BAPTA類熒光探針的離子識別性能研究與結(jié)合機制分析

周磊，喻曉，王雪凱，苗延青，成昭

（西安醫(yī)學院藥學院藥物化學研究所，陜西西安710021）

20 世紀 80 年代初，錢永健教授（Roger Y. Tsien）課題組針對EGTA[雙（β-氨基乙基）乙二醇醚 -N，N，N'，N'- 四乙酸 ]進行結(jié)構(gòu)修飾，合成了一系列類似于EGTA結(jié)構(gòu)的新型螯合劑BAPTA[1，2-雙（2-氨基苯氧基）乙烷 N，N，N'，N'- 四乙酸 ][1-3]及其衍生物，進而以BAPTA作為識別基團、引入熒光發(fā)色團，合成了第三代小分子熒光探針以苯環(huán)取代EGTA結(jié)構(gòu)中與N、O相連的亞甲基得到BAPTA，利用其結(jié)構(gòu)中4個羧基所成的環(huán)狀結(jié)構(gòu)發(fā)生離子識別作用。

本文基于ICT（分子內(nèi)電荷轉(zhuǎn)移，Intramolecular Charge Transfer）機制[4]設(shè)計熒光探針結(jié)構(gòu)，以經(jīng)典BAPTA母環(huán)為所設(shè)計熒光探針識別基團的基礎(chǔ)，引入苯乙烯類發(fā)色團--苯并咪唑[5-7]作為熒光發(fā)色團，以光譜分析手段分析探針在水體系中的離子識別性能；結(jié)合單晶結(jié)構(gòu)研究BAPTA受體中四羧基進行離子包結(jié)孔隙的形成；進而根據(jù)ICT機制及離子電子層排布等特性，分析探針對離子識別性能的差異及與離子結(jié)合等識別機制問題。針對探針結(jié)構(gòu)與離子識別機制問題的研究，能夠輔助完成熒光探針結(jié)構(gòu)中識別基團與熒光發(fā)色團的構(gòu)筑與設(shè)計，優(yōu)化探針性能，為新型小分子熒光探針的設(shè)計與開發(fā)提供重要思路。

1 實驗部分

1.1 試劑與儀器

XT-4B型顯微熔點儀，北京泰克科技有限公司；EQUINOX-55型紅外分光光度計，美國布魯克科技有限公司，KBr壓片法；LCQ Advantage MAX LC/MS/MS型高分辨質(zhì)譜儀，美國賽默飛世爾科技有限公司；AVANCE III型超導(dǎo)核磁共振波譜儀，美國布魯克科技有限公司，400 MHz；Smart APEX II CCD型X射線單晶衍射儀，美國布魯克科技有限公司；UV-2012C/PC/PCS型紫外-可見分光光度計，美國尤尼柯儀器有限公司；LS-55型熒光分光光度計，美國鉑金埃爾默儀器有限公司。

實驗所用試劑2-硝基苯酚、1-溴-2-氯乙烷、(i-Pr)2NEt、溴乙酸甲酯等均為化學純，市售。

1.2 實驗方法

以2-硝基苯酚及1-溴-2-氯乙烷為初始原料，經(jīng)6步反應(yīng)合成得到目標BAPTA熒光探針分子N，N，N'，N'- 四甲氧酰亞甲基 -2-[2-(2- 氨基苯氧基 )乙氧基]-4-苯并咪唑基苯胺，合成路線如圖1。

圖1 探針分子合成線路

(a) BrCH2CH2Cl，K2CO3，DMF，120 ℃，5 h；(b) 2-NO2-Ph-OH， K2CO3，DMF，140 ～ 160 ℃，4 ～5 h；(c) Fe，HCl，EtOH， 回 流 4 h；(d) (i-Pr)2NEt，BrCH2COOCH3，MeCN，回 流 24 ～ 36 h；(e) POCl3，DMF，75 ℃，4 h；(f) 1，2-Ph(NH2)2，H2O2，F(xiàn)e(NO3)3，50 ℃，30 min。

（1）1-(2-氯乙氧基)-2-硝基苯

將 4.30 g 1- 溴 -2- 氯 乙 烷（0.03 mol）、2.07 gK2CO3（0.015 mol）與 1.39 g 2- 硝基苯酚（0.01 mol）于室溫下在DMF（8 mL）中混合均勻，升溫至120 ℃，反應(yīng)約5 h，冷至室溫，加入20 mL乙酸乙酯稀釋，10 mL水洗3次，有機相經(jīng)合并、旋干后以甲醇-水（1∶1，V∶V）混合溶劑對粗品進行重結(jié)晶[8-9]，得到淡黃色針狀結(jié)晶1-(2-氯乙氧基)-2-硝基苯。產(chǎn)率 93%，熔點 36 ～ 37 ℃。IR (υ/cm-1):2972.34，2926.51，2875.20，1608.27，1484.98，1522.27，1343.29，1247.30，1026.00，745.61，667.76。1H NMR (CDCl3， 400 MHz) δ:7.85 (d， J=8 Hz， 1H)，7.53 ～ 7.57 (m， 1H)，7.23 ～ 7.04 (m， 2H)，4.40 (t，J=12 Hz， 2H)，3.86 (t， J=12 Hz， 2H)。

（2）1，2-二(2-硝基苯氧基)乙烷

將2-硝基苯酚（1.39 g，0.01 mol）和K2CO3（2.50 g，0.018 mol）于室溫下加入1-(2-氯乙氧基)-2-硝基苯（2.01 g， 0.01 mol）的 DMF（10 mL）溶液中，升溫至 140 ℃，反應(yīng)約 4 h，冷至室溫，分散于 20 mL 冰 -水中，經(jīng)抽濾、10 mL水洗3次、混合溶劑甲醇-水（1∶1，V∶V）重結(jié)晶得到黃色針狀結(jié)晶1，2-二(2-硝基苯氧基)乙烷。產(chǎn)率95%，熔點168～169 ℃。IR (υ/cm-1):3051.66，2956.13，2931.93，2873.61，2760.34，1606.92，1582.83，1484.65，1518.56，1359.96，1278.08，1090.66，744.19，671.99。1H NMR (CDCl3， 400 MHz) δ:7.83 (d， J=8Hz， 2H)，7.57(t， J=8Hz， 2H)，7.24 (t， J=8Hz， 2H)，7.08 (t， J=8Hz，2H)，4.54 (s， 4H)。

（3）1，2-二(2-氨基苯氧基)乙烷

3.36 g還原鐵粉（0.06 mol）、0.2 mL 濃鹽酸與10 mL無水乙醇于80℃下混合均勻并回流30 min后，分批次加入3.04 g1，2-二(2-硝基苯氧基)乙烷（0.01 mol），再經(jīng)回流反應(yīng) 4 h 后，加入 15% KOH/乙醇溶液調(diào)節(jié)體系pH為7～8，濾除鐵粉并加入6 mol/LH2SO4(aq)至析出足量白色硫酸鹽沉淀，沉淀溶于60 ℃熱水中，再以飽和NaOH(aq)調(diào)節(jié)至pH為9～10，得到白色粉末1，2-二(2-氨基苯氧基)乙烷。產(chǎn)率88%，熔點116～117 ℃。IR(υ/cm-1):3432.36，3355.57，3059.23，2934.32，1612.32，1507.94，1276.75，1217.40，941.92，739.95。1H NMR (CDCl3， 400 MHz) δ:7.05 ～ 6.91(m，8H)，4.36(s， 4H)，3.82(s， 4H)。

（4）N，N，N'，N'- 四 甲氧 酰 亞 甲 基 -1，2- 二 (2-氨基苯氧基)乙烷

將 (i-Pr)2NEt（6 mL，0.05 mol）和溴乙酸甲酯（3 mL，0.05 mol）加入 1，2- 二 (2- 氨基苯氧基 )乙烷（2.44 g， 0.01 mol）的熱 MeCN 溶液（10 mL）中，于 80 ℃回流反應(yīng) 12 h，冷卻、加入 20 mL 乙酸乙酯，抽濾、旋干濾液，得到黃色油狀物，再向其中加入少量甲醇，室溫下攪拌4～6 h、抽濾，再以甲醇重結(jié)晶得到白色粉末 N，N，N'，N'- 四甲氧酰亞甲基 -1，2-二(2-氨基苯氧基)乙烷。產(chǎn)率87%，熔點94～95℃。IR (υ/cm-1):3067.78，2993.00，2951.29，2921.02，2888.20，1748.17，1596.85，1509.53，1173.12，742.49，706.25。1H NMR (CDCl3， 400 MHz)δ:6.89 ～ 6.82(m， 8H)，4.27(s， 4H)，4.15(s， 8H)，3.56(s， 12H)。

（5）N，N，N'，N'- 四甲氧酰亞甲基 -2-[2-(2- 氨基苯氧基)乙氧基]-4-甲酰基苯胺

將 POCl3（2.4 mL）于 5 ～ 10 ℃下、40 ～ 45 min內(nèi)滴加至新蒸DMF（20 mL）中，室溫攪拌1～2 h，控制溫度為5～10 ℃，將上述混合液滴加至5.32 g N，N，N'，N'- 四甲氧酰亞甲基 -1，2- 二 (2- 氨基苯氧基 )乙 烷（0.01 mol）的 20 mLDMF 溶 液 中[4，10]。 升溫至 75 ℃，反應(yīng) 4 h，冷至室溫，分散于 100 mL 冰水中，抽濾得固體粗品，柱分離（乙酸乙酯-正己烷，1∶ 1，V ∶ V）得到白色粉末 N，N，N'，N'- 四甲氧酰亞甲基-2-[2-(2-氨基苯氧基)乙氧基]-4-甲?；桨?。產(chǎn)率85%，熔點131～132 ℃。IR (υ/cm-1):3015.76，2954.95，2928.97，1746.40，1681.01，1593.97，1509.15，1245.85，1164.87，747.14。1H NMR (CDCl3， 400 MHz) δ:9.80(s， 1H)，7.40 ～ 7.37(m，2H)，6.90 ～ 6.81(m， 4H)，6.76(d， J=8.3 Hz， 1H)，4.32 ～ 4.31(m， 2H)，4.27 ～ 4.26(m， 2H)，4.24(s，4H)，4.15(s， 4H)，3.57 (d， J=4.5 Hz， 12H)。13C NMR(CDCl3， 101 MHz) δ:190.47，171.92，171.22，150.12，149.64，145.00，139.27，129.89，126.71，122.17，121.59，118.93，116.49，112.85，110.51，76.98，76.66，67.25，66.64，53.33，51.95，51.76。HRMS ((+)-ESI):m/z = 583.1894 [(M+Na)+calcd.:583.1898， (M+Na)+found: 583.1894]。

（6）N，N，N'，N'- 四甲氧酰亞甲基 -2-[2-(2- 氨基苯氧基)乙氧基]-4-苯并咪唑基苯胺

將 0.11 g 鄰苯二胺（1 mmol）和 0.56 g N，N，N'，N'-四甲氧酰亞甲基-2-[2-(2-氨基苯氧基)乙氧基]-4-甲?；桨罚? mmol）于室溫下溶解于 10 mL 無水乙醇中，再升溫至80 ℃，反應(yīng)4 h、冷卻、旋干、柱分離 (乙酸乙酯-正己烷，1∶1，V∶V)得到白色固體 N，N，N'，N'- 四甲氧酰亞甲基 -2-[2-(2- 氨基苯氧基)乙氧基]-4-苯并咪唑基苯胺。產(chǎn)率80%，熔點 72 ～ 73 ℃。IR (υ/cm-1):3505.95，3033.48，2906.20，1743.33，1509.99，1478.13，1170.58，746.32。1H NMR (CDCl3，400 MHz) δ:7.68 (d， J=8 Hz， 1H)，7.56(s， 3H)，7.17(s， 2H)，6.88 ～ 6.87(m，2H)，6.84 ～ 6.83(m， 1H)，6.72 ～ 6.68(m， 2H)，4.13(s， 8H)，3.91 ～ 3.85(m， 3H)，3.85(s， 2H)，3.54(s，6H)，3.51(s， 6H)。13C NMR (CDCl3， 101 MHz) δ:172.22，171.71，152.15，150.21，149.86，140.84，138.73，122.43，121.35，120.33，118.94，118.15，112.80，111.29，77.41，77.09，76.77，66.90，66.52，53.39，53.31，51.79。HRMS ((+)-ESI):m/z = 649.2499 [(M+H)+calcd.:649.2504， (M+H)+found:649.2499]。

2 結(jié)果與討論

2.1 單晶結(jié)構(gòu)與離子識別孔隙

N，N，N'，N'- 四甲氧酰亞甲基 -2-[2-(2- 氨基苯氧 基 )乙 氧基 ]-4- 甲 酰 基 苯 胺 及 N，N，N'，N'- 四 甲氧酰亞甲基-2-[2-(2-氨基苯氧基)乙氧基]-4-苯并咪唑基苯胺的單晶從混合溶劑體系乙酸乙酯-二氯甲烷（V∶V，3∶1）中揮發(fā)得到，均為無色塊狀晶體。

（1）N，N，N'，N'- 四甲氧酰亞甲基 -2-[2-(2- 氨基苯氧基)乙氧基]-4-甲?；桨?/p>

正交晶系，Pna21空間群，每個非中心對稱結(jié)構(gòu)單元包含4個分子，分子及晶體結(jié)構(gòu)如圖2所示。醛基與苯環(huán)扭轉(zhuǎn)角接近180°或0°（C(16)-C(17)-C(21)-O(7)-2.9(10)，C(18)-C(17)-C(21)-O(7)177.8(6)）、醛基與其相連苯環(huán)(C15～C20)共平面。此外，兩個苯環(huán)因柔性橋連原子而處于相垂直角度，二面角經(jīng)計算得知為89.87°。

圖2 N,N,N’,N’-四甲氧酰亞甲基-2-[2-(2-氨基苯氧基)乙氧基]-4-甲?；桨?/p>

兩個苯環(huán)平面幾乎處于垂直排布，通過與鄰近氫形成分子內(nèi)氫鍵[11-12]，乙酸甲酯鏈上的O(2)、O(3)、O(4)、O(9)，以及乙氧基的 O(5)、O(6)，在 a 方向堆積形成了孔洞結(jié)構(gòu)。

（2）N，N，N'，N'- 四甲氧酰亞甲基 -2-[2-(2- 氨基苯氧基)乙氧基]-4-苯并咪唑基苯胺

N，N，N'，N'- 四甲氧酰亞甲基 -2-[2-(2- 氨基苯氧基)乙氧基]-4-苯并咪唑基苯胺屬C2/c空間群單斜晶系，每個非中心對稱結(jié)構(gòu)單元包含8個分子，分子及晶體結(jié)構(gòu)如圖3所示。

從接近于180°的扭轉(zhuǎn)角數(shù)據(jù) N(2)-C(7)-C(8)-C(13)-172.76(17) ?，N(1)-C(7)-C(8)-C(9) -173.77(17) ?，N(2)-C(6)-C(1)-C(2) -179.52(18) ? 與 C(5)-C(6)-C(1)-N(1) 178.67(18) ?，可得知苯環(huán)與苯并咪唑基的共平面結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)中，電子離域范圍擴大、平面共軛體系增大，分子熒光增強。

圖3 N,N,N’,N’-四甲氧酰亞甲基-2-[2-(2-氨基苯氧基)乙氧基]-4-苯并咪唑基苯胺

N，N，N'，N'- 四甲氧酰亞甲基 -2-[2-(2- 氨基苯氧基)乙氧基]-4-苯并咪唑基苯胺的兩個苯環(huán)互成接近于90°角度 (夾角86.44°)，連接于氮原子上的四條乙酸甲酯鏈互成角度，通過其氧原子與鄰近氫形成分子內(nèi)氫鍵。氫鍵與苯環(huán)-苯并咪唑的共平面性綜合作用，使分子實現(xiàn)空間有序堆積、于c方向形成顯著孔洞結(jié)構(gòu)[13-16]（孔洞率20%），在分子識別領(lǐng)域?qū)⒕哂兄匾饬x。

2.2 金屬離子選擇性

合成得到熒光探針為乙酸甲酯分子，需通過水解[17-18]得到其游離羧酸鹽、進行離子識別，水解路線如圖4所示。

圖4 乙酸甲酯型探針水解路線

稱取 N，N，N'，N'- 四甲氧酰亞甲基 -2-[2-(2- 氨基苯氧基)乙氧基]-4-苯并咪唑基苯胺（C33H36N4O10）0.0649 g（0.1 mmol） 與 CsOH·H2O 0.1679 g（1 mmol），于 10 mL 無水乙醇中攪拌回流、反應(yīng)過夜，冷至室溫，旋干溶劑，加入100 mL去離子水，得到濃度為1×10-3mol/L的探針Cs鹽溶液。

(1) 乙酸甲酯型探針的熒光激發(fā)與發(fā)射光譜

進行乙酸甲酯型探針的熒光性質(zhì)測定，得到其熒光激發(fā)與發(fā)射光譜如圖5。

圖5 乙酸甲酯型探針的熒光激發(fā)與發(fā)射光譜

乙酸甲酯型探針分子的熒光最大激發(fā)與發(fā)射波長為 λex，max= 331 nm，λem，max= 394 nm。將熒光激發(fā)光譜與熒光發(fā)射光譜重疊，得到熒光激發(fā)光譜與熒光發(fā)射光譜的鏡面對稱關(guān)系[19-21]，斯托克位移為63 nm。

（2）探針的金屬離子選擇性

進行探針對金屬離子特異選擇性的光學性質(zhì)分析，得到探針-金屬離子的熒光光譜圖6及紫外-可見吸收光譜圖7。

圖6 探針的金屬離子選擇性

圖7 探針-金屬離子體系的紫外光譜

從熒光光譜圖6來看，探針對Zn2+表現(xiàn)出增強型的識別，對Cu2+和Hg2+具有猝滅型響應(yīng)。對比來看，圖7中紫外吸收譜峰無明顯變化。由探針I(yè)CT識別機制可知，熒光發(fā)射波長變化因探針-金屬離子配位作用中電子轉(zhuǎn)移引起，對分子吸收基本無影響，因而紫外光譜無顯著變化。

2.3 探針的識別機理分析

經(jīng)過熒光光譜進行離子識別篩選，可知探針對Zn2+具有增強型識別，對Cu2+和Hg2+均具有猝滅型響應(yīng)，紫外光譜無顯著變化。結(jié)合探針結(jié)構(gòu)設(shè)計與ICT電荷轉(zhuǎn)移-分子識別機制，分子內(nèi)同時具有電子給體和電子受體、探針分子結(jié)構(gòu)中熒光發(fā)色團與識別基團直接相連，識別基團結(jié)合目標物時，影響分子內(nèi)推-拉電子作用、減弱或強化分子內(nèi)電荷轉(zhuǎn)移、導(dǎo)致熒光光譜變化。

共價鍵形成之后，探針BAPTA識別部分的氮仍存在孤對電子、具有給電子性，此時，不飽和環(huán)可作為分子中的電子受體，內(nèi)電子轉(zhuǎn)移使探針分子表現(xiàn)出特征熒光性質(zhì)。當結(jié)合金屬離子時，由氮及羧基氧提供孤對電子、金屬提供空軌道進行弱配位，進而減弱了氮的給電子性，完全阻斷或部分削弱內(nèi)電子轉(zhuǎn)移路徑，導(dǎo)致探針分子熒光猝滅或熒光強度降低。此外，過渡金屬通過自旋-軌道耦合、電子或能量轉(zhuǎn)移，能夠使熒光發(fā)色團發(fā)生熒光猝滅現(xiàn)象。上述兩點致使探針與Cu2+、Hg2+作用時發(fā)生熒光猝滅。而基于Irving-Williams規(guī)則，Cu2+、Hg2+配位穩(wěn)定性均強于Zn2+，且Zn2+相比于Cu2+，極化能力與變形性較弱、空軌道較少、配位作用弱，而還原性卻遠大于Cu和Hg，導(dǎo)致Zn2+接受氮孤對電子的能力遠小于Cu2+與Hg2+，因而在識別過程中，探針-Zn2+體系呈現(xiàn)與探針-Cu2+/Hg2+相反的作用方式。

3 結(jié)論

基于目前研究工作中尚不明確的BAPTA與離子識別、結(jié)合機制等相關(guān)問題，本文基于ICT機制設(shè)計熒光探針結(jié)構(gòu)，以經(jīng)典BAPTA母環(huán)作為熒光探針識別基團，通過熒光光譜研究水體系中探針的離子識別性能，發(fā)現(xiàn)探針對Zn2+具有增強型識別，對Cu2+和Hg2+均具有猝滅型響應(yīng)；進一步結(jié)合紫外-可見光譜分析手段、并進行探針單晶結(jié)構(gòu)表征，發(fā)現(xiàn)BAPTA受體中四羧基包結(jié)孔隙與離子識別作用的相關(guān)性；進而根據(jù)ICT機制及電子特性分析探針對離子識別性能的差異，研究探針-離子結(jié)合等識別機制問題。進行探針結(jié)構(gòu)與離子識別機制等問題的研究，能夠在未來研究工作中有效設(shè)計有機小分子熒光探針的識別基團與熒光發(fā)色團，優(yōu)化與改觀探針性能，為新型探針的設(shè)計與開發(fā)提供重要思路。