李慧，李月玲，邵喆

（寶船生物醫(yī)藥科技（上海）有限公司，上海 201203）

單克隆抗體類藥物作為生物制品的一類，具有特異性高、靶向性強和毒副作用低等特點，廣泛用于腫瘤、自身免疫病等多種疾病治療[1]。近些年，單抗藥物屬于最熱門的研發(fā)領域之一，每年的市場資金投入、藥物獲批數量都在急劇增長。穩(wěn)定性考察是生物制品研發(fā)的重要組成部分，其包括影響因素研究、加速試驗以及長期試驗的考察[2-5]，必要時還應包括使用期間穩(wěn)定性的考察[6-7]。加速試驗是在加速條件下進行，通過加速藥物的化學或物理變化，探討藥物的穩(wěn)定性。長期試驗是在接近藥物的實際貯存條件下進行，其目的是為制定藥物的有效期提供依據。影響因素研究是在比加速試驗更激烈的條件下進行，其目的是探討藥物的固有穩(wěn)定性、了解影響其穩(wěn)定性的因素及可能的降解途徑與降解產物，為產品生產、包裝、貯存條件和分析方法的開發(fā)及驗證提供科學依據[5]。中國藥典（2015版）四部以及ICH相關指南中建議，生物制品在申報IND、生產規(guī)模擴大以及工藝變更后，均需要考察產品的穩(wěn)定性。

本研究就生物制品穩(wěn)定性考察中的影響因素試驗展開研究。研究對象為單抗藥物A003，A003是一個分子量為150 kD的全人源化的IgG1抗體，適應癥為用于實體瘤的治療。本研究中，將考察樣品對光照、高溫、劇烈振蕩、異常環(huán)境溫度、酸堿破壞、氧化破壞等異常儲存條件的耐受程度，考察樣品的主要降解途徑及降解產物，為制定產品質量標準、儲存、運輸條件提供試驗依據，并據此進一步驗證所用分析方法的可行性，為后期選擇包裝材料提供參考。

1 材料及方法

1.1 試驗材料

單克隆抗體A003，注射溶液劑，pH 6.0，20 mg/mL，10mL/支。

1.2 方法

影響因素試驗包括光照、高溫、劇烈振蕩、低溫循環(huán)、凍融循環(huán)、酸堿破壞、氧化破壞等考察因素。具體考察方法及取樣時間點如下。

（1）光照試驗。參考ICHQ1B指南[8]，將樣品放置于穩(wěn)定性綜合試驗箱（LHH-250GSD-UV，上海一恒，下同），同時暴露在冷白熒光燈和近紫外燈下，光照強度設置為（4 500±5 000）lx，溫度設置為 10 ℃，在第0、4、8、14、30天取樣檢測。

（2）高溫試驗。將樣品放置于穩(wěn)定性試驗箱，溫度設置為40 ℃，避光，在第0、4、8、14、30天取樣檢測。

（3）劇烈振蕩試驗。將樣品放置于25℃，轉速100 r/min，恒溫培養(yǎng)振蕩器（ZHWY-Z11C，上海智誠）考察30天，第0、4、8、14、30天取樣檢測。

（4）低溫循環(huán)。將樣品于醫(yī)用冷藏箱（HYC-940，海爾），2～8 ℃放置2天，然后轉移至穩(wěn)定性綜合試驗箱，（25±2）℃下放置2天，此為一個循環(huán)，放置三個循環(huán)，第0、4、8、12天取樣檢測。

（5）凍融循環(huán)。將樣品于醫(yī)用冷凍箱（DW-25L262，海爾），-20～-10 ℃放置2天，然后轉移至醫(yī)用冷藏箱（HYC-940，海爾），4 ℃下放置2天，此為一個循環(huán)，放置三個循環(huán)。第0、4、8、12天取樣檢測。

（6）酸破壞試驗（pH3.0）。用50%醋酸將樣品pH調節(jié)到3.0，于室溫下第0、4、8、24 h取樣，取樣后用2 mol/L Tris將pH調整到6.0，然后檢測。

（7）堿破壞試驗（pH9.5）。用 2 mol/L Tris將樣品pH調節(jié)到9.5，于室溫下第0、4、8、24 h取樣，取樣后用50%醋酸將pH調整到6.0，然后檢測。

（8）氧化破壞試驗。取600 μL樣品，加入400 μL H2O2（2%）混勻，37 ℃條件下放置，室溫下第 0、1、2、3 h取樣，取樣后用空白緩沖液7000 G超濾換液去除殘留的H2O2，然后檢測。

1.3 檢測項目

檢測項目包括:外觀、pH值、蛋白質含量、滲透壓摩爾濃度、離子交換色譜、分子排阻色譜、CE-SDS還原電泳、CE-SDS非還原電泳、cIEF、抗原結合活性和細胞水平活性等。

pH值、蛋白質含量、滲透壓摩爾濃度分別用pH計（FE28，METTLER），紫外分光光度計（UV-1900，島津），滲透壓測定儀（SMC 30C-1，天津天河）檢測。

離子交換色譜（Cation Exchange Chromatography，CEX）:采用 HPLC（Agilent 1260）、陽離子交換色譜柱MabPacTMSCX-10（Thermo），蛋白樣品進樣后，經 流 動 相 A（20 mmol/L Tris，pH 8.1）、流動相 B（20 mmol/L Tris，500 mmol/L NaCl，pH 8.1）進行鹽離子梯度洗脫，帶電荷組分分子會根據帶正電荷由少到多的順序被洗脫出來，經紫外檢測器（280 nm）檢測，從而達到分析樣品電荷異質性的目的。

分 子 排 阻 色 譜（Size Exclusion Chromatography，SEC）:采用 HPLC（Agilent 1260）、TSKgel G3000SWXL色譜柱（TOSOH），經流動相（100 mmol/L KH2PO4/ 100 mmol/L Na2SO4，pH6.7±0.02）等 度 洗 脫 20 min，按照分子大小依次被洗脫，經紫外檢測器（280 nm）檢測。該方法可達到分析樣品分子大小異質性的目的。

CE-SDS還原電泳:使用毛細管電泳儀（PA800，Beckman-Coulter），樣品經β-巰基乙醇（Sigma-Aldrich）還原成重鏈和輕鏈，在毛細管（Beckman-Coulter）中依據分子量大小進行分離，經PDA檢測器檢測，從而達到定量測定產品純度及非糖基化重鏈的目的。

CE-SDS非還原電泳:使用毛細管電泳儀（PA800，Beckman-Coulter），蛋白在非還原條件下，在毛細管（Beckman-Coulter）中依據分子量大小進行分離，從而達到定量測定重組單抗產品純度的目的。

毛細管等電聚焦（Capillary Isoelectric Focusing，cIEF）:采用毛細管電泳儀（iCE3，ProteinSimple）檢測抗體的等電點以及分析其電荷異質性。在電場作用下，樣品、兩性電解質和緩沖液混合物能在毛細管內形成穩(wěn)定的pH梯度，當具有不同等電點（pI）的蛋白質在電場作用下遷移時，將聚焦在pH等于其等電點的位置，形成窄的聚焦區(qū)帶。iCE3全柱成像檢測系統(tǒng)會在聚焦過程中實時采集信號，形成等電聚焦圖譜。

抗原結合活性:采用間接ELISA原理，在96孔板中包被可特異性結合樣品的一抗（Sino Biological），并依次加入梯度稀釋的樣品和酶結合二抗（Sigma），用酶底物顯色法（TMB，購自北京索萊寶）檢測樣品與一抗的結合量，用酶標儀（MD，thermo）讀取數值，以樣品濃度的對數值為橫坐標，反應樣品與一抗結合量的OD值為縱坐標，擬合出一條四參數曲線。通過比較待測樣品和參比品的IC50值，計算待測品的抗原結合活性。

細胞水平活性:采用報告基因法進行檢測。根據藥物作用機理選擇合適的信號通路和轉錄因子，構建一個靶啟動子位于熒光素酶表達基因序列前方的報告基因質粒，轉染細胞，獲得反應細胞。當抗體加入反應體系時，信號通路被激活，轉錄因子與靶啟動子結合，則熒光素酶基因就會表達，引起熒光發(fā)光，熒光強度與抗體濃度呈正相關。以抗體濃度的對數值為橫坐標，相應濃度下熒光強度為縱坐標擬合出四參數曲線，獲得樣品和參比品的EC50值，用于計算樣品的相對細胞水平活性。

1.4 數據分析

本研究所采用分析方法均經過方法驗證，通常認為含量和純度與初始值相差5%，或者生物活性指標超過70%～130%的范圍判為顯著變化。其他指標的變化關注變化趨勢。

2 結果與分析

各影響因素試驗的外觀都沒有變化，無色、澄清。其余結果見表1-表8。

2.1 光照試驗結果

光照試驗結果見表1，考察至30天，CEX主峰由56.6%降低至50.1%，酸性峰比例由33.8%上升至42.9%。cIEF的變化趨勢與離子交換色譜結果的變化趨勢一致。

表1 光照試驗數據

2.2 高溫試驗結果

高溫試驗結果見表2，考察至30天，CEX主峰由56.6%降低至38.2%，酸性峰比例由33.8%上升至51.7%，cIEF變化趨勢于CEX一致；SEC單體比例由99.5%降低至98.4%，聚體比例略有升高；非還原CE-SDS的主峰比例由97.6%降低至94.4%。其余結果無明顯變化。

表2 高溫（40 ℃）試驗數據

2.3 劇烈振蕩試驗結果

劇烈振蕩試驗結果見表3，CEX、cIEF主峰比例略有降低，其余各項指標無明顯變化。

表3 劇烈振蕩試驗數據

2.4 低溫循環(huán)試驗結果

低溫循環(huán)試驗結果見表4，各項指標均無明顯變化。

表4 低溫循環(huán)試驗數據

2.5 凍融循環(huán)試驗結果

凍融循環(huán)試驗結果見表5，各項指標均無明顯變化。

表5 凍融循環(huán)試驗數據

2.6 酸破壞試驗結果

酸破壞試驗結果見表6，各項指標均無明顯變化。

表6 酸破壞試驗數據（pH 3.0）

2.7 堿破壞試驗結果

堿破壞試驗結果見表7，各項指標均無明顯變化?？疾熘?4 h，CEX主峰比例明顯降低，由56.1%降至50.2%，酸性峰比例明顯升高。其他指標無明顯變化。cIEF的變化趨勢與CEX一致。

表7 堿破壞試驗數據（pH9.5）

2.8 氧化破壞試驗結果

氧化破壞試驗結果見表8，氧化破壞至3 h，非還原CE-SDS主峰由96.4%降低至71.9%，CEX主峰由54.8%降低至25.3%，酸性峰比例顯著升高。cIEF主峰由57.9%降低至29.4%，抗原結合活性、細胞水平活性結果已由107%、110%分別降低至43%、42%。

表8 氧化破壞試驗數據

3 分析及討論

影響因素試驗通常是生物制品考察穩(wěn)定性的第一步，包括溫度、光照、濕度、振搖、低溫循環(huán)、凍融循環(huán)、酸堿破壞和氧化破壞等。通過這一系列的考察，了解產品對哪些考察因素比較敏感，哪些質量屬性變化比較大，了解產品的主要降解產物及降解途徑，進一步驗證所用分析方法的可行性，為后期產品的儲存、運輸、包裝材料的選擇、質量標準的制定提供參考。因此，做好影響因素試驗考察非常重要。

本研究針對單抗藥物A003展開影響因素試驗研究，結果表明:（1）A003對高溫、光照、氧化破壞比較敏感，電荷異質性發(fā)生了顯著的變化，表現為主峰比例顯著下降，酸性峰比例顯著升高；純度變化表現為單體比例有明顯下降趨勢，聚體比例有明顯升高趨勢。在氧化破壞試驗中，生物活性指標降低顯著；（2）劇烈振蕩對A003有輕微破壞，電荷異質性變化趨勢明顯，主峰比例有降低的趨勢，酸性峰比例有升高的趨勢；（3）A003在其他因素考察試驗中，沒有明顯變化。

在影響因素考察中發(fā)現，最敏感的考察項目是CEX、cIEF。這兩項也是最常用的分析單抗電荷異質性的方法，根據出峰時間先后分為酸性峰、主峰和堿性峰。一般認為N糖基化、C末端賴氨酸丟失、氨基酸氧化、天冬酰胺脫酰胺化及天冬氨酸異構化、N末端谷氨酰胺及谷氨酸環(huán)化是較常見的產生電荷異質性的原因[9]。電荷異質性也是影響抗體活性的重要因素，有研究表明高水平的唾液酸化會影響單抗與FcγRIIIa的結合，進而導致ADCC活性減弱[10]。此外，天冬酰胺脫酰胺化可以發(fā)生在抗體的恒定區(qū)或可變區(qū)，當發(fā)生在可變區(qū)，可能對抗體的結合活性產生一定的影響[11]，還沒有明確的證據證明C末端賴氨酸丟失、蛋氨酸氧化、N末端谷氨酸或谷氨酰胺環(huán)化對抗體會造成影響[12]。盡管大多數電荷變異體對抗體的生物學活性無顯著影響，但當電荷變異值接近一個pI單位時，可能影響藥物的組織分布和藥代動力學[13]。因此，盡量控制電荷異質性的變化，對于產品的安全性、有效性至關重要。

在影響因素考察中，另外一個敏感指標是純度。雖然抗體藥物在最初生產出來時，因經過一系列的純化過程，最終都是高純產物，但是在產品儲存、運輸以及給患者的使用過程中，純度會降低，都會產生不可逆的聚體[14]。聚體的存在（無論是人源化的還是全人源的蛋白），會顯著增加引起病人對藥物起免疫反應的風險，在極少數情況下，可能引起嚴重的安全問題[15]。聚體通常保留原來單體的二級結構或者三級結構的一部分，還具有不可逆性。這兩個特征組合起來，使得聚體更容易引起免疫原性[16-17]。因此，為保證單抗產品的有效性及安全性，因嚴格控制聚體的產生。

生物學活性是決定抗體在治療疾病中是否有效的重要條件。本研究中氧化破壞，引起A003生物學活性的顯著降低，應該盡量避免。

綜上所述，引起A003明顯破壞的影響因素是高溫、光照、氧化；引起A003輕微變化的影響因素是劇烈振蕩、堿破壞；易引起變化的質量屬性是電荷異質性、純度、生物學活性。因此，產品在儲存、運輸過程中應盡量避免接觸空氣，避免高溫及光照的條件。