生成關鍵蛋白表達水平的影響大多數腫瘤細胞可產生血管內皮生長因子（VEGF），VEGF一般被認為是參與腫瘤生長最有效的血管生成因子。VEGFR的活化可導致下游信號通路的激活，如磷酸肌醇3-激酶（P13K）/蛋白激酶B（AKT），粘著斑激酶（FAK）。在本研究中，對Ca-G的抗血管生成作用及潛在機制進行了研宄，結果顯示，Ca-G作用后，VEGF、AKT、FAK蛋白表達均有所下降。結果表明，Ca-G通過抑制VEGF/AKT/FAK信號通路顯著抑制乳腺癌細胞血管生成，結果如圖3所示。

3討論

中藥，由于其特殊的藥理活性、低毒性和不易產生耐藥等特點，在癌癥治療中呈現(xiàn)出良好的研究與應用前景。自首烏中C21甾體苷在體內外研究中，均具有良好的抑制腫瘤作用，告達庭作為其中一種苷元也起到一定抗腫瘤作用，但是其在自首烏中的含量較低。告達庭3-O-β-D-加拿大麻糖苷（Ca-G）是以告達庭為苷元形成的一種糖苷類化合物。很少報道其是否具有抗腫瘤作用。課題組前期研究結果發(fā)現(xiàn)Ca-G能夠劑量依賴性地抑制乳腺癌細胞的增殖，能夠抑制MDA-MB-231和MCF-7細胞內cyclin D1的表達，可能與阻滯細胞周期GO/G1期相關。

對于惡性腫瘤，除了表現(xiàn)無限繁殖特征，并且能夠進行局部浸潤和遠端轉移，隨著進一步惡化，可滲入周圍的血管和淋巴管，腫瘤細胞會從這些血管和淋巴管中逃脫，從而進入遠端組織的薄壁組織，在這個過程中不斷地為腫瘤提供必需的營養(yǎng)物質，從而引發(fā)的新血管的形成，并幫助去除代謝廢物。

細胞劃痕是指在體外培養(yǎng)的單層細胞上，劃痕致傷，通過制造體外貼壁細胞創(chuàng)口愈合實驗模型，來觀察腫瘤細胞遷移能力的強弱。本研究通過創(chuàng)口愈合實驗檢測加入Ca-G后MDA-MB-231細胞的創(chuàng)口愈合能力。實驗結果顯示藥物作用后MDA-MB-231細胞的創(chuàng)口愈合速度明顯下降，說明Ca-G一定程度可以抑制乳腺癌細胞的遷移。

TranswelI遷移實驗指用聚碳酸酯膜將高營養(yǎng)培養(yǎng)基和低營養(yǎng)培養(yǎng)基隔開，再將腫瘤細胞放人低營養(yǎng)培養(yǎng)基中，為了得到營養(yǎng)，腫瘤細胞必須穿過膜進入高營養(yǎng)培養(yǎng)基中，而穿過膜進入高營養(yǎng)培養(yǎng)基的細胞數的多少就能反映腫瘤細胞的遷移能力。本研究通過Transwell遷移實驗檢測加入Ca-G后MDA-MB-231細胞的遷移能力的大小。實驗結果顯示，藥物作用后MDA-MB-231細胞遷移能力顯著減弱，說明Ca-G一定程度可以抑制乳腺癌細胞的遷移，本實驗與創(chuàng)口愈合實驗結果相一致。

由腫瘤細胞增殖和遷移引發(fā)的新血管形成稱為血管生成，在腫瘤生長過程中這種血管不斷為腫瘤提供新的營養(yǎng)物質，去除代謝物。如果沒有新血管的形成，腫瘤生長會受到一定限制。因此，血管生成是腫瘤生長的其中一個關鍵步驟，抗血管生成己成為近年來研究腫瘤治療的關鍵方法。血管生成可受到多種生長因子和細胞因子的調節(jié)。在這些因子中產生最多的是血管內皮生長因子（VEGF），VEGF一般被認為是參與腫瘤生長最有效的血管生成因子。VEGF的通過結合受體酪氨酸激酶來刺激腫瘤細胞增殖、遷移和管形成。VEGF受體（VEGFR）活化可導致下游信號通路的激活，如磷酸肌醇3-激酶（P13K）/蛋白激酶B（AKT），粘著斑激酶（FAK）。本文章研究了Ca-G的抗血管生成作用及潛在機制，結果表明，Ca-G通過抑制VEGF/AKT/FAK信號通路顯著抑制乳腺癌細胞遷移。

總之，告達庭3-O-β-D-加拿大 麻糖苷可有效抑制乳腺癌細胞株MDA-MB-231的遷移和血管生成的活性。這為告達庭及其衍生物抗腫瘤轉移和新生血管生成的進一步研究提供一定基礎。