冷傳遠(yuǎn) 郝懷慶 景海春

（1. 中國科學(xué)院植物研究所北方資源植物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100093；2. 中國科學(xué)院大學(xué)，北京 100049）

高粱（Sorghum bicolor）是世界第五大禾谷類作物，是干旱及半干旱地區(qū)的主要糧食作物（http：//www.fao.org）。高粱為C4植物，光合效率高，生物產(chǎn)量大。此外，高粱具有較強(qiáng)的抗逆性和適應(yīng)性，被稱為“沙漠中的駱駝”。高粱品種BTx623于2009年完成全基因組測序，其基因組約為730 Mb，是玉米全基因組的1/3。因其基因組較小，重復(fù)序列少的特點(diǎn)，使其成為研究甘蔗亞族和其他C4作物功能基因組學(xué)的一個(gè)較好的模式作物［1］。甜高粱是普通高粱的變種，屬于禾本科（Gramineae），高粱族（Andropogoneae）高粱屬（Sorghum）甜高粱種［Sorghum bicolor（L.）Moench］栽培甜高粱亞種［Sorghum bicolor（L.）Moench subsp.bicolor］。甜高粱用途廣泛，可用于生產(chǎn)糧食、糖漿、酒精及青貯飼料等，被公認(rèn)為是重要的基于糖、淀粉發(fā)酵生產(chǎn)乙醇的第一代能源植物和基于纖維素發(fā)酵生產(chǎn)乙醇的第二代能源植物［2-6］。

1 高粱莖稈持汁性的意義

甜高粱作為上述這些產(chǎn)業(yè)的重要原料，是因?yàn)槠淝o稈富含水分和糖分。莖稈占甜高粱生物學(xué)產(chǎn)量的70%，是甜高粱重要的能量儲存器官［7］，含有蔗糖、果糖、葡萄糖等可溶性糖。它們是生產(chǎn)乙醇、提高青貯飼料品質(zhì)的主要原料［8-9］。

高粱莖稈中的水分是糖分等光合產(chǎn)物的主要載體，莖稈出汁量對甜高粱的產(chǎn)糖量非常重要。黎大爵和廖馥蓀用出汁量和汁液錘度（Brix）（錘度表示汁液中可溶性糖的含量）估算莖稈用于發(fā)酵的可溶性糖的產(chǎn)量，即莖稈中可發(fā)酵糖分產(chǎn)量=出汁量×錘度［10］。Sankarapandian等［11］的研究表明在乙醇生產(chǎn)過程中莖稈出汁量的貢獻(xiàn)率高達(dá)122.6%。陳連江等［12］得出甜高粱莖稈出汁量與生物產(chǎn)量、汁液錘度、糖分含量等品質(zhì)性狀間相關(guān)性均達(dá)到顯著或極顯著水平。趙香娜等［13］認(rèn)為出汁量與錘度呈極顯著正相關(guān)；錘度與單株莖稈鮮重呈極顯著正相關(guān)。Guan等［14］也認(rèn)為莖稈中糖產(chǎn)量受株高、莖和葉鮮重、莖稈中汁液的錘度及重量的影響。Sanjana Reddy等［15］的研究表明提高莖稈出汁量能顯著提高莖稈糖產(chǎn)量。

此外，甜高粱有很大一部分被用作青貯飼料的制作。青貯飼料是將含有一定水分的新鮮青綠植物材料經(jīng)切碎后放在密閉容器內(nèi)，通過微生物（乳酸菌）厭氧發(fā)酵，達(dá)到保存、保鮮目的而制成的飼料［16］。適宜的水分含量對于青貯飼料的品質(zhì)有重要影響。一般青貯原料水分含量要求為65%-75%，水分含量較低或者較高都會(huì)對青貯飼料的品質(zhì)產(chǎn)生不利影響［16-18］。水分含量較低，會(huì)導(dǎo)致原料在青貯時(shí)不易被壓實(shí)，窖內(nèi)殘留空氣，使原料發(fā)霉變質(zhì)；同時(shí)含水量降低還會(huì)使原料在青貯過程中產(chǎn)熱過多，使pH值升高乙酸含量增加，乳酸菌及其他一些發(fā)酵產(chǎn)物含量降低。青貯原料的含水量過高，首先是滲液問題，不僅會(huì)喪失大量養(yǎng)分，對環(huán)境造成不利影響，同時(shí)高水分易引起梭菌生長，降低發(fā)酵品質(zhì)。

鑒于甜高粱莖稈中水分的重要作用，克隆與鑒定調(diào)控高粱莖稈水分的基因，揭示其遺傳規(guī)律和分子機(jī)理具有重要的理論價(jià)值和應(yīng)用價(jià)值。中國高粱種質(zhì)資源豐富，栽培歷史悠久，所以多年來關(guān)于中國高粱的起源和進(jìn)化問題一直為國內(nèi)外學(xué)者所關(guān)注，而從目前所掌握的資料來看，都認(rèn)為甜高粱是從非洲傳入中國的［19］。通過挖掘與重要性狀相關(guān)的功能基因，通過群體選擇分析探究各亞群的多態(tài)性和分化程度，進(jìn)而探討群體的遺傳結(jié)構(gòu)、基因交流、物種形成機(jī)制及群體進(jìn)化動(dòng)態(tài)問題是當(dāng)前的研究熱點(diǎn)［20-23］。莖稈持汁性作為甜高粱的重要特征，對其進(jìn)行深入研究不僅有助于了解控制莖稈持汁性的關(guān)鍵基因及具體生物學(xué)功能，還有助于了解甜高粱的起源和馴化過程。

2 高粱莖稈持汁性的研究歷程

2.1 Dry/D基因的定位與克隆

人們克隆與鑒定調(diào)控高粱莖稈水分的基因主要圍繞葉脈顏色、持汁性、含水量和汁液產(chǎn)量進(jìn)行。Benson和SubbaRao［24］于1906年首次發(fā)現(xiàn)當(dāng)高粱莖稈無汁時(shí)，葉片中脈呈白色；當(dāng)有汁時(shí)，葉片中脈的顏色為綠色。通過構(gòu)建遺傳群體，研究發(fā)現(xiàn)莖稈持汁性受單基因控制，莖稈有汁為隱性，基因型為d，莖稈無汁為顯性，基因型為D［25-27］。后續(xù)的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)控制莖稈水分的D基因與控制高粱幼苗出土?xí)r莖尖顏色的Rs基因和控制葉鞘紫色的P基因存在連鎖，Rangaswami等［27］研究表明在高粱中控制葉鞘紫色的P基因與控制莖稈含汁性的D基因的重組率為30%。D的精細(xì)定位最初是通過葉脈的顏色來進(jìn)行的。通過將葉脈分為白脈和綠脈，Xu等［28］將D基因定位到SBI-06上兩個(gè)RFLP標(biāo)記（umc34和txs1030）之間，Hart等［29］認(rèn)為D基因與SSR標(biāo)記txp97連鎖。2010年，Mace等［30］通過“projection strategy”的方法將D基因定位到SBI06上84.2-93.2 cM之間，與SSR標(biāo)記txp145緊密連鎖。2014年Zhai等［31］對兩套獨(dú)立的F2群體觀察分析，將D基因鎖定在6號染色體上只包含6個(gè)候選基因的區(qū)間范圍內(nèi)。

以高粱莖稈的出汁量或者含水量作為指標(biāo)，研究認(rèn)為高粱莖稈水分含量是數(shù)量性狀，受到多個(gè)QTL位點(diǎn)控制。通過測量不同節(jié)間的含水量，Han等［32］定位到一個(gè)控制高粱莖稈含水量的顯著位點(diǎn)，位于6號染色體上Ch6-2和gpsb069之間，其對各個(gè)節(jié)間含水量變異的解釋率為34.7%-56.9%，進(jìn)一步通過BSA測序的方法，將這一區(qū)間縮小到339 kb，包含38個(gè)候選基因。這一位點(diǎn)與之前報(bào)道的控制葉脈顏色的位點(diǎn)相同。此外，也發(fā)現(xiàn)了其他的一些QTL位點(diǎn)。Felderhoff等［33］分別以出汁量和含水量為指標(biāo)，發(fā)現(xiàn)在1號、3號、4號和7號染色體上存在顯著的QTL位點(diǎn)。Guan等［14］以出汁量為指標(biāo)，將控制莖稈出汁量的位點(diǎn)定位到了染色體SBI-01的 Xcup25- SEST249、Xtxp329-Xtxp088和 Xtxp284-Xtxp061區(qū)間，染色體SBI-04的Sb1_10-SbAGG02區(qū)間，染色體SBI-07的SbAGF06-Xcup19區(qū)間和染色體SBI-09的Sb5_206-SbAGE03區(qū)間，其中位于染色體SBI-07和SBI-09的區(qū)間在兩種自然環(huán)境下均能檢測到。然而，由于作圖親本的選擇和自然環(huán)境的影響，在這些研究中并沒有發(fā)現(xiàn)D位點(diǎn)與莖稈中的水分相關(guān)。2015年，Burks等［34］通過全基因組關(guān)聯(lián)分析的方法將控制葉脈顏色的位點(diǎn)、出汁量的位點(diǎn)和含水量的位點(diǎn)同時(shí)定位到6號染色體——51.8 Mb的區(qū)域。這些研究說明含水量是受多基因控制的數(shù)量性狀，而最初定義的控制汁液有無的單基因D是控制含水量、出汁量的主效基因。對D基因研究的突破性工作出現(xiàn)在2018年。Zhang等［35］將高粱的莖稈分為“pithy”和“juicy”兩類，通過全基因組關(guān)聯(lián)分析和圖位克隆的方法，最終克隆到了控制高粱莖稈持汁性的D基因，并將其命名為Dry，并且進(jìn)一步通過轉(zhuǎn)基因的手段驗(yàn)證了Dry基因的功能。該基因編碼植物特有的NAC轉(zhuǎn)錄因子，其功能缺失是甜高粱莖稈富含汁液的重要原因。同年，F(xiàn)ujimoto［36］、Xia［37］和 Casto［38］也分別通過圖位克隆的方式鑒定到D基因，并且Fujimoto［36］通過異源表達(dá)的方式在擬南芥中驗(yàn)證了D基因的功能，而Xia等和Casto等并沒有對D基因的功能進(jìn)行驗(yàn)證。

2.2 Dry基因的作用機(jī)制

通過細(xì)胞學(xué)及生理生化實(shí)驗(yàn)，Zhang等［35］發(fā)現(xiàn)Dry基因參與次生細(xì)胞壁的合成，Dry功能缺失會(huì)影響甜高粱莖稈髓部維管束和薄壁細(xì)胞的形態(tài)、細(xì)胞壁厚度及細(xì)胞壁組分。進(jìn)化樹分析表明Dry與控制次生細(xì)胞壁合成的VND、NST和SMB基因家族親緣關(guān)系較近［35］。同時(shí)也發(fā)現(xiàn)，在Dry基因功能喪失的材料中與纖維素、半纖維素合成相關(guān)的MYB轉(zhuǎn)錄因子和功能基因的表達(dá)也發(fā)生變化，因此Dry是一類新的控制次生細(xì)胞壁合成相關(guān)的基因［35］。推斷當(dāng)Dry基因功能喪失以后，不利于水分在高粱莖稈內(nèi)的運(yùn)輸，因此甜高粱莖稈內(nèi)積累了大量的水分。

在Fujimoto等［36］的研究中，他們發(fā)現(xiàn)Dry基因與程序化細(xì)胞死亡有關(guān)。Dry基因在擬南芥中的同源基因是ANAC074，將Dry基因在ANAC074的突變體中異源表達(dá)，取擬南芥的花序軸，用伊文思藍(lán)進(jìn)行染色，發(fā)現(xiàn)花序軸被染成藍(lán)色。利用雌激素誘導(dǎo)系統(tǒng)，發(fā)現(xiàn)當(dāng)添加雌激素后，表達(dá)LexA∷D和LexA∷ANAC074的擬南芥細(xì)胞的細(xì)胞核和質(zhì)體發(fā)生丟失。同時(shí)表達(dá)LexA∷D和LexA∷ANAC074的擬南芥細(xì)胞以及D/d的高粱近等基因系材料中，檢測到與程序化細(xì)胞死亡相關(guān)基因，如CEP1和XCP1家族的肽酶相關(guān)基因，編碼type-II metacaspases的基因，PASPA3、SCPL48、BFN1和RNS3的表達(dá)發(fā)生變化。在Casto等［38］的試驗(yàn)中，他們也發(fā)現(xiàn)程序化細(xì)胞死亡的標(biāo)志基因SbXCP1在SbNAC_D的近等基因系中的表達(dá)量顯著高于在SbNAC_d1的近等基因系中的表達(dá)量，并且在高粱品種R07020中，SbXCP1的表達(dá)量與通氣組織的形成相關(guān)。

2.3 Dry基因在高粱的起源馴化過程中受到選擇

Zhang等［35］通過PCA分析發(fā)現(xiàn)，野生高粱、籽實(shí)高粱和甜高粱能非常明顯的區(qū)分開。此外，全基因組水平的LD分析發(fā)現(xiàn)三者的衰減速度為野生高粱＞籽實(shí)高粱＞甜高粱。這說明甜高粱可能經(jīng)歷了比籽實(shí)高粱更強(qiáng)的選擇馴化過程。野生高粱和籽實(shí)高粱莖稈中的水分含量很低，而甜高粱的莖稈中含有大量水分，因此推測Dry基因可能在高粱的起源和馴化中起重要作用。進(jìn)一步通過XP-CLR證實(shí)了在甜高粱Dry處存在明顯的正選擇信號，并且Dry的核酸多態(tài)性低于野生高粱和籽實(shí)高粱［35］。對Dry基因的單倍型進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)在野生種中存在23種單倍型，在籽實(shí)高粱中僅存在2種單倍型（Pithy_SUD和Pithy_CHN），在甜高粱中存在4種單倍型（Juicy_IND、Juicy_RSA、Juicy_ZIM 和 Juicy_USA），并且籽實(shí)高粱的2種單倍型與野生高粱的353_type和394_type是相同的。進(jìn)化樹分析發(fā)現(xiàn)甜高粱Juicy_IND是由籽實(shí)高粱Pithy_CHN產(chǎn)生的［35］。因此Dry在甜高粱的起源與馴化過程中受到選擇，Dry基因從野生高粱馴化為栽培無汁高粱受到瓶頸效應(yīng)，導(dǎo)致遺傳多態(tài)性降低；篩選Dry突變體是選育有汁甜高粱的關(guān)鍵一步。

3 展望

3.1 高粱莖稈持汁性與葉脈顏色之間的關(guān)系

通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法將Dry基因?qū)胩鸶吡黄贩NKeller，盡管Keller莖稈的持汁性發(fā)生變化，但是葉脈的顏色并沒有從綠色變?yōu)榘咨Ｒ虼宋覀冋J(rèn)為Dry并不是控制葉脈顏色的主要基因，而是與之緊密連鎖?？刂迫~脈顏色的基因與Dry緊密連鎖在一起，可能是由于葉脈的顏色易于觀察，因此在育種過程中人們有意識的選擇造成的。Xia等［37］通過GWAS和圖位克隆的方法將控制葉脈顏色的基因定位到了6號染色體上——36 kb的區(qū)間。在該區(qū)間包含除Dry基因以外的3個(gè)基因。明確其中哪一個(gè)基因決定了葉脈顏色還需要進(jìn)一步研究。

3.2 莖稈持汁性與莖稈含水量之間的關(guān)系

Burks 等［34］利用GWAS的方法將控制水分含量和出汁量的基因定位到了Dry基因所在的位置，此外在1號染色體和5號染色體上也存在與含水量相關(guān)的顯著位點(diǎn)。Guan等［14］以出汁量為指標(biāo)，將控制莖稈出汁量的位點(diǎn)定位到了染色體SBI-01的 Xcup25- SEST249、Xtxp329-Xtxp088和 Xtxp284-Xtxp061區(qū)間，染色體SBI-04的Sb1_10-SbAGG02區(qū)間，染色體SBI-07的SbAGF06-Xcup19區(qū)間和染色體SBI-09的Sb5_206-SbAGE03區(qū)間。因此，在Dry基因控制莖稈持汁性的基礎(chǔ)上，還需要對調(diào)控莖稈水分含量相關(guān)的其他微效基因進(jìn)一步挖掘，以便為深入了解莖稈水分含量的精細(xì)調(diào)控機(jī)理奠定理論基礎(chǔ)。

3.3 莖稈持汁性與莖稈含糖量之間的關(guān)系

由葉片光合作用生成的光合產(chǎn)物，主要以蔗糖的形式運(yùn)輸?shù)礁鱾€(gè)庫器官，而莖稈中的水分是糖分等光合產(chǎn)物的主要載體。在甜高粱莖稈中，光合產(chǎn)物主要以可溶性糖的形式儲存于莖髓部薄壁細(xì)胞中，可溶性糖的積累會(huì)引起滲透壓的提高，這是否會(huì)影響水分的吸收，或者水分含量是否會(huì)影響可溶性糖的積累都是需要進(jìn)一步明確的問題。在前人的研究中也發(fā)現(xiàn)了同時(shí)控制水分量和Brix的QTL位點(diǎn)。但是植物如何調(diào)節(jié)其自身的水分含量和糖含量使其達(dá)到平衡目前尚未可知。此外，目前對于高粱莖稈中糖含量的測定主要是通過測定Brix進(jìn)行的，然而Brix的測定較為粗糙，受環(huán)境和發(fā)育時(shí)期的影響較大。同時(shí)高粱中的糖分除了蔗糖之外，還包含葡萄糖、果糖和淀粉等。因此精準(zhǔn)定量高粱莖稈中的各種糖分含量、水分含量與糖分含量之間的關(guān)系也是今后的研究重點(diǎn)。

3.4 莖稈持汁性與籽實(shí)大小之間的關(guān)系

在甜高粱中，莖稈和籽實(shí)都是儲能器官。研究發(fā)現(xiàn)莖稈和籽實(shí)之間存在能量競爭關(guān)系，然而目前對這方面研究的并不深入。這方面的研究可以幫助詮釋作物/植物莖稈儲水在水分與養(yǎng)分轉(zhuǎn)運(yùn)、“源-庫”信號交換方面的作用。另外，甜高粱各品種間籽實(shí)的大小也存在差異，因此對甜高粱籽實(shí)差異的研究有可能找到甜高粱特異的調(diào)控籽實(shí)大小的途徑。

3.5 莖稈持汁性與持綠間的關(guān)系

Dry基因在擬南芥中的同源基因是At4g28530。研究發(fā)現(xiàn)在葉片衰老過程中At4g28530的表達(dá)量升高［39］。Dry基因在水稻中的同源基因是Os4g43560。研究發(fā)現(xiàn)在適度干旱的條件下，Os4g43560在耐旱材料的幼穗中表達(dá)量升高，而在不耐旱的材料中表達(dá)量未發(fā)生變化［40］。在高粱中我們也發(fā)現(xiàn)籽實(shí)高粱的衰老普遍早于甜高粱，因此Dry基因在衰老中的作用也是今后的一個(gè)重要研究方向。

綜上所述，甜高粱莖稈水分含量是由多基因控制的，目前只克隆到一個(gè)主效基因Dry，但是對于其作用機(jī)理和調(diào)控網(wǎng)絡(luò)并不十分清楚，仍需進(jìn)一步深入研究。同時(shí)，克隆其他控制基因?qū)?xì)調(diào)控莖稈水分含量，明確莖稈持汁性對莖稈物質(zhì)積累和同化產(chǎn)物競爭有無作用具有重要理論價(jià)值和應(yīng)用價(jià)值。