陳 妮, 趙 梅, 陳 玲, 韓鵬定
1.海南醫(yī)學院第二附屬醫(yī)院 藥學部 (海南 570311);2.海南省第三人民醫(yī)院 藥學部(海南 572000)
胃癌是中國發(fā)病率較高的胃腸道惡性腫瘤[1]。盡管胃癌已經(jīng)獲得了有效的治療方法,包括胃鏡檢查、全身化療和靶向藥物治療、手術切除等,但胃癌的預后仍然較差,數(shù)據(jù)[2]統(tǒng)計,胃癌患者的5年總生存率低于30%。小檗胺是來自小檗屬與黃連屬植物中的一種天然化合物,研究[3-7]發(fā)現(xiàn),小檗胺對多種不同的癌癥有明顯的抗腫瘤作用。熱療是將腫瘤區(qū)域利用合適的熱源加熱至41~43 ℃并保持一定時間,從而達到抑制腫瘤作用的一種方法。在臨床上,單純熱療對腫瘤的抑制作用效果不明顯。最新研究[8]發(fā)現(xiàn),熱療與抗腫瘤藥物聯(lián)合使用,可促進抗腫瘤藥物的抗腫瘤效果。本研究通過探討小檗胺聯(lián)合熱療對人胃癌順鉑耐藥細胞(SGC-7901/DPP)增殖的影響, 研究其潛在的分子機制。
胎牛血清和達爾貝科極限必需培養(yǎng)液(dulbecco minimum essential medium,DMEM)培養(yǎng)液購于Thermo Fisher Scientific公司;四甲基偶氮唑鹽(MTT)試劑以及小檗胺化合物購于Sigma公司;SGC-7901/DPP細胞株購買于上海中科院細胞庫;蛋白質(zhì)印跡技術(Western blot)實驗相關抗體購于Abcam公司。膜連蛋白 V-異硫氰酸熒光素/碘化丙啶(Annexin V-FITC/PI)凋亡試劑盒購于北京碧云天生物科技有限公司。
SGC-7901/DPP細胞培養(yǎng)于DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)(培養(yǎng)液含有10%的胎牛血清、0.1 U/L青霉素和100 g/L鏈霉素);培養(yǎng)條件為:細胞培養(yǎng)箱內(nèi)(37 ℃,5% CO2)常規(guī)培養(yǎng)。
細胞根據(jù)不同的處理方式分為:1)對照組:SGC-7901/DPP細胞于培養(yǎng)箱中進行常規(guī)培養(yǎng);2)熱療組: 利用恒溫43 ℃處理SGC-7901/DPP細胞48 h;3)小檗胺組:利用小檗胺(16 mg/L) 處理SGC-7901/DPP細胞48 h; 4)小檗胺聯(lián)合熱療組:小檗胺(16 mg/L)聯(lián)合恒溫43 ℃處理SGC-7901/DPP細胞48 h。
SCG-7901/DPP細胞(1×104個/孔)于96孔板中接種, 培養(yǎng)24 h 后用不同濃度的小檗胺(0~64 mg/L)或者按照1.3分組處理細胞,于48 h后在96孔板中每孔加入20 μL MTT,繼續(xù)培養(yǎng)4 h 后于每孔加入150 μL二甲基亞砜(DMSO), 在570 nm 波長處測定吸光度A值, 抑制率/%=(570 nmA值:對照組-570 nmA值:實驗組)/570 nmA值:對照組×100%。
細胞按照1.3分組處理48 h后,SGC-7901/DPP細胞于6 孔培養(yǎng)板接種,連續(xù)培養(yǎng)10 d,每隔3 d更換1 次培養(yǎng)基,每組3個復孔。于10 d后, 將細胞利用75%乙醇固定,然后利用0.5%結(jié)晶紫染色。顯微鏡下觀察拍照,并計算集落數(shù)量。
細胞按照1.3分組處理48 h后, 用PBS洗滌SGC-7901/DPP細胞,將細胞利用70% 冷乙醇固定后,與RNA 酶反應過夜,然后將反應的細胞與碘化丙啶染液混勻后, 細胞分析采用流式細胞儀,激發(fā)波長為488 nm,細胞凋亡率采用Modfit LT 2.0 軟件分析。
細胞按照1.3分組處理48 h后, 利用含有蛋白酶抑制劑(RIPA)緩沖液裂解SGC-7901/DPP細胞進行蛋白的提取。 蛋白濃度的測定采用BCA蛋白濃度測定試劑盒進行。 將等量總蛋白(20 g)利用10% SDS-PAGE凝膠電泳, 然后利用半干法將電泳蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜,PVDF膜于室溫利用TBST溶液(含有5%脫脂奶粉) 封閉1 h,TBST 洗滌,然后與不同的一抗于4 ℃冰箱孵育過夜。 將冰箱孵育過夜的PVDF膜利用TBST洗滌3 次之后,與辣根果氧化物酶標記的二抗于室溫孵育1 h,利用ECL試劑盒曝光顯影。
利用不同濃度的小檗胺(0~64 mg/L)處理SGC-7901/DPP細胞48 h 后, MTT實驗檢測SGC-7901/DPP 細胞活性,發(fā)現(xiàn)小檗胺在16 mg/L時,對SGC-7901/DPP 細胞增殖抑制達到了(21.3±3.1)%,隨著濃度的升高,小檗胺對SGC-7901/DPP細胞增殖的抑制沒有明顯提高,抑制率分別為 (22.5±5.6)%和(23.5±4.5)% 。因此本研究選擇了16 mg/L 小檗胺作為后續(xù)的聯(lián)合熱療實驗(表1)。
表1 小檗胺對SGC-7901/DPP細胞增殖的影響
MTT實驗結(jié)果顯示,與對照組相比,單獨熱療處理或者單獨小檗胺 (16 mg/L)處理可抑制SGC-7901/DPP細胞增殖,抑制率分別為(17.2 ± 4.5)%和(23.3 ± 6.0)%;小檗胺聯(lián)合熱療處理SGC-7901/DPP細胞可進一步抑制細胞增殖,抑制率為(70.9 ± 7.5)%,與單獨熱療組或者小檗胺組相比差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。集落形成實驗結(jié)果顯示,與對照組相比,單獨熱療處理或者單獨小檗胺 (16 mg/L)處理可以抑制SGC-7901/DPP細胞的集落形成數(shù)量,抑制率分別為30.3%和37.0%;小檗胺聯(lián)合熱療處理SGC-7901/DPP細胞可進一步抑制細胞的集落形成數(shù)量,抑制率為72.6%,與單獨熱療組或小檗胺組相比,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。流式細胞技術實驗結(jié)果顯示,與對照組相比,單獨熱療處理或者單獨小檗胺 (16 mg/L)處理可以增加SGC-7901/DPP細胞的凋亡比例,凋亡率增加分別為(21.5±4.5)%和(23.9±5.7)%;與單獨熱療組或者小檗胺組相比,小檗胺聯(lián)合熱療處理SGC-7901/DPP細胞可以進一步增加SGC-7901/DPP細胞的凋亡比例(P<0.05)(表2)。
表2 小檗胺聯(lián)合熱療對SGC-7901/DPP細胞增殖、凋亡的影響
注:與對照組比較,*P<0.05;與熱療組比較,#P<0.05,##P<0.01;與小檗胺組比較,&P<0.05,&&P<0.01
小檗胺聯(lián)合熱療對SGC-7901/DPP細胞凋亡相關蛋白的影響利用Western blot檢測,與對照組相比,單獨熱療組和小檗胺組(16 mg/L)處理能夠降低Bcl-2的蛋白水平,同時提高Bax,cleaved caspase-3以及cleaved caspase-9的蛋白水平(P<0.05)。與單獨熱療組或者小檗胺組(16 mg/L)相比,小檗胺聯(lián)合熱療組中 Bcl-2的蛋白水平降低,Bax、cleaved caspase-3和cleaved caspase-9 的蛋白水平明顯提高(P<0.05)(圖1)。
注:A: Western blot 檢測各組SGC-7901/DPP細胞中Bcl-2、Bax、cleaved caspase-3和cleaved caspase-9 蛋白的表達;B: 各組SGC-7901/DPP細胞中Bcl-2蛋白表達水平的統(tǒng)計分析;C: 各組SGC-7901/DPP細胞中Bax蛋白表達水平的統(tǒng)計分析;D: 各組SGC-7901/DPP細胞中cleaved caspase-3蛋白表達水平的統(tǒng)計分析;E:各組SGC-7901/DPP細胞中cleaved caspase-9蛋白表達水平的統(tǒng)計分析;1:對照組;2:熱療組;3:小檗胺組;4:小檗胺聯(lián)合熱療組;與對照組比較,*P<0.05;與熱療組比較,#P<0.05;與小檗胺組比較,&P<0.05
小檗胺聯(lián)合熱療對SGC-7901/DPP細胞凋亡相關蛋白的影響利用Western blot檢測,與對照組相比,單獨熱療組和小檗胺組(16 mg/L)處理能夠明顯降低多藥耐藥基因1(multidrug resistance protein 1, MDR1)以及多藥耐藥相關蛋白1(multidrug resistance-associated protein 1,MRP1)的蛋白水平(P<0.05)。與單獨熱療組或小檗胺組(16 mg/L)相比,小檗胺聯(lián)合熱療組的MDR1以及MRP1蛋白水平明顯降低(P<0.05)(圖2)。
圖2 小檗胺聯(lián)合熱療抑制SGC-7901/DPP細胞耐藥相關蛋白的表達水平
注:A: Western blot 檢測各組SGC-7901/DPP細胞中MDR1和MRP1蛋白的表達;B: 各組SGC-7901/DPP細胞中MDR1蛋白表達水平的統(tǒng)計分析;C: 各組SGC-7901/DPP細胞中MRP1蛋白表達水平的統(tǒng)計分析;1:對照組;2:熱療組;3:小檗胺組;4:小檗胺聯(lián)合熱療組;與對照組比較,*P<0.05; 與熱療組比較,#P<0.05;與小檗胺組比較,&P<0.05
胃癌治療的方法主要包括手術治療、放射治療和化療。 多藥耐藥(multidrug resistance,MDR)的發(fā)展大大降低了化療的療效, 減輕MDR的發(fā)展可以恢復癌細胞對化療的敏感性。 研究[9]發(fā)現(xiàn),MDR相關蛋白的表達在MDR的發(fā)生發(fā)展中起著至關重要的作用。在臨床上,熱療作為一種輔助治療腫瘤的手段聯(lián)合化療已經(jīng)收到越來越多的關注,并且已在相關腫瘤治療中獲得了應用[10]。小檗胺具有免疫保護功能和活性,如刺激正常造血功能,具有抗炎和抗心律失常等作用[11-13]。雖然有研究[3-7]表明,小檗胺對不同類型的腫瘤有抑制作用,但其對胃癌的作用尚不明確,機制尚不清楚。本研究發(fā)現(xiàn),小檗胺聯(lián)合熱療可以有效抑制SGC-7901/DPP細胞的增殖,增加SGC-7901/DPP細胞凋亡,同時抑制MDR1和MRP1的蛋白水平,比單獨熱療或單獨使用小檗胺更有效。
小檗胺可以抑制不同類型腫瘤細胞的增殖,這種抑制作用可能是通過觸發(fā)凋亡途徑發(fā)揮其抗腫瘤活性,并調(diào)節(jié)參與癌癥進展的信號通路。凋亡信號傳導途徑的異常與癌癥發(fā)生有著緊密聯(lián)系。許多抗癌化合物通過激活凋亡途徑發(fā)揮其抗癌作用。在胰腺癌中,小檗堿能夠增加胰腺癌細胞中的Bax/Bcl-2比例,增強caspase-3和caspase-9的蛋白水平,從而誘導胰腺癌細胞中的細胞凋亡[4]。Zhang等[5]發(fā)現(xiàn),小檗胺能夠提高促凋亡Bax蛋白的水平,降低抗凋亡蛋白Bcl-2和Bcl-xL的表達,從而導骨髓瘤細胞凋亡。 Wang等[14]研究發(fā)現(xiàn),小檗胺能增加Fas、 p53、caspase-3和caspase-8、caspase-9蛋白的表達,從而促進HepG2細胞凋亡。最新研究[5]發(fā)現(xiàn),小檗胺能夠通過抑制Wnt/β-catenin信號通路來抑制卵巢癌細胞的增殖,并促進其凋亡。Zhang等[7]研究也發(fā)現(xiàn),小檗胺通過p53依賴機制促進結(jié)腸癌細胞的凋亡。本研究中,小檗胺聯(lián)合熱療能夠促進SGC-7901/DPP細胞的凋亡,這種促進凋亡作用可能與Bcl-2蛋白水平的降低,以及caspase-3、caspase-9和Bax蛋白水平升高有關。
MDR是治療癌癥的主要障礙,包括主要導致化療失敗的胃癌治療。MDR1基因編碼屬于ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運蛋白超家族的P-糖蛋白(P-gp)。 P-gp能夠?qū)⒒熕幬镛D(zhuǎn)運出細胞,導致藥物積聚下降,進而導致MDR[15-16]。 MRP1也屬于ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運蛋白超家族,MRP1導致MDR的作用機制與MDR1相似[17]。本研究中,小檗胺聯(lián)合熱療處理,可降低SGC-7901/DPP細胞的MDR1以及MRP1蛋白水平,提示小檗胺聯(lián)合熱療抑制SGC-7901/DPP細胞增殖可能與抑制MDR1以及MRP1蛋白水平有關。
綜上所述,小檗胺聯(lián)合熱療對SGC-7901/DPP的增殖抑制作用可能通過調(diào)控凋亡相關蛋白,促進SGC-7901/DPP凋亡以及抑制MDR1和MRP1蛋白水平有關。未來將在以下幾個方面開展研究工作:探索小檗胺聯(lián)合熱療能否降低SGC-7901/DPP的耐藥性;探討小檗胺聯(lián)合熱療對SGC-7901/DPP耐藥性的相關分子信號通路的影響;進一步研究小檗胺聯(lián)合熱療對其他類型的耐藥性癌細胞增殖的影響;利用動物腫瘤模型進一步確認小檗胺聯(lián)合熱療的體內(nèi)抗腫瘤活性。