黃天虹 張 婭 梁超凡 侯喜林 李 英

(南京農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院/作物遺傳與種質(zhì)創(chuàng)新國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/農(nóng)業(yè)部華東地區(qū)園藝作物生物學(xué)與種質(zhì)創(chuàng)新重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,江蘇 南京 210095)

游離小孢子培養(yǎng)(isolated microspore culture,IMC)是在無菌條件下,通過一定的機(jī)械操作和脅迫處理,阻斷花蕾小孢子的固有發(fā)育途徑,從而轉(zhuǎn)向孢子體發(fā)生途徑,經(jīng)過誘導(dǎo)和培養(yǎng),發(fā)育成為完整可育植株過程的技術(shù)[1]。 不結(jié)球白菜(Brassica campestris ssp. chinensis Makino)為異花授粉植物,自交不親和性強(qiáng),純合較困難,而遺傳穩(wěn)定的純合品系是植物雜種優(yōu)勢(shì)利用必需的育種材料。 傳統(tǒng)自交育種技術(shù)耗時(shí)長(zhǎng)且成本高[2],而游離小孢子培養(yǎng)可以在1 ～2年內(nèi)獲得純合的雙單倍體(doubled haploid,DH),縮短了育種周期,為育種工作者提供了性狀優(yōu)良的品種,擴(kuò)大了不結(jié)球白菜的種質(zhì)資源,滿足了市場(chǎng)需求[3]。

Licher[4]于1982年首次通過游離小孢子培養(yǎng)在甘藍(lán)型油菜(Brassica napus)中獲得了胚狀體。 近年來絕大多數(shù)蕓薹屬作物通過游離小孢子培養(yǎng)均已成功培養(yǎng)出小孢子再生植株[5-7]。 與傳統(tǒng)育種技術(shù)相比,游離小孢子培養(yǎng)能夠快速獲得雙倍體系,可直接用于培育新品種或作為優(yōu)良親本間接應(yīng)用于品種改良[8]。 雙倍體系在育種中不僅能用于快速獲得新品種,還是研究數(shù)量性狀遺傳基礎(chǔ)的重要工具,包括復(fù)雜性狀的遺傳圖譜,如產(chǎn)量或質(zhì)量性狀、最具農(nóng)藝價(jià)值的性狀等[9]。 目前游離小孢子培養(yǎng)在蕓薹屬作物育種中已經(jīng)培育出了許多具有高品質(zhì)、非生物脅迫耐性及抗病的品種[10-12]。 此外,小孢子培養(yǎng)技術(shù)還可以用于轉(zhuǎn)基因研究[13]、突變體育種[14]、生物化學(xué)和生理學(xué)研究[15-16]。

游離小孢子培養(yǎng)技術(shù)在不結(jié)球白菜上雖然已經(jīng)進(jìn)行了多年的育種研究和應(yīng)用[17-22],但尚未形成一個(gè)完整高效的體系。 本研究通過比較不同處理下不結(jié)球白菜游離小孢子培養(yǎng)的出胚率,探討不結(jié)球白菜游離小孢子培養(yǎng)的影響因素,同時(shí)對(duì)不結(jié)球游離小孢子發(fā)育及植株再生過程進(jìn)行觀察和倍性鑒定,以期為不結(jié)球白菜游離小孢子培養(yǎng)技術(shù)體系的優(yōu)化提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

以20 個(gè)基因型的不結(jié)球白菜為試驗(yàn)材料,由南京農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院白菜系統(tǒng)生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室提供(表1)。 2015年9月,對(duì)不結(jié)球白菜種子低溫春化處理,并播種于穴盤內(nèi),11月中旬定植于江蘇省農(nóng)業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院(句容)溫室大棚,植株生長(zhǎng)期間同常規(guī)溫室管理。 2016年2月,植株開始抽薹現(xiàn)蕾開花,從初花期開始,整個(gè)植株的開花期間,都可以選取合適長(zhǎng)度的花蕾進(jìn)行游離小孢子培養(yǎng)。

表1 供體植株編號(hào)及基因型Table 1 Donor plant code and genotype

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 取樣與觀察 于天氣晴朗的9:00-11:00 對(duì)無病蟲害、長(zhǎng)勢(shì)健壯的植株花蕾進(jìn)行取樣,為減少環(huán)境誤差,每個(gè)基因型從不同植株上取樣,花蕾于4℃貯存?zhèn)溆谩?將花蕾置于光學(xué)顯微鏡下,隨機(jī)選取10 個(gè)視野觀察小孢子的形態(tài)結(jié)構(gòu),并統(tǒng)計(jì)視野內(nèi)單核晚期的小孢子所占比例。 對(duì)花瓣/花藥(petal/anther,P/A)的長(zhǎng)度比值進(jìn)行比較,確定適合的花蕾大小,備用。

1.2.2 游離小孢子培養(yǎng)試驗(yàn) 參照張振超等[23]的方法,并略作改進(jìn)。 將采集的花蕾樣本用5.6%次氯酸鈉溶液消毒18 min,無菌水沖洗3 min,并重復(fù)操作3次,然后將花蕾轉(zhuǎn)移到100 mL 小燒杯中,加入2 mL B5 培養(yǎng)基(pH 值6.0),先用玻璃棒輕輕擠壓,然后充分研磨成勻漿,過濾后轉(zhuǎn)移至50 mL 離心管中,添加B5 培養(yǎng)基至7.5 mL,1 000 r·min-1離心5 min,保留沉淀,并添加B5 培養(yǎng)基至7.5 mL,1 000 r·min-1離心5 min,重復(fù)上述操作2 次。 于沉淀中加1/2 NLN 培養(yǎng)基(pH 值6.0)至40 mL,然后加入100 μL 活性炭溶液,最后將小孢子懸浮液分裝至大小為60 mm×15 mm 的無菌塑料培養(yǎng)皿中,每皿4 mL,用Parafilm 膜對(duì)培養(yǎng)皿進(jìn)行封口處理,并進(jìn)行33℃熱激處理1 d,然后轉(zhuǎn)移至25℃無菌培養(yǎng)室內(nèi)進(jìn)行暗培養(yǎng)。 2 ～3 周后,當(dāng)透明無污染的培養(yǎng)皿中出現(xiàn)肉眼可見的白色小顆粒時(shí),將其轉(zhuǎn)入60 r·min-1的搖床振蕩暗培養(yǎng)。 3 ～4 周后統(tǒng)計(jì)小孢子胚的數(shù)目,計(jì)算出胚率。

1.2.3 不同基因型對(duì)游離小孢子培養(yǎng)的影響 按照1.2.2 所述方法,對(duì)20 個(gè)基因型的不結(jié)球白菜進(jìn)行游離小孢子培養(yǎng),每個(gè)處理設(shè)3 次重復(fù),每重復(fù)培養(yǎng)10個(gè)皿,每皿40 個(gè)花蕾。 探究不同基因型對(duì)不結(jié)球白菜胚胎發(fā)生的影響。

1.2.4 低溫脅迫處理對(duì)游離小孢子培養(yǎng)的影響 選取H1、H18、H19 和H20 4 個(gè)具有代表性基因型的不結(jié)球白菜并對(duì)其進(jìn)行低溫脅迫處理。 采集到的花蕾經(jīng)4℃低溫脅迫處理0、1、2 d 后進(jìn)行游離小孢子培養(yǎng),培養(yǎng)步驟同1.2.2。 每個(gè)處理設(shè)3 次重復(fù),每重復(fù)培養(yǎng)10 個(gè)皿,每皿40 個(gè)花蕾。

1.2.5 頭孢噻胯處理對(duì)游離小孢子胚胎培養(yǎng)的影響選取H1、H16 和H18 3 個(gè)具有代表性基因型的不結(jié)球白菜進(jìn)行試驗(yàn)。 游離小孢子培養(yǎng)步驟同1.2.2。 最后1 次離心結(jié)束后,將游離小孢子分別在添加0(CK)、25、50、100、200 mg·L-1頭孢噻胯的1/2 NLN 培養(yǎng)基中進(jìn)行懸浮培養(yǎng)試驗(yàn)。 30 d 后統(tǒng)計(jì)游離小孢子胚狀體數(shù)量。 每個(gè)處理設(shè)3 次重復(fù),每重復(fù)培養(yǎng)10 個(gè)皿,每皿40 個(gè)花蕾。

1.2.6 游離小孢子植株再生及倍性鑒定試驗(yàn) 植株再生培養(yǎng)參照劉環(huán)環(huán)[22]的方法,并略作改進(jìn)。 在VS-1 300L-U 超凈工作臺(tái)(蘇靜安泰,蘇州)上將發(fā)育良好的子葉胚轉(zhuǎn)移到B5 固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)2 ～3 周。 待子葉胚長(zhǎng)大至3～4 片真葉,轉(zhuǎn)入MS 固體培養(yǎng)基中進(jìn)行生根培養(yǎng)。 在MS 培養(yǎng)基中培養(yǎng)2 ～3 周,待發(fā)育為組織分化明顯的小植株時(shí),煉苗后移栽。 利用AccuriTmC6 流式細(xì)胞儀(BD 公司,美國(guó))采用倍性測(cè)量法[21]鑒定倍性,倍體植株的峰值在220 nm 左右出現(xiàn),因此在220 nm 左右出現(xiàn)峰值的即為雙倍體。

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)通過Microsoft Excel 2007 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,運(yùn)用SPSS 19.0 進(jìn)行顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不結(jié)球白菜游離小孢子發(fā)育時(shí)期與P/A 之間的關(guān)系

由表2 可知,當(dāng)大多數(shù)小孢子處于單核晚期時(shí),不結(jié)球白菜的P/A 介于0.8～1.1 之間;當(dāng)小孢子處于單核中期到晚期的過渡時(shí)期時(shí),P/A 大于1.1(圖1-a);當(dāng)大多數(shù)小孢子處于單核晚期時(shí),P/A 為0.85 ～1.1(圖1-b);小孢子接近成熟時(shí),花藥伸長(zhǎng),即將授粉,此時(shí)P/A 小于0.85(圖1-c)。 因此,不結(jié)球白菜游離小孢子培養(yǎng)取材一般選擇P/A 在0.85 ～1.1 之間的花蕾,此時(shí)的花蕾黃中帶綠,是小孢子培養(yǎng)的最佳時(shí)期。

圖1 游離小孢子的發(fā)育時(shí)期Fig.1 The development phase of free microspores

表2 供體植株游離小孢子單核晚期的P/ATable 2 The length ratio of petalslanthers at the late mononuclear stage of isdated microspores of donor plant

2.2 不同基因型對(duì)不結(jié)球白菜游離小孢子培養(yǎng)胚胎發(fā)生的影響

由表3 可知,20 個(gè)不結(jié)球白菜材料中有10 個(gè)基因型誘導(dǎo)出胚,誘導(dǎo)頻率為50%。 此外,10 個(gè)品種的出胚率具有顯著差異,出胚率最高的基因型為H20,每10 個(gè)花蕾出現(xiàn)胚狀體數(shù)7.75,其次是H10,為6.88胚·10 蕾-1。

2.3 低溫脅迫處理對(duì)不結(jié)球白菜游離小孢子培養(yǎng)胚胎發(fā)生的影響

由表4 可知,未經(jīng)低溫脅迫處理時(shí),4 個(gè)基因型均未產(chǎn)生胚狀體;低溫脅迫處理1 d 時(shí)游離小孢子的出胚率最高,且不同基因型的小孢子出胚率存在差異,H20 出胚率最高,為7.66 胚·10 蕾-1,其次是H18(7.33 胚·10 蕾-1),H19 出胚率最低,僅0.67 胚·10蕾-1;低溫脅迫處理2 d時(shí)僅H1出胚。 綜上表明,4℃低溫脅迫處理對(duì)游離小孢子胚胎的發(fā)生能力與處理時(shí)間和基因型密切相關(guān)。

表3 不同基因型對(duì)游離小孢子出胚率的影響Table 3 Effect of different genotypes on germination rate of isolated microspores

表4 4℃低溫脅迫處理對(duì)游離小孢子出胚率的影響Table 4 Effect of 4℃cold stress on the germination rate of isolated micropores /(胚·10 蕾-1)

2.4 頭孢噻胯對(duì)不結(jié)球白菜游離小孢子培養(yǎng)胚胎發(fā)生的影響

由圖2 可知,游離小孢子出胚率與頭孢噻胯濃度和基因型密切相關(guān),未添加頭孢噻胯時(shí),基因型H18出胚率最高,胚狀體數(shù)為17 個(gè),而基因型H1 和H16出胚量極少,分別為0.5 和0 個(gè),添加頭孢噻胯會(huì)對(duì)基因型H18 中胚胎發(fā)生產(chǎn)生抑制作用,對(duì)基因型H1 和H16 產(chǎn)生一定的促進(jìn)作用;添加50 mg·L-1頭孢噻胯時(shí),基因型H1 和H16 的出胚率均最大,胚狀體數(shù)分別為4 個(gè)和6.5 個(gè)。

圖2 頭孢噻胯濃度對(duì)游離小孢子培養(yǎng)胚胎發(fā)生的影響Fig.2 Effect of cefotaxime concentration on embryogenesis of isolated microspore

2.5 小孢子胚胎發(fā)育過程觀察及分析

在倒置顯微鏡下觀察不結(jié)球白菜游離小孢子胚胎發(fā)育過程,熱激處理1 d 時(shí)大多游離小孢子細(xì)胞未獲得胚胎發(fā)生能力(圖3-a),少數(shù)細(xì)胞膨大并開始發(fā)生對(duì)稱分裂(圖3-b);經(jīng)過一系列的不規(guī)則的細(xì)胞分裂形成胚胎細(xì)胞簇,此時(shí)該細(xì)胞簇仍由小孢子外壁約束(圖3-c),然后胚胎細(xì)胞簇繼續(xù)發(fā)育形成球形胚(圖3-d);培養(yǎng)7 d 左右時(shí)部分存活的小孢子發(fā)生多次分裂,最終導(dǎo)致細(xì)胞外壁開始破裂(圖3-e),并釋放出帶胚柄的胚胎(圖3-f),觀察到正在進(jìn)行縱向分裂的多細(xì)胞結(jié)構(gòu)(圖3-g);2～3 周后肉眼便可觀察到白色小點(diǎn),其生長(zhǎng)迅速,很快長(zhǎng)成子葉胚(圖3-h、i)及愈傷組織(圖3-j)。 隨著培養(yǎng)天數(shù)的增加,存活的游離小孢子數(shù)量不斷減少,只有少數(shù)的游離小孢子(＜5%)成功形成胚狀體。

2.6 游離小孢子胚胎再生能力分析

圖3 小孢子胚胎發(fā)育過程Fig.3 Microspore-derived embryo development

經(jīng)過游離小孢子培養(yǎng)獲得的胚狀體,進(jìn)行植株再生試驗(yàn),由表5 可知,從胚狀體到再生幼苗階段,胚胎再生頻率因基因型不同而存在差異,H6、H15 和H19均在胚狀體階段死亡,未實(shí)現(xiàn)幼苗再生;H1、H13、H16、H18 和H20 均實(shí)現(xiàn)幼苗再生,但再生頻率差異較大。

2.7 游離小孢子植株倍性鑒定分析

結(jié)合植株的形態(tài)觀察結(jié)果,對(duì)游離小孢子植株進(jìn)行流式細(xì)胞儀倍性鑒定分析,由表6 可知,共檢測(cè)出21 個(gè)雙倍體和2 個(gè)單倍體,自然加倍率為91.3%。 其中,H1、H13 和H16 的自然加倍率達(dá)到100%;H18 和H20 自然加倍率分別為80%和90%。 綜上表明,不結(jié)球白菜的游離小孢子植株自然加倍率較高。

2.8 游離小孢子植株再生過程

對(duì)F2材料H20 從游離小孢子胚胎發(fā)育到植株再生過程進(jìn)行持續(xù)觀察,結(jié)果表明,子葉胚的初始顏色一般為淡黃色(圖4-a),隨著子葉胚的不斷發(fā)育,子葉胚開始由淡黃色轉(zhuǎn)變?yōu)榫G色,胚軸伸長(zhǎng),并出現(xiàn)根毛(圖4-b)。 繼續(xù)觀察發(fā)現(xiàn),部分子葉胚在植株的根部產(chǎn)生愈傷,并褐化死亡(圖4-c),部分子葉胚可直接發(fā)育成完整植株,且組織分化完全(圖4-d、e、f)。 對(duì)正常發(fā)育的植株進(jìn)行煉苗后,1 個(gè)月后將其轉(zhuǎn)到人工氣候室中培養(yǎng),可觀察到不同形態(tài)的植株(圖4-h);培養(yǎng)6 個(gè)月后植株的形態(tài)仍各不相同(圖4-i)。

表5 游離小孢子胚胎植株再生狀況Table 5 The condition of plant regeneration of microspore-derived embryos

表6 不結(jié)球白菜游離小孢子胚胎植株倍性鑒定Table 6 Ploidy identification of regeneration plant of microspore-derived embryos in non-heading Chinese cabbage

3 討論

大量研究表明,基因型和發(fā)育時(shí)期是影響游離小孢子胚胎發(fā)生的主要因素[24-28],如不結(jié)球白菜大部分基因型出胚率均小于5 胚·蕾-1[22,29-30],甘藍(lán)型油菜品種浙雙758 和浙雙72 出胚率能達(dá)到60 ～70胚·蕾-1[13], 花 椰 菜 品 種 xiaxue40 能 達(dá) 到 178胚·蕾-1[25],大白菜能達(dá)到42.4 胚·蕾-1[31],本試驗(yàn)中的20 個(gè)不同基因型的不結(jié)球白菜中僅10 個(gè)成功誘導(dǎo)出胚,且整體出胚率不高,最大的出胚率為7.75 胚·10蕾-1,與其他十字花科蔬菜相比,不結(jié)球白菜出胚率較少,且基因型對(duì)小孢子培養(yǎng)誘導(dǎo)效果起決定作用。 發(fā)育時(shí)期也是影響游離小孢子培養(yǎng)出胚率的關(guān)鍵因素,一般處于單核晚期至雙核早期的游離小孢子較容易激發(fā)配子體胚胎發(fā)生能力,從而獲得胚胎甚至完整植株。但是同一物種內(nèi)基因型、生長(zhǎng)環(huán)境等都會(huì)影響花蕾的大小,有的花蕾很小,可能已經(jīng)進(jìn)入雙核晚期,但P/A則不會(huì)因?yàn)榄h(huán)境變化發(fā)生太大的改變,相對(duì)選擇花蕾大小來說,比較可靠[28]。 本研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)P/A 介于0.85～1.10 時(shí),小孢子主要處于單核晚期,此時(shí)是游離小孢子培養(yǎng)誘導(dǎo)胚胎發(fā)生的最佳階段。

影響游離小孢子胚胎發(fā)生的因素有很多,如低溫預(yù)處理[20-22]、蔗糖濃度[21]、小孢子培養(yǎng)密度[24]、培養(yǎng)基的組成[25-26],本研究發(fā)現(xiàn)4℃低溫脅迫處理和頭孢噻胯也會(huì)影響游離小孢子胚胎發(fā)生。 4℃低溫脅迫處理1 d 時(shí),出胚率最高,這可能是因?yàn)榈蜏匮舆t了所采集花蕾的生長(zhǎng),并使其保持在一個(gè)較高的活性狀態(tài)[2]。 頭孢噻胯是一種抗生素,其對(duì)真核生物毒性較低,但對(duì)微生物有殺菌作用,此外,還具有類似于生長(zhǎng)素的活性,可以促進(jìn)體細(xì)胞胚胎發(fā)生及植株再生[32-34]。 本研究結(jié)果表明,H1 和H16 中1/2 NLN 培養(yǎng)基添加50 mg·L-1頭孢噻胯對(duì)其胚的誘導(dǎo)效果最好,這與Ahmadi 等[35]和曾愛松等[36]的研究結(jié)果一致。但在H18 中未添加頭孢噻胯的處理出胚率最高,表明頭孢噻胯對(duì)不結(jié)球白菜游離小孢子胚胎發(fā)生的影響與基因型相關(guān)。

圖4 H20 游離小孢子植株再生過程Fig.4 The regeneration of microspore-derived plant of H20

游離小孢子培養(yǎng)發(fā)育成長(zhǎng)形成的胚狀體,在形成完整可育的植株之前還需要經(jīng)歷再生培養(yǎng)及植株移栽過程,因?yàn)橛坞x小孢子為花粉未成熟的配子體,經(jīng)歷胚胎發(fā)生后可能會(huì)產(chǎn)生加倍。 目前,有關(guān)游離小孢子培養(yǎng)植株的加倍的研究較多,如毛忠良等[28]對(duì)羽衣甘藍(lán)游離小孢子植株進(jìn)行秋水仙堿處理,并結(jié)合流式細(xì)胞儀倍性鑒定,發(fā)現(xiàn)其加倍率達(dá)到78.4%,提高了游離小孢子培養(yǎng)技術(shù)的利用率;成妍等[29]通過對(duì)不結(jié)球白菜暑綠和黃幫小孢子植株進(jìn)行倍性鑒定,發(fā)現(xiàn)暑綠的自然加倍率達(dá)到90%,而黃幫的自然加倍率為62%,說明基因型不同,其自然加倍率也不同;袁素霞等[37]通過研究細(xì)胞倍性與氣孔保衛(wèi)細(xì)胞葉綠體數(shù)的相關(guān)性,提供了一種簡(jiǎn)便經(jīng)濟(jì)的倍性鑒定方法;王玉書等[38]研究發(fā)現(xiàn)觀賞羽衣甘藍(lán)中不同基因型倍性變異具有差異性,鑒定結(jié)果表明單倍體、二倍體和四倍體同時(shí)存在。 本試驗(yàn)通過流式細(xì)胞儀對(duì)所獲得的游離小孢子植株進(jìn)行倍性鑒定,共檢測(cè)出21 個(gè)雙倍體和2 個(gè)單倍體,自然加倍率為91.3%。 但不結(jié)球白菜的自然加倍率較高的原因尚不清楚,有待進(jìn)一步更深入的研究。

4 結(jié)論

本試驗(yàn)結(jié)果表明,基因型是影響小孢子培養(yǎng)的出胚率和其后的植株再生的關(guān)鍵因素。 當(dāng)P/A 為0.85～1.10 時(shí),不結(jié)球白菜小孢子主要處于單核晚期;4℃低溫脅迫處理1 d 時(shí)出胚率較高,頭孢噻胯對(duì)出胚率的影響與基因型相關(guān),不結(jié)球白菜植株自然加倍率較高,為91.3%。 頭孢噻胯對(duì)小孢子培養(yǎng)具有基因特異性相一致,但由于本試驗(yàn)出胚率較少,僅能對(duì)今后的不結(jié)球白菜游離小孢子培養(yǎng)提供參考價(jià)值。