朱 飛，冉 雷，蘇 娣，范彩云，張子軍，劉政權(quán)，宛曉春，程建波

（1. 安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，安徽 合肥 230036；2. 安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)茶樹生物學(xué)與資源利用國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，安徽 合肥 230036）

茶渣是茶葉用于生產(chǎn)速溶茶或提取茶多酚后剩余的殘?jiān)Ｗ鳛槭澜缟现饕牟枞~生產(chǎn)國之一，我國每年的茶渣產(chǎn)量有數(shù)十萬噸[1]。分析表明，茶渣中含 26%～35% 的粗蛋白 (crude protein, CP)，1.5%～4.5%的粗脂肪 (ether extract，EE)，3.3%～4.7%的灰分(Ash)，具有一定的飼用價(jià)值[1]。飼喂茶渣可以減少雞腹部脂肪堆積[2]，增強(qiáng)奶牛血漿抗氧化能力[3]，提高育肥豬的生長性能和肉品質(zhì)[4]。然而，茶渣含有的茶單寧(tea tannin，TTN)和生物堿等物質(zhì)不僅降低了茶渣的適口性[5]，還會(huì)抑制胰α-淀粉酶的作用[6]和螯合飼料中的金屬元素[7]，降低機(jī)體對淀粉和金屬元素的利用率；另一方面，茶渣高含水率和高養(yǎng)分含量使其極易腐敗變質(zhì)，如果處理不當(dāng)或者處理不及時(shí)，茶渣在失去飼用價(jià)值的同時(shí)還會(huì)帶來環(huán)境污染問題。烘干和青貯是兩種較為常用的保存高含水率飼料的方法，但烘干會(huì)大大增加成本，不適合大批量生產(chǎn)，而對茶渣進(jìn)行青貯保存則是一種高效經(jīng)濟(jì)的手段。

青貯是一項(xiàng)在厭氧條件下，原料中的水溶性碳水化合物 (water soluble carbohydrate, WSC)被原料上附著或人為添加的乳酸菌轉(zhuǎn)化為乳酸等有機(jī)酸，使得pH降低，進(jìn)而有效抑制有害微生物的生長繁殖以長時(shí)間儲(chǔ)存青綠飼料的技術(shù)[8]。但是茶渣含水率高，WSC含量低，單獨(dú)青貯很難得到較為優(yōu)質(zhì)的飼料，因此，通常通過將茶渣與麥麩和乳酸菌制劑混合來降低茶渣的含水率并提高WSC含量和乳酸菌數(shù)量，改善茶渣的青貯條件，以達(dá)到較好的青貯效果。目前鮮見有關(guān)茶渣青貯加工工藝的報(bào)道，本研究通過分析不同麥麩含量和乳酸菌制劑濃度對茶渣青貯品質(zhì)和養(yǎng)分含量的影響，篩選出較優(yōu)的茶渣青貯工藝參數(shù)，以期為茶渣非常規(guī)飼料資源開發(fā)利用提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 茶渣和麥麩

茶渣由安徽紅星藥業(yè)股份有限公司提供，麥麩購買自農(nóng)貿(mào)市場，養(yǎng)分含量如表1所列。

1.1.2 乳酸菌制劑

青貯寶為乳酸菌制劑，購于山東寶來利來生物工程股份有限公司，主要由植物乳桿菌、戊糖片球菌、纖維素酶、半纖維素酶、葡聚糖、木聚糖酶、細(xì)菌生長促進(jìn)劑、保護(hù)劑及載體等組成，活菌數(shù) ≥ 1.0 × 109CFU·g-1，酶活 ≥ 600 U·g-1。

1.2 試驗(yàn)方法

采用5 × 4雙因素設(shè)計(jì)，兩個(gè)因素分別為麥麩含量與乳酸菌制劑濃度，其中，麥麩含量設(shè)置5個(gè)梯度，分別為0、5%、10%、15%和20%；乳酸菌制劑濃度設(shè)置4個(gè)梯度，分別為0、50、100和200 mg·kg-1；共 20 個(gè)處理 (表 2)，每個(gè)處理 3 個(gè)重復(fù)。按照試驗(yàn)設(shè)計(jì)分別稱取一定質(zhì)量的青貯寶菌粉，溶于純水后配制成3種不同濃度的菌液，35 ℃活化1 h后備用；將茶渣和麥麩混合均勻，再將菌液(青貯原料鮮重的5%，不加菌液組以等量純水代替)加入混合原料中，拌勻后以每袋約500 g的量裝入聚乙烯袋 (食品級，22 cm × 32 cm)中，用真空包裝機(jī)抽真空，封口后于室溫(24～33 ℃)密封避光保存，45 d后開封取樣并測定相關(guān)指標(biāo)。

1.3 樣品采集

青貯45 d后開封，混合均勻后取20 g置于250 mL錐形瓶中，加入180 mL超純水，攪拌均勻后用封口膜封口，于4 ℃下靜置24 h后測定pH。再用4層紗布過濾，濾液于-20 ℃下保存，待測氨態(tài)氮(NH3-N)和有機(jī)酸含量。其余樣品105 ℃烘干粉碎，密封保存待測。

1.4 測定指標(biāo)及方法

1.4.1 青貯品質(zhì)測定方法

濾液室溫解凍，3 500 g 離心 15 min，取上清液測定NH3-N和有機(jī)酸含量。LA、AA、丙酸(PA)和丁酸(BA)含量的測定采用高效液相色譜儀(Agilent 1260，美國)，色譜柱為 Agilent TC-C18柱 (250 mm ×4.6 mm，5 μm)，色譜條件：流動(dòng)相 A 為 0.01 mol·L-1KH2PO4溶液(用磷酸調(diào)pH為2.70)，流動(dòng)相B為甲醇，流動(dòng)相A∶B=97∶3，0.45 μm纖維素濾膜過濾后超聲波脫氣，流速為0.6 mL·min-1，紫外檢測波長 210 nm，柱溫 30 ℃，進(jìn)樣量 20 μL。NH3-N 含量采用苯酚-次氯酸鈉比色法[9]，WSC含量采用蒽酮-硫酸比色法[10]，緩沖能值(BC)采用滴定法[11]，綜合評分參照《青貯飼料質(zhì)量評定標(biāo)準(zhǔn)(試行)》(1996)。

1.4.2 營養(yǎng)成分測定方法

DM、CP、Ash、EE、Ca和P含量的測定參照張麗英[12]的方法；NDF、ADF含量的測定參照Van Soest等[13]的方法；TTN含量的測定參照GB/T 8313-2008[14]。

1.5 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析

先用Excel 2007對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行預(yù)處理，然后采用SPSS 20的GLM模型進(jìn)行雙因素方差分析，再結(jié)合 Duncan 氏法進(jìn)行多重比較。P＜0.05 表示差異顯著，所有結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差的形式表示。

表1 茶渣和麥麩的養(yǎng)分含量Table 1 The nutrient content of tea residue and bran

表2 試驗(yàn)混合原料特性Table 2 Characteristics of mixture feeds

2 結(jié)果與分析

2.1 麥麩與乳酸菌制劑對茶渣青貯品質(zhì)的影響

pH隨著乳酸菌制劑濃度的增加呈現(xiàn)下降趨勢，其中不添加乳酸菌制劑的青貯茶渣pH最高，200 mg·kg-1的乳酸菌制劑可使青貯茶渣pH顯著低于其他組別(P＜0.05)，當(dāng)乳酸菌制劑濃度為50和100 mg·kg-1時(shí)，兩組青貯茶渣的pH差異不顯著(P ＞ 0.05)(表3)。在麥麩含量為15%和20%的青貯原料中添加100 mg·kg-1乳酸菌制劑可使NH3-N/TN顯著低于其他組別(P＜0.05)，而當(dāng)麥麩含量為5%時(shí)，各乳酸菌制劑濃度對NH3-N/TN無顯著影響(P ＞ 0.05)。隨著乳酸菌制劑濃度的增加，各處理組的LA含量均顯著增加(P＜0.05)，而AA含量均顯著降低(P＜0.05)，其中在麥麩含量相同的情況下，乳酸菌制劑濃度為100和200 mg·kg-1時(shí)，AA含量差異不顯著(P ＞ 0.05)，但顯著低于其他兩個(gè)乳酸菌制劑濃度青貯茶渣的AA含量(P＜0.05)。在各組青貯茶渣中均未檢測到PA和BA。綜合評分?jǐn)?shù)據(jù)顯示，青貯茶渣的綜合得分隨著麥麩含量和乳酸菌制劑濃度的升高而升高，當(dāng)麥麩含量達(dá)到15%、乳酸菌制劑濃度達(dá)到100 mg·kg-1時(shí)，綜合得分基本超過98分，屬于優(yōu)質(zhì)青貯飼料。根據(jù)主效應(yīng)趨勢分析，麥麩含量與青貯茶渣的pH、NH3-N/TN和LA含量均呈線性關(guān)系，與AA含量呈二次曲線關(guān)系，且當(dāng)麥麩含量為10%時(shí)，AA含量達(dá)到最高；乳酸菌制劑濃度與青貯茶渣的pH、LA和AA含量均呈線性關(guān)系，與NH3-N/TN呈二次曲線關(guān)系，且當(dāng)乳酸菌制劑濃度為100 mg·kg-1時(shí)，NH3-N/TN最低。

表3 麥麩與乳酸菌制劑對茶渣青貯品質(zhì)的影響Table 3 Effect of bran and lactic acid bacteria preparations on the silage quality of tea residue

2.2 麥麩與乳酸菌制劑對青貯茶渣養(yǎng)分含量的影響

青貯茶渣的DM含量隨著麥麩含量的增加而顯著升高(P＜0.05)，添加乳酸菌制劑之后，DM含量逐漸降低，其中僅在麥麩含量為20%時(shí)，各處理組的DM含量差異不顯著(P ＞ 0.05)(表4)。CP含量隨著麥麩含量的升高而逐漸下降，除5%麥麩含量的青貯茶渣之外，在麥麩含量相同的情況下，青貯茶渣的CP含量與乳酸菌制劑濃度呈正相關(guān)關(guān)系。因麥麩的Ash含量高于茶渣的Ash含量，所以青貯茶渣的Ash含量與麥麩含量正相關(guān)關(guān)系；在麥麩含量為0、10%和15%的3組青貯茶渣中，100 mg·kg-1乳酸菌制劑可使Ash含量達(dá)到同組最高。青貯茶渣的ADF含量與麥麩含量和乳酸菌制劑濃度負(fù)相關(guān)。除麥麩含量為20%的青貯茶渣之外，其他各組乳酸菌制劑對TTN含量無顯著影響(P ＞ 0.05)，麥麩可以顯著降低青貯茶渣中TTN含量(P＜0.05)，而乳酸菌制劑則提高了TTN含量。從主效應(yīng)趨勢分析可以看出，麥麩含量與青貯茶渣的DM、CP、Ash、ADF和TTN含量均呈線性關(guān)系，乳酸菌制劑濃度與青貯茶渣的DM、CP、ADF和TTN含量均呈線性關(guān)系，與Ash含量呈二次曲線關(guān)系，且當(dāng)乳酸菌制劑濃度為100 mg·kg-1時(shí)，Ash含量最高。

表4 麥麩與乳酸菌制劑對青貯茶渣養(yǎng)分含量的影響Table 4 Effect of bran and lactic acid bacteria preparations on the nutrient content of silage tea residue

3 討論

3.1 麥麩和乳酸菌制劑對茶渣青貯品質(zhì)的影響

適宜的WSC和DM含量以及較低的BC是保證青貯能夠成功的必要條件[15]。WSC是乳酸菌正常生長的營養(yǎng)物質(zhì)之一，研究表明，原料中WSC含量高于鮮重的3%時(shí)，青貯才能成功[16]，而本研究茶渣的WSC含量僅為0.76%，遠(yuǎn)不能滿足乳酸菌的生長需求，麥麩的加入提高了青貯原料中WSC含量，有效改善發(fā)酵條件，為乳酸菌的生長提供了物質(zhì)基礎(chǔ)，與謝婉等[17]在馬鈴薯(Solanum tuberosum)莖葉中加入麥麩獲得良好青貯效果的研究結(jié)果一致。至于麥麩含量為10%處理組的AA含量達(dá)到5個(gè)組別的頂峰，可能的原因是此時(shí)原料初始pH適中、WSC和DM含量以及BC處于最優(yōu)營養(yǎng)水平，適合產(chǎn)AA的微生物生存，而麥麩含量為0和5%處理組的原料初始pH較低，抑制了LA和AA的產(chǎn)生，麥麩含量為15%和20%處理組中乳酸菌發(fā)酵成為主導(dǎo)發(fā)酵，開始大量生產(chǎn)LA，抑制了AA的產(chǎn)生，所以AA含量隨著麥麩含量的增加呈現(xiàn)出先上升后下降的趨勢。在加入麥麩提高WSC含量的同時(shí)，青貯原料的DM含量也在逐步上升。研究表明，當(dāng)青貯原料DM含量在60%～75%時(shí)，高DM含量的青貯品質(zhì)往往優(yōu)于低DM含量的青貯品質(zhì)[18]。本研究青貯品質(zhì)隨著DM含量的升高而逐漸提高，與上述研究結(jié)論一致。青貯效果也受BC的影響，在青貯過程中，BC會(huì)中和乳酸菌產(chǎn)生的有機(jī)酸，延緩青貯飼料pH的降低，削弱有機(jī)酸對雜菌的抑制作用，最終導(dǎo)致青貯失敗[19]。茶渣和麥麩的BC都較低，但麥麩的相對更低，所以混合原料的BC會(huì)隨著麥麩含量的升高而降低，同時(shí)，本研究的pH降低、LA和AA含量升高等結(jié)果印證了上述說法。

青貯飼料中的NH3-N主要由植物蛋白酶和微生物分解蛋白質(zhì)及氨基酸產(chǎn)生，NH3-N/TN在一定程度上反映了青貯飼料中蛋白質(zhì)的破壞程度。青貯飼料中NH3-N/TN隨著麥麩含量的升高而升高，可能是因?yàn)椴柙现蠾SC含量較低，抑制了雜菌的生長，隨著麥麩的加入，青貯原料的水分和WSC含量適合微生物的增殖，而此時(shí)乳酸菌還未產(chǎn)生足量乳酸來阻止雜菌分解蛋白質(zhì)，所以使得青貯茶渣中NH3-N/TN隨著麥麩含量的增加而逐漸升高，但是本研究中NH3-N/TN最大值為1.71%，符合優(yōu)質(zhì)青貯飼料中NH3-N/TN應(yīng)低于10%的要求，可能是因?yàn)樵险婵瞻b等因素抑制了微生物將蛋白質(zhì)分解為NH3-N的過程。

除適宜的WSC和DM含量以及較低的BC等原料特性之外，決定青貯效果的另一重要條件是乳酸菌發(fā)酵促進(jìn)劑。利用纖維素酶可為乳酸菌供能以及乳酸菌產(chǎn)LA效率高的特點(diǎn)，通過生產(chǎn)大量LA來迅速抑制腐敗菌的活動(dòng)，達(dá)到提高飼料適口性以及延長飼料保質(zhì)期的目的[20]。本研究表明，在混合原料中添加乳酸菌制劑可以顯著降低青貯茶渣的pH和NH3-N/TN，提高LA含量，說明乳酸菌制劑增加了原料上附著的乳酸菌濃度，使茶渣進(jìn)入乳酸發(fā)酵，迅速產(chǎn)生大量LA并降低pH，抑制了雜菌的活性，茶渣中的蛋白質(zhì)和氨基酸得以保留，與Wang等[21]利用乳酸菌制劑發(fā)酵濕綠茶的研究結(jié)果一致。AA和PA均屬于抗真菌和霉菌的揮發(fā)性脂肪酸，可以提高青貯飼料的有氧穩(wěn)定性[22]。研究發(fā)現(xiàn)不管是否添加乳酸菌，青貯茶渣中均含有AA。有研究報(bào)道，青貯飼料中的AA主要有4種來源：一是原料中含有乙酸菌，在初始階段乙酸菌利用物料中殘存的氧氣發(fā)酵產(chǎn)生AA；二是原料中含有異型乳酸菌并進(jìn)行了異型發(fā)酵[23]；三是在發(fā)酵初期，如果原料pH過低，可使同型乳酸菌部分轉(zhuǎn)變?yōu)楫愋腿樗峋a(chǎn)生AA[24]；最后一種是在青貯后期，部分LA會(huì)轉(zhuǎn)化為AA[25]。隨著乳酸菌制劑濃度的增加，AA含量呈現(xiàn)下降趨勢，說明在本研究中，乳酸菌制劑可能通過阻斷其中一種或幾種AA來源途徑來降低AA含量，與花梅[26]的研究結(jié)果一致。腐敗菌和酪酸菌分解蛋白質(zhì)、葡萄糖以及LA的產(chǎn)物即為BA，BA含量的高低直接反映了青貯飼料質(zhì)量的優(yōu)劣[25]。本研究各組均未檢測到BA的存在，說明青貯茶渣中未產(chǎn)生BA，主要是因?yàn)榍噘A茶渣中產(chǎn)生了較多的LA和AA，降低了青貯茶渣的pH，極大程度抑制了腐敗菌和酪酸菌的活性。本研究中茶渣單獨(dú)青貯也能成功，可能是因?yàn)樵险婵彰芊獍b以及原料本身附著有乳酸菌，使得原料進(jìn)行乳酸發(fā)酵，但單獨(dú)青貯的效果遠(yuǎn)不如添加麥麩和乳酸菌制劑的青貯效果。

3.2 麥麩和乳酸菌制劑對青貯茶渣養(yǎng)分含量的影響

青貯飼料的養(yǎng)分含量與青貯原料的養(yǎng)分含量有關(guān)。因茶渣和麥麩的養(yǎng)分含量相差較大，二者按不同比例混合之后會(huì)造成不同組別之間各營養(yǎng)指標(biāo)的差異顯著。麥麩擁有較高的DM、Ash含量和較低的CP、ADF含量，茶渣中含有TTN，所以麥麩的加入提高青貯茶渣的DM、Ash含量，降低CP、ADF和TTN含量。

乳酸菌制劑在青貯過程中除了發(fā)揮乳酸菌的功能之外，其含有的纖維素酶也對青貯品質(zhì)和養(yǎng)分含量有一定影響。纖維素酶將植物細(xì)胞壁等多糖分解為乳酸菌能夠利用的WSC和水，在為乳酸菌供能的同時(shí)降低了飼料纖維和DM含量，提高了CP和Ash含量，改善了茶渣適口性和養(yǎng)分含量。喬宏興等[27]、鄭會(huì)超等[18]在利用乳酸菌制劑青貯苜蓿草粉、稻草等研究中均獲得類似的結(jié)論。曾俊棋和岳萬福[28]利用纖維素酶降低了筍殼中的氰甙含量，付敏等[29]利用混菌發(fā)酵使菜籽餅中的硫苷降解93.53%，惡唑烷硫酮完全降解。可能乳酸菌制劑無法破壞TTN中的苯基苯并吡喃結(jié)構(gòu)，所以本研究中TTN含量會(huì)伴隨青貯茶渣纖維含量的降低而相對提高。

4 結(jié)論

當(dāng)麥麩含量為0～20%，乳酸菌制劑濃度為0～200 mg·kg-1時(shí)，隨著麥麩含量和乳酸菌制劑濃度的增加，青貯茶渣的發(fā)酵品質(zhì)逐漸提高，并在麥麩含量為15%和乳酸菌制劑濃度為100 mg·kg-1時(shí)進(jìn)入平臺(tái)期；綜合考慮青貯品質(zhì)，在85%茶渣 +15%麥麩的混合原料中添加100 mg·kg-1乳酸菌制劑可獲得較優(yōu)質(zhì)的青貯茶渣飼料。