劉凌沖

(長(zhǎng)春科技學(xué)院，吉林長(zhǎng)春 130600)

1 概述

1.1 溫度對(duì)物種生存的重要性

溫度對(duì)物種的生存、分布及數(shù)量有極大的影響，從分子生物學(xué)角度可以對(duì)溫度對(duì)物種分布的影響進(jìn)行闡釋。在細(xì)胞和分子層面，輕微熱量的改變能造成深遠(yuǎn)的影響，如細(xì)胞的酶活性、蛋白穩(wěn)定性和轉(zhuǎn)運(yùn)、大分子聚合反應(yīng)、細(xì)胞膜流動(dòng)性、細(xì)胞分泌和神經(jīng)信號(hào)傳遞等。在兩極地區(qū)，土層寒冷，全年的溫度都低于5℃。大片的土地都是凍土，只有夏天的幾周是解凍的土壤。微生物對(duì)溫度變化特別敏感，尤其在不同地區(qū)的溫度變化。影響生物生長(zhǎng)的一個(gè)重要因素就是酶催化的適合溫度。每個(gè)酶的活性都有其最適溫度，低于最適溫度，有些催化反應(yīng)的功能就會(huì)停止，當(dāng)溫度逐漸上升，催化效率也隨之上升并趨近于最適溫度。溫度每提升10℃，催化反應(yīng)速度翻一番。然而，超過(guò)一個(gè)固定點(diǎn)，再繼續(xù)升溫，生物的生長(zhǎng)就會(huì)變慢，當(dāng)溫度很高時(shí)甚至?xí)旅?。高溫?duì)微生物的損害主要體現(xiàn)在酶變性、載體轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程破壞，并影響其他蛋白質(zhì)功能。溫度對(duì)微生物細(xì)胞膜同樣有顯著的影響:在極低的溫度下，細(xì)胞膜會(huì)凝固；在高溫，磷脂雙分子層會(huì)溶解分離。

1.2 極端微生物

極端微生物是一種生活在極端的溫度、酸堿度和鹽度中的微生物的總稱(chēng)，從中可以獲取一些極端條件下的酶用于生產(chǎn)和應(yīng)用。極端微生物根據(jù)它們生長(zhǎng)環(huán)境的不同和產(chǎn)生酶的應(yīng)用的不同，可以將它們分為嗜熱菌、嗜酸菌、嗜堿菌、嗜冷菌和嗜壓菌。這些不同種類(lèi)的極端微生物在地球的不同地方存在，海底、火山，兩極到赤道，地球最冷的和最熱的地方都有它們的存在。

1.3 嗜冷菌的特點(diǎn)及其重要性

區(qū)分嗜冷菌和冷耐受性菌是通過(guò)它們不同的生長(zhǎng)溫度。嗜冷菌在0℃長(zhǎng)勢(shì)良好；在15℃或者以下有最適增長(zhǎng)，最大值在10℃左右。嗜冷菌來(lái)源于北冰洋和南極，因?yàn)?0%的海洋都是5℃或高點(diǎn)，這是嗜冷菌的居住環(huán)境。嗜冷微生物在很多方面都適應(yīng)了環(huán)境。

1.4 游仆蟲(chóng)

終年寒冷的南極大陸沿岸海域擁有大量真核微生物，它們中的大部分是纖毛蟲(chóng)屬，尤其是嗜冷微生物游仆蟲(chóng)（Euplotesfocardii）。游仆蟲(chóng)是研究生物適冷性的理想材料。游仆蟲(chóng)隸屬原生動(dòng)物門(mén)纖毛綱游仆科，是單細(xì)胞真核生物。由于它們結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、易于操作、低溫條件易生存（最適生長(zhǎng)溫度4～5℃）、容易在實(shí)驗(yàn)室控制培養(yǎng)等特點(diǎn)，所以游仆蟲(chóng)是研究冷適應(yīng)性理想的工具。

2 材料與方法

2.1 供試材料

游仆蟲(chóng)野生菌株TN1[6]是從南極洲特拉諾瓦灣沿岸水域的海水樣品和混沙沉積物中被分離出來(lái)的。

RNaseA，購(gòu)自北京西美杰科技有限公司。

2.2 試劑與儀器

微量離心管（江蘇康健醫(yī)療、冷凍離心機(jī)（湖南凱達(dá)科學(xué)儀器有限公司）、異丙醇（上海滬靜生物科技有限公司）、乙醇（上海撫生實(shí)業(yè)有限公司）、考馬斯亮藍(lán)（上海華藍(lán)化學(xué)科技有限公司）、AquaPure Genomic DNA kits 732-6340上海天崛電子科技有限公司、SEDI梯度PCR儀（WEALTEC）、Mini GES迷你水平電泳槽（WEALTEC）、紫外分光光度記（Mettlertoledo）、SDS溶液（青島捷世康生物科技有限公司）。

2.3 游仆蟲(chóng)Euplotesfocardii的培養(yǎng)

游仆蟲(chóng)TN1野生株系是從南極Terra Nova沿岸水域的海水樣品和泥沙沉積物中被分離出來(lái)的。它的細(xì)胞是以Danaliellatertiolecta為食物并且在2～4℃增長(zhǎng)。在此溫度下，細(xì)胞表現(xiàn)出顯著的增殖率。在鹽水中4-5℃被培養(yǎng)，在4℃繁殖率是大概每四天分裂一次。

2.4 游仆蟲(chóng)Euplotesfocardii細(xì)胞基因組DNA的提取

使用純水基因組DNA試劑盒（AquaPureGeomic DNA）提取基因組DNA流程如下。

2.4.1 細(xì)胞收集

慢速離心已收集約2×106細(xì)胞，加入平衡后的35%NaCl溶液中，轉(zhuǎn)移入1.5mL離心管。于1600r/min離心5s以收集細(xì)胞。棄去上清液，留取20μL殘液。

2.4.2 細(xì)胞裂解

大力旋轉(zhuǎn)細(xì)胞懸浮顆粒。為了裂解細(xì)胞，將300μL 細(xì)胞裂解液（Genomic DNA lysis Solution）加入細(xì)胞懸浮液中，并且仔細(xì)得用移液管上下吸取數(shù)次以促進(jìn)細(xì)胞裂解。

2.4.3 RNA酶處理

將1.5μL RNA酶A溶液4mg/mL加入細(xì)胞裂解液中。顛倒離心管25次，以徹底混合樣品并且在37℃培養(yǎng)1h。

2.4.4 蛋白質(zhì)沉降

待樣品溫度降至室溫，將100μL蛋白質(zhì)沉降溶液加入細(xì)胞裂解產(chǎn)物中。劇烈振蕩20s使蛋白質(zhì)沉降溶液與細(xì)胞裂解產(chǎn)物充分融合。然后在1600r/min離心3min以分解沉淀蛋白和細(xì)胞碎片。

2.4.5 DNA沉降

將含有DNA的上清液轉(zhuǎn)移入新的滅菌處理的1.5mL離心管中，加入300μL100%異丙醇溶液并上下反復(fù)顛倒50次。然后在1600r/min將樣品離心1min以產(chǎn)出DNA白色沉淀，上清液被丟棄，DNA沉淀放在干凈的吸收紙風(fēng)干。之后，加入300μL70%乙醇溶液以沖洗DNA沉淀并反復(fù)多次顛倒，并在1600r/min離心1min，然后棄去上層乙醇溶液。最后將試管倒置在干凈的濾紙上風(fēng)干10～15min。

2.4.6 DNA溶解

DNA懸浮顆粒被干化，100μL DNA水溶液加入DNA懸浮顆粒液，并且在室溫下過(guò)夜培養(yǎng)以為了DNA水化。紫外光吸收范圍從260nm到280nm以測(cè)試DNA純度和質(zhì)量，A260/A280在1.7～2.0。最后，DNA在-20℃儲(chǔ)存。

2.5 引物設(shè)計(jì)

PCR擴(kuò)增中使用的引物見(jiàn)表1。

表1 引物設(shè)計(jì)

2.6 PCR擴(kuò)增

針對(duì)兩個(gè)不同的引物，我們?cè)O(shè)置兩個(gè)循環(huán)

2.7 樣品DNA純化

2.7.1 調(diào)試DNA結(jié)合條件

混合1體積的樣品和2體積的NT緩沖液。

2.7.2 結(jié)合DNA

將核酸萃取物放入收集管中，裝滿樣品。在11000r/min離心1min，棄上清液于收集管中。

2.7.3 洗刷硅膠膜

加入600ulNT3緩沖液。在11000r/min離心1 min。棄去上清液重新將核酸萃取物放回收集管中。

2.7.4 干化硅膠膜

在11000r/min離心2min以除去NT3緩沖液，確保離心管無(wú)殘留液。由于包含乙醇的NT3緩沖液會(huì)影響下一步反應(yīng)。所以要在72℃風(fēng)干2～5min。

2.7.5 洗提DNA

將核酸萃取物放入干凈的1.5mL微量離心管中。加入15～50μLNE洗脫緩沖液或者離子水在室溫下靜置1 min以提高純化DNA的產(chǎn)量。然后再在11000r/min 離心 1 min。

2.7.6 跑電泳及基因測(cè)序

純化后的DNA沉淀用聚丙烯凝膠電泳（SDSPAGE）的方法跑出所需的基因條帶進(jìn)行剪切，并拿到測(cè)序公司進(jìn)行測(cè)序。利用測(cè)序后的序列結(jié)果進(jìn)行特點(diǎn)分析。

3 結(jié)果

3.1 從游仆蟲(chóng)中提取的GroES的序列分析

冷適應(yīng)分子機(jī)制的研究，在基因表達(dá)和蛋白序列的層面。游仆蟲(chóng)的轉(zhuǎn)錄子包含454個(gè)序列并用BLAST方法搜索分析出來(lái)。對(duì)應(yīng)真核生物的GroES可以發(fā)現(xiàn)兩個(gè)重復(fù)的序列從這些重復(fù)序列，分析出兩個(gè)起始子:

>Ef_groES1 MSIAFKKLNPLLNRVLVKRAEAVTKT TGGIILTQEKDMSYGTVVAHGPGVAEESGFRTTCVKIG DTVLLPSWEGQGVELNGEELSIYRDTDIMGILSEEVL

>Ef_groES2 MLNFRRVQPLLNRVLVKKVEVAQKSI GGIILSARDTPPANIGTVIDVGPGTTDRDGKHRECFVNV GDVVLLPEHAGAKIELADESEFYLFRDDDIIGVLSDRI

3.2 冷適應(yīng)性分析

>Ec_GroES1 MSISFKKLSPLLNRVLVKRAAASTTSA GGIILTEEKEMAYGEVVAHGPGVSEEGGFRDTCVKKG DTVLLPSWEGQKIELNGEELSIYRDTDILGILSEKVQ

>Ec_GroES2 MLNFRRIKPLMNRVLVKKVEVPSKSA GGILLKVTEAEKSNVATVIDVGPGTTDREGNFRKTFVNV GDIVLLPETQGRKIEMADKSEFYLYRDDDIIGVLSEAV

對(duì)比這些序列揭示了從游仆蟲(chóng)中的兩個(gè)GroES序列只有45%相同，然而EFGroES1有80%與ECGroES1，EFGroES2有68%與它的厚游仆蟲(chóng)的異源體相同。

4 結(jié)論

論文研究的目的是研究嗜冷微生物游仆蟲(chóng)中提取的特異性功能基因分子伴侶GroES，并對(duì)其進(jìn)行冷適應(yīng)性分析。研究表明，從游仆蟲(chóng)中提取的GroES基因表達(dá)蛋白質(zhì)趨向于提升脯氨酸，天冬氨酸，組氨酸，和精氨酸的含量；降低谷氨酸，賴氨酸，絲氨酸，蘇氨酸和酪氨酸的含量。而脯氨酸、天冬氨酸、組氨酸等正是與微生物的抗凍性相關(guān)的蛋白質(zhì)組成，提升這些氨基酸的同時(shí)也提高了多肽鏈分子的靈活性，這對(duì)在低溫下行使酶反應(yīng)的性能非常重要。更多的實(shí)驗(yàn)還需要驗(yàn)證這個(gè)假設(shè):如果是真的，就會(huì)提高細(xì)菌中蛋白質(zhì)表達(dá)的含量，尤其是真核生物中的抗凍蛋白。以此生產(chǎn)更多的生物催化酶，通過(guò)原核生物的繁殖特性提高抗凍蛋白的工業(yè)生產(chǎn)的效率。