,3,*

(1.山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品研究所,山東省農(nóng)產(chǎn)品精深加工技術(shù)重點實驗室, 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部新食品資源加工重點實驗室,山東濟南 250100; 2.奧本大學(xué)生物系統(tǒng)工程學(xué)院,美國阿拉巴馬州 36849; 3.北京工商大學(xué),北京食品營養(yǎng)與人類健康高精尖創(chuàng)新中心,北京 100048)

牡蠣含有豐富的營養(yǎng)物質(zhì),有“海洋牛奶”之稱,是一種藥食同源的海洋生物,具有較高的營養(yǎng)價值和一定的藥理作用[1]。開殼牡蠣因缺少保護組織而容易遭受微生物的侵染,直接影響新鮮牡蠣的銷售,還會對鮮牡蠣的食用安全造成隱患。同時,隨著人們對食品安全的重視,天然、綠色的生物防腐劑受到越來越多的青睞。茶多酚、山梨酸鉀、普魯蘭多糖以及乳酸球菌復(fù)合型天然防腐保鮮劑在牡蠣的冷儲保藏研究中均表現(xiàn)出較好效果,可顯著延長貨架期,表明生物防腐保鮮劑用于牡蠣保鮮是切實有效的[2-3],這對于延長去殼牡蠣保鮮期,促進養(yǎng)殖牡蠣的發(fā)展有一定作用。

ε-聚賴氨酸水溶性好,具有較高的安全性,能夠在人體內(nèi)分解為賴氨酸,其抑菌范圍廣,能夠抑制革蘭氏陰性菌、革蘭氏陽性菌、酵母菌、絲狀真菌及病毒等多種微生物[4-5],用于米飯、軟飲料、沙拉、奶酪、魚[6-7]和即食烤牛肉[8]等的防腐保鮮,效果顯著。因此,本研究以ε-聚賴氨酸為研究對象,以開殼牡蠣的各項參數(shù)為評價指標,考查其對牡蠣貯藏過程中的防腐抗菌效果。有研究使用0.1%、1%和2%濃度的ε-聚賴氨酸作用于即食烤牛肉,結(jié)果顯示其能有效控制7 d內(nèi)牛肉中病原菌的數(shù)量[8],為探究ε-聚賴氨酸抗牡蠣微生物增殖的有效濃度范圍,參考上述實驗結(jié)果,并考慮病原菌和研究對象的差異性,本實驗初步確定較為寬泛的ε-聚賴氨酸試驗濃度為0.2%、2%,以期為后續(xù)深入研究提供有效數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

牡蠣(Crassostreavirginica) Bon Secour Fisheries公司提供,采集于阿拉巴馬州墨西哥灣,去殼后加冰運送,次日抵達實驗室,直接送入4 ℃冷藏庫;ε-聚賴氨酸(3500～4500 Da) Carbosynth公司,用無菌水配制成0.2%和2%的質(zhì)量濃度,用于保鮮實驗;鄰苯二甲醛溶液(o-phthalaldehyde,OPA)、9-芴甲基氯甲酸酯溶液(9-fluorenylmethyl chloroformate,FMOC)、硼酸鹽緩沖溶液 Agilent試劑公司;氨基酸標準溶液 Sigma試劑公司;其他化學(xué)試劑 均為分析純。

Whirl-PakTM過濾袋(254×300 mm) NascoTM公司;BagMixer 400W拍打式均質(zhì)器 Interscience公司;BUCHI Mixer B-400均質(zhì)儀 BUCHI公司;TA-XT2i質(zhì)構(gòu)儀 Stable Microsystems公司;Vibra cellTM裂解儀 Sonics公司;Agilent 1260高效液相色譜儀 Agilent公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 牡蠣保鮮預(yù)處理 開殼牡蠣用超純水沖洗除去表面黏液和附著物,瀝干水分后,選取大小均一的個體隨機分組,單個牡蠣重量為13～15 g,使用濃度為0.2%和2%的無菌ε-聚賴氨酸溶液浸潤處理(每10顆牡蠣浸于200 mL溶液),以無菌水處理過的牡蠣為空白組,瀝干后置于自封袋中,每組8個牡蠣,在(4±1) ℃條件下進行試驗,在0、5、10、13、16 和19 d取樣檢測。

1.2.2 細菌總數(shù)測定 取一整顆牡蠣置于無菌過濾袋中,加入90 mL無菌水,用拍打式均質(zhì)器均質(zhì)10 min,從無菌袋另一側(cè)取濾液作為供試樣品,參照國家標準GB 4789.2-2016《食品微生物學(xué)檢驗菌落總數(shù)測定》進行牡蠣中菌落總數(shù)的測定。

1.2.3 pH測定 稱取5 g勻漿的牡蠣肉糜,加入50 mL的去離子水,裂解儀超聲震蕩30 s,離心后使用pH計測定上清液pH。

1.2.4 揮發(fā)性鹽基氮(Total volatile basic nitrogen,TVB-N)測定 稱取10 g勻漿的牡蠣肉糜,加入4%的三氯乙酸溶液(Trichloroacetic acid,TCA)40 mL,裂解儀超聲震蕩30 s,室溫27 ℃靜置30 min,4500 r/min、25 ℃離心15 min,取上清液作為供試樣品[9],參照國家標準GB 5009.228-2016《食品中揮發(fā)性鹽基氮的測定》進行TVB-N的測定,以4%的TCA作為對照,實驗結(jié)果取3次測量的平均值。

1.2.5 質(zhì)構(gòu)TPA的測定 采用TA-XT2i質(zhì)構(gòu)儀TA30探頭,使用5 kg的力量感應(yīng)元校準,取一整顆牡蠣置于探頭正下方,參考文獻[9]所述設(shè)置操作參數(shù)。基本參數(shù)如下:測試加速度為 2 mm/s,壓縮形變量設(shè)為50%,完成兩個按壓動作,兩次按壓時間間隔為5 s。試驗數(shù)據(jù)由計算機自動讀取,每組設(shè)置6個平行。

1.2.6 游離氨基酸(Free amino acids,FAA)的測定 稱取0.2 g勻漿的牡蠣肉糜,加入1 mL的10% TCA,超聲震蕩30 s后,室溫27 ℃靜置15 min,15000 r/min、25 ℃離心15 min,上清液經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過濾后作為供試樣品。樣品經(jīng)程序進樣處理(Agilent application note 5990-5599EN),吸取1 μL供試樣品、2.5 μL硼酸鹽緩沖液、0.5 μL OPA溶液、0.4 μL FMOC溶液、32 μL蒸餾水置于定量環(huán)中混合,進樣20 μL進行分析。

色譜柱:Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18柱(250 mm×4.6 mm,5 μm);柱溫:40 ℃;流動相A:10 mmol/L磷酸氫二鈉-四硼酸鈉(pH8.2);流動相B:乙腈-甲醇-雙蒸水(體積比45∶45∶10);梯度洗脫:0～1 min,2% B;1～35 min,2%～57% B;35～55 min,57%～100% B;55～65 min,100% B。流速:1 mL/min;DAD檢測波長:338、262 nm(用于蛋白質(zhì)的檢出)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)使用Excel 2010軟件進行統(tǒng)計分析;方差分析結(jié)果均以平均值±標準偏差(Mean±SD)表示;使用SPSS 22.0軟件Duncan法進行顯著性分析,P<0.01為差異極顯著,P<0.05為差異顯著,P>0.05為差異不顯著;以氨基酸的摩爾濃度(μmol/mL)為橫坐標,不同濃度氨基酸峰面積為縱坐標,繪制標準曲線,根據(jù)測定的樣品峰面積計算FAA的含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 ε-聚賴氨酸處理對貯藏牡蠣菌落總數(shù)的影響

由圖1可以看出,牡蠣貯藏0 d,初始菌落數(shù)在4.85lg CFU/g左右,在貯藏5 d時,空白組菌落數(shù)已經(jīng)達到6.14lg CFU/g(增加了1.29lg CFU/g),低濃度處理組(0.2%)為5.03lg CFU/g,而高濃度處理組(2%)僅為4.61lg CFU/g,與空白組相比,試驗組菌落數(shù)至少低1個數(shù)量級,抑制效果顯著(P<0.05);2%ε-聚賴氨酸處理組效果較空白組差異極顯著(P<0.01);此外,2%ε-聚賴氨酸不僅抑制微生物生長,還有殺菌作用,該組較貯藏0 d菌落數(shù)降低了0.24lg CFU/g,減小了4.95%。低濃度ε-聚賴氨酸通過破壞微生物細胞膜導(dǎo)致細胞內(nèi)代謝失衡來實現(xiàn)抑菌效果;而高濃度的ε-聚賴氨酸導(dǎo)致細胞膜的滲透性明顯增加,在細胞膜上形成膠束,磷脂雙分子層彎曲并穿孔,最后導(dǎo)致細胞死亡[10-12]。隨著貯藏時間的延長,貯藏10 d抑制作用逐漸減弱,與空白組相比,0.2% ε-聚賴氨酸抑菌效果并不顯著(P>0.05),菌落數(shù)與空白組相近;但2% ε-聚賴氨酸的抑菌效果仍優(yōu)于另外兩組,差異顯著(P<0.05)。在第10 d,菌落總數(shù)雖然并未達到7lg CFU/g的腐敗臨界值[13],但空白組牡蠣明顯變黏,有異味,已發(fā)生輕微腐敗,因此將取樣間隔調(diào)整為3 d。第13 d,高濃度ε-聚賴氨酸處理組菌落數(shù)較空白組仍有顯著差異(P<0.05),直至第16 d與空白組趨于一致。

圖1 牡蠣貯藏過程中菌落總數(shù)變化Fig.1 Changes of the total bacterial count of oysters during the storage注:*:P<0.05,相同貯藏時間與空白組差異顯著; **:P<0.01,在相同貯藏時間 與空白組差異極顯著;圖2～圖5同。

2.2 ε-聚賴氨酸處理對貯藏牡蠣pH的影響

測得牡蠣初始pH為6.61±0.01,與文獻[9]測得值相近。研究表明,牡蠣肉在貯藏過程中,會發(fā)生pH先降低后升高的現(xiàn)象[14-15],是由于牡蠣肉中含有較多的糖原,糖原發(fā)生分解生成乳酸,以及ATP酶降解釋放出無機磷[14],使得牡蠣肉的pH下降,此后牡蠣肉中的蛋白質(zhì)逐漸分解,產(chǎn)生氨以及胺類等堿性含氮物質(zhì),造成pH逐漸升高。圖2中,三組牡蠣在貯藏期間pH沒有明顯上升,貯藏5 d的牡蠣肉的pH沒有明顯改變(P>0.05),表明此時還未發(fā)生糖原的大量分解;但是10 d的pH有不同程度的降低,pH劇烈下降,與兩個ε-聚賴氨酸處理組相比,空白組pH降低顯著(P<0.05),而高濃度處理組對pH的影響與空白組相比差異極顯著(P<0.01),變化趨勢與菌落數(shù)一致?？瞻捉M和低濃度處理組發(fā)生pH持續(xù)降低,可能是因為微生物降解蛋白質(zhì)的程度要弱于乳糖的降解速率。高濃度處理組牡蠣在貯藏后期(16～19 d)pH稍有上升,表明該組牡蠣蛋白質(zhì)分解速度加快,釋放堿性含氮物質(zhì)的量增加。

圖2 牡蠣貯藏過程中pH變化Fig.2 Changes of pH of oysters during the storage

2.3 ε-聚賴氨酸處理對牡蠣貯藏期間TVB-N的影響

牡蠣在貯藏過程中由于微生物和酶的作用發(fā)生自溶,蛋白質(zhì)逐漸分解產(chǎn)生胺類等堿性含氮物質(zhì),隨著牡蠣體內(nèi)的微生物大量繁殖,生成氨、甲胺和三甲胺等揮發(fā)性鹽基氮(TVB-N),積累到一定程度時,表明牡蠣進入腐敗期,不能食用[14]。圖3中貯藏初期0～5 d,空白組和低濃度處理組TVB-N值呈緩慢上升趨勢,無顯著差異(P>0.05),而高濃度處理組與空白組相比差異極顯著(P<0.01);隨后在5～10 d,空白組和低濃度處理組的TVB-N值迅速增加,增加了6.79～7.04 mg/100 g,而高濃度處理組僅增加了1.34 mg/100 g,表明高濃度ε-聚賴氨酸能抑制微生物分解蛋白質(zhì)。推測在貯藏初期,微生物數(shù)量少,分解蛋白質(zhì)的速度慢,隨著微生物的大量增殖,降解速率也隨之迅速提升。空白組牡蠣在第10 d已經(jīng)出現(xiàn)輕微腐敗現(xiàn)象,而TVB-N值大約在(22.95±0.90) mg/100 g,遠低于海產(chǎn)魚在腐敗初期的TVBN值(30 mg/100 g)[16],而本研究實驗發(fā)現(xiàn),TVB-N值為20 mg/100 g時,牡蠣已到達腐敗初期[2,17],有的研究中TVB-N值僅為10 mg/100 g,牡蠣中菌落數(shù)卻已經(jīng)超標,牡蠣也已發(fā)生腐敗[9,18]。結(jié)果表明TVB-N值與牡蠣的腐敗程度是相關(guān)的,TVB-N值越高,腐敗程度越嚴重;但針對不同品種[18],甚至同一海域的同品種牡蠣[9],不同處理方式,甚至可能源于不同的季節(jié),造成可接受的劣變TVB-N值界限有很大差異,并不能單純設(shè)定一個TVB-N值用于評定牡蠣的新鮮度。

表1 空白組牡蠣質(zhì)構(gòu)TPA的變化情況Table 1 Texture profile analysis(TPA)of the control oysters

注:*:P<0.05,相同指標與貯藏0 d牡蠣差異顯著;表2同。

圖3 牡蠣貯藏過程中TVB-N值變化Fig.3 Changes of total volatile basic nitrogen of the oysters during the storage

2.4 ε-聚賴氨酸處理對貯藏牡蠣TPA質(zhì)構(gòu)的影響

通過表1中空白組牡蠣質(zhì)構(gòu)結(jié)果發(fā)現(xiàn),在貯藏期間,牡蠣即使發(fā)生輕微腐敗變質(zhì),彈性、內(nèi)聚性和粘附性等參數(shù)均沒有顯著差異(P>0.05),因此,不作為評測牡蠣品質(zhì)的直接指標。此外,咀嚼性是由硬度、內(nèi)聚性、彈性共同決定的,有研究發(fā)現(xiàn)硬度與咀嚼性呈極顯著正相關(guān)[19-21],本實驗結(jié)果也表明,硬度與咀嚼性的變化趨勢一致。因此,本研究選擇差異性顯著的參數(shù)(硬度和回復(fù)性)作為考察指標,用以評價ε-聚賴氨酸處理對牡蠣貯藏期間質(zhì)構(gòu)TPA的影響。

由圖4A可知,空白組牡蠣在貯藏初期的0～10 d,硬度快速減小,在10～16 d開始放緩,推測微生物代謝活躍和酶的作用使牡蠣發(fā)生自溶,蛋白質(zhì)逐漸分解導(dǎo)致肉質(zhì)結(jié)構(gòu)松散,硬度變差[22]。而ε-聚賴氨酸處理過的牡蠣在0～5 d硬度變化趨勢與空白組相近,結(jié)合高濃度ε-聚賴氨酸組的牡蠣菌落總數(shù)、pH和TVB-N值均得到有效控制可知,蛋白質(zhì)分解程度應(yīng)優(yōu)于空白組,但0～5 d各組牡蠣減小趨勢一致,表明此時牡蠣硬度的變化與蛋白質(zhì)的分解無明顯相關(guān)性,可能是影響牡蠣硬度的其他因素發(fā)生變化,如水分、脂肪、鹽含量、淀粉含量等[19];貯藏5～10 d，ε-聚賴氨酸處理組的牡蠣硬度減小趨勢放緩,優(yōu)于空白組,但差異并不顯著(P>0.05),2%ε-聚賴氨酸處理的牡蠣在10～13 d,硬度增加極顯著(P<0.01),表明2%ε-聚賴氨酸對于控制微生物增殖代謝,維持牡蠣硬度有顯著效果。

回復(fù)性是測量樣品從第一次變形中回復(fù)的能力[23],牡蠣貯藏過程中回復(fù)性變化如圖4B所示,空白組牡蠣在0～5 d,回復(fù)性迅速下降,此后發(fā)生波動下降,可能源于牡蠣自溶致組織軟爛,而導(dǎo)致回復(fù)性降低;2% ε-聚賴氨酸處理的牡蠣在0～5 d下降趨勢減緩,在第10 d差異顯著(P<0.05),此后,其回復(fù)性變化趨勢與空白組一致,差異不顯著(P>0.05)。TPA質(zhì)構(gòu)結(jié)果表明,ε-聚賴氨酸可通過抑制微生物的增殖,延緩牡蠣自溶的程度進而提高牡蠣貯藏品質(zhì)。

圖4 ε-聚賴氨酸處理對牡蠣貯藏期間質(zhì)構(gòu)TPA的影響Fig.4 Effects of ε-polylysine treatment on texture profile analysis(TPA)of oysters during the storage注:A:牡蠣貯藏期間硬度的變化; B:牡蠣貯藏期間回復(fù)性的變化。

2.5 ε-聚賴氨酸處理對牡蠣貯藏期間FAA的影響

FAA是水產(chǎn)品風(fēng)味品質(zhì)和評價鮮度的一個重要指標,在貯藏0 d,對未處理牡蠣中的FAA進行測定,檢測出表2中所示的9種游離氨基酸,以丙氨酸(Ala)、甘氨酸(Gly)、谷氨酸(Glu)的含量最豐富,Ala和Gly為呈甜味氨基酸,Glu為呈鮮味氨基酸[24-26],三者占檢出游離氨基酸總量的85.35%。與貯藏0 d相比,Glu含量先升高后降低,差異顯著(P<0.05);而Gly含量在5 d顯著(P<0.05)降低后,不再升高;Ala則與之相反,在貯藏初期0～16 d,含量無顯著變化,反而在16～19 d顯著(P<0.05)升高。

表2 未經(jīng)處理的牡蠣中游離氨基酸的含量Table 2 Free amino acids contents of untreated oysters

注:*:0 d牡蠣中所檢測出的游離氨基酸占總游離氨基酸的比例;(+):味道愉悅;(-):味道不佳;-:未有文獻報道;ND:未檢測出。

圖5 ε-聚賴氨酸處理對牡蠣貯藏期間FAA的影響Fig.5 Effects of ε-polylysine treatment on free amino acids of the oysters during the storage注:A:甘氨酸含量變化;B:谷氨酸含量變化;C:丙氨酸含量變化;D:游離氨基酸含量變化。

不同實驗組的差異如圖5A～圖5C所示,在貯藏初期0～5 d,三種主要呈味氨基酸的含量都有不同程度的降低,Gly和Glu下降明顯,表明牡蠣的風(fēng)味品質(zhì)在變差,而Ala含量在貯藏后期有了大幅提高,變化趨勢與陳桂平[27]測定的草魚冷凍期間氨基酸含量一致。在貯藏的0～10 d,三組牡蠣的三種氨基酸含量沒有顯著差異(P>0.05),說明ε-聚賴氨酸對牡蠣風(fēng)味的保持沒有作用;而在貯藏后期,在酶和微生物作用下,蛋白質(zhì)和氨基酸逐漸被分解,使得牡蠣發(fā)生腐敗變質(zhì)[28],10 d后的氨基酸變化趨勢表明,2%ε-聚賴氨酸處理的牡蠣中,Glu和Gly含量較空白組和低濃度處理組變化平緩,其中,在貯藏16～19 d,Glu含量差異顯著(P<0.05),而Ala在16～19 d也表現(xiàn)出了顯著差異(P<0.05),表明2% ε-聚賴氨酸能有效控制微生物增殖和代謝活性。FAA總含量的變化趨勢更能體現(xiàn)出高濃度ε-聚賴氨酸對微生物代謝活性有抑制作用(圖5D),在貯藏后期13 d,隨著蛋白質(zhì)逐漸分解,空白組游離氨基酸含量逐漸升高,高濃度處理組和低濃度處理組游離氨基酸總量要低于空白組,且差異顯著(P<0.05);貯藏的第19 d,空白組游離氨基酸總量達到60.52 mg/g,0.2%和2%ε-聚賴氨酸處理組僅為46.17和43.24 mg/g,差異極顯著(P<0.01),可見ε-聚賴氨酸能抑制微生物對蛋白質(zhì)的降解作用,或可間接證明ε-聚賴氨酸通過抑制微生物增殖從而減緩蛋白質(zhì)的降解過程。

3 結(jié)論

兩種濃度ε-聚賴氨酸(2%和0.2%)對牡蠣均有防腐效果。未經(jīng)處理的牡蠣空白組,在貯藏第5 d,菌落數(shù)即增加了1.29lg CFU/g,由于牡蠣自溶和蛋白質(zhì)分解,在貯藏的5～10 d開始,各項參數(shù)(pH、TVB-N值、TPA質(zhì)構(gòu)、FAA含量)發(fā)生明顯變化;0.2%ε-聚賴氨酸在保藏初期對牡蠣中微生物增殖有抑制作用,菌落數(shù)沒有明顯增加,在5～10 d效果開始減弱,菌落數(shù)迅速增加;2%ε-聚賴氨酸在貯藏初期有殺菌作用,第5 d菌落數(shù)甚至減小了4.95%,同時延緩pH和TVB-N的變化程度,在貯藏的10～13 d發(fā)生顯著(P<0.05)變化。貯藏19 d,高濃度組牡蠣中游離氨基酸增加小于空白組,推測ε-聚賴氨酸可通過緩解牡蠣蛋白質(zhì)的水解過程,改善牡蠣貯藏時間和產(chǎn)品的品質(zhì)。結(jié)果表明,ε-聚賴氨酸主要通過抑制微生物的生長增殖,并抑制微生物對牡蠣的分解來延長牡蠣的保藏時間。

復(fù)合保鮮劑(殼聚糖、茶多酚、溶菌酶)處理牡蠣,能將牡蠣的貨架期延長近1倍[2],而徐莉等[3]則采用響應(yīng)面法對茶多酚、山梨酸、普魯蘭多糖進行復(fù)配組合,證實復(fù)合保鮮劑的保鮮效果要顯著優(yōu)于單一組分的保鮮劑。本研究證實ε-聚賴氨酸能抑制牡蠣微生物增殖,延緩牡蠣腐敗進程,在后續(xù)研究中,或可考慮將其與其他保鮮劑復(fù)配,制備天然、高效防腐保鮮劑,這對于延長牡蠣保鮮期,應(yīng)對鮮牡蠣食用安全隱患可提供有效策略。