花期高溫脅迫下TaERECTA基因?qū)π←溕硖匦院凸夂献饔玫挠绊?/h1>
2019-02-25 08:12:04鄭甲成尤依錦李杰勤程昕昕詹秋文
麥類作物學(xué)報(bào) 2019年1期
鄭甲成，尤依錦，劉 婷，徐 祥，李杰勤，王 歆，程昕昕，許 峰，詹秋文
(安徽科技學(xué)院農(nóng)學(xué)院，安徽鳳陽(yáng) 233100)
黃淮海地區(qū)是小麥的主產(chǎn)區(qū)之一，在小麥生長(zhǎng)季節(jié)尤其是生育后期(開花期和灌漿期)，經(jīng)常出現(xiàn)干熱風(fēng)等高溫天氣，出現(xiàn)“高溫逼熟”嚴(yán)重災(zāi)害，導(dǎo)致小麥籽粒產(chǎn)量下降和品質(zhì)變劣。ERECTA是分離自擬南芥的類受體激酶(RLKs)，主要參與植物的細(xì)胞分裂和組織發(fā)育[1]。ERECTA參與調(diào)控?cái)M南芥AS1/AS2基因信號(hào)通路中葉片上下表皮極性發(fā)育進(jìn)程，降低擬南芥植株對(duì)熱脅迫的敏感性[2]。在擬南芥、番茄和水稻中分別過(guò)量表達(dá)ERECTA基因后，轉(zhuǎn)基因株系耐熱性顯著增加，而擬南芥er突變體對(duì)熱脅迫敏感[3]。小麥?zhǔn)侨蜃钪匾募Z食作物之一，世界上40%的人口以小麥為主糧[4]。因此，研究小麥TaERECTA基因提高小麥耐熱性的生理機(jī)制，對(duì)改良黃淮海地區(qū)小麥耐熱性、培育耐熱性小麥新品種具有重要意義。
小麥屬于喜涼作物，高溫對(duì)整個(gè)生育期都會(huì)產(chǎn)生影響，但以抽穗揚(yáng)花期最敏感[5]。高溫脅迫會(huì)導(dǎo)致小麥產(chǎn)生大量活性氧，丙二醛(MDA)含量增加，膜脂過(guò)氧化加劇，植株功能期縮短，甚至死亡[6]。超氧化物歧化酶(SOD)、過(guò)氧化物酶(POD)、過(guò)氧化氫酶(CAT)等被認(rèn)為是清除植物體內(nèi)活性氧的主要抗氧化物質(zhì)，可使植物對(duì)脅迫產(chǎn)生一定的耐受力[7]。相對(duì)電導(dǎo)率(relative electrical conductivity,REC)是評(píng)價(jià)植物遭受逆境脅迫時(shí)電解質(zhì)外滲率的重要指標(biāo)，可以反映逆境脅迫對(duì)植物細(xì)胞膜的損壞程度[8]。本研究以T3代轉(zhuǎn)TaERECTA基因小麥為材料，在揚(yáng)花期(Z65)[9]進(jìn)行高溫脅迫處理，測(cè)定其抗氧化酶活性、REC、MDA含量等，以及揚(yáng)花期的相關(guān)光合參數(shù)，以明確TaERECTA基因在小麥開花期調(diào)控耐熱性的生理機(jī)制。
1 材料與方法
1.1 試驗(yàn)材料
轉(zhuǎn)TaERECTA基因小麥株系的選育在英國(guó)洛桑研究所的小麥遺傳轉(zhuǎn)化平臺(tái)完成，受體為半冬性小麥品種Cadenza。于2015、2016和2017年對(duì)轉(zhuǎn)TaERECTA基因小麥的T0、T1和T2代，連續(xù)進(jìn)行PCR陽(yáng)性檢測(cè)和過(guò)表達(dá)鑒定，獲得穩(wěn)定遺傳的30個(gè)小麥單株(分為12個(gè)轉(zhuǎn)基因小麥株系)。2017年11月，通過(guò)盆栽方式將對(duì)照株系(CK，轉(zhuǎn)Bar基因)、野生型株系(WT)以及3個(gè)超表達(dá)水平穩(wěn)定的轉(zhuǎn)基因小麥株系L3、L6和L15種植于安徽科技學(xué)院隔離室。
1.2 T3代轉(zhuǎn)基因材料中TaERECTA基因的超表達(dá)分析
通過(guò)試劑盒(天根，北京)提取轉(zhuǎn)基因小麥幼苗的總RNA，并反轉(zhuǎn)錄合成cDNA(TaKaRa，日本)。采用半定量和實(shí)時(shí)定量(qRT-PCR)方法同時(shí)檢測(cè)TaERECTA的超表達(dá)水平。內(nèi)參基因TaActin的引物為TaActin-F：TTGCTGACCGT ATGAGCAAG和TaActin-R：ACCCTCCAAT CCAGACACTG；目標(biāo)基因TaERECTA的引物為TaERECTAQ-F：CAACGAGTACGTGAGC CTGCG和TaERECTAQ-R：GACTGACTACC TGCTTGCTGCATC。半定量和定量的實(shí)施步驟、數(shù)據(jù)分析參見Zheng等[10-11]的方法。
1.3 轉(zhuǎn)基因株系高溫脅迫處理
參照國(guó)際小麥生育期的劃分標(biāo)準(zhǔn)[9]設(shè)定小麥取樣生育時(shí)期和取樣日期。在抽穗前期(Z49)，將各株系移至光照培養(yǎng)室(室溫22～25 ℃，白天光照16 h，光強(qiáng)525 μmol·s-1·m-2，夜間暗培養(yǎng)8 h)培養(yǎng)1周，每個(gè)株系種植4盆，每盆2株。于揚(yáng)花中期(Z65)[9]9:00開始進(jìn)行40 ℃高溫脅迫處理，分別在處理的1、2、3、4和5 h取樣測(cè)定相關(guān)生理指標(biāo)。
1.4 小麥生理指標(biāo)的測(cè)定
選擇小麥倒二葉進(jìn)行生理指標(biāo)測(cè)定。超氧化物酶(SOD)活性測(cè)定采用氮藍(lán)四唑(NBT)法[12]，過(guò)氧化物酶(POD)活性測(cè)定采用愈創(chuàng)木酚顯色法[13]，過(guò)氧化氫酶(CAT)活性測(cè)定采用紫外吸收比色法[14]，丙二醛(MDA)含量測(cè)定采用硫代巴比妥酸法[15]，相對(duì)含水量(RWC)測(cè)定參照黃芬肖等[16]的方法，相對(duì)電導(dǎo)率(REC)測(cè)定參照張憲政[17]的方法。
1.5 光合作用參數(shù)的測(cè)定
揚(yáng)花中期(Z65)[9]高溫脅迫處理5h后，將各株系移回光照培養(yǎng)室，繼續(xù)培養(yǎng)3 d后，在早晨9:00-11:00，用光合儀(美國(guó), Li-6400)測(cè)定脅迫后小麥植株旗葉的光合速率、氣孔導(dǎo)度、蒸騰速率和胞間CO2濃度。溫室內(nèi)采用內(nèi)置光源，光強(qiáng)設(shè)定1 000 μmol·m-2·s-1，CO2參比濃度為400 μmol·mol-1，相對(duì)濕度為50%～70%，氣室溫度為25 ℃。每株系測(cè)定6個(gè)單株。同時(shí)，高溫脅迫后測(cè)定小麥植株的SPAD值，測(cè)定方法參照儀器(SPAD-502plus，Minoda)說(shuō)明書，每株系測(cè)定6個(gè)單株。
1.6 數(shù)據(jù)處理與制圖
采用Microsoft Excel 2010、SPSS 18.0進(jìn)行數(shù)據(jù)處理、差異顯著性分析及圖表繪制。
2 結(jié)果與分析
2.1 轉(zhuǎn)基因小麥超表達(dá)水平穩(wěn)定性分析
qRT-PCR分析結(jié)果(圖1A)顯示，3個(gè)轉(zhuǎn)基因小麥株系(L3、L6和L15)中，TaERECTA基因的表達(dá)水平均極顯著(P<0.001)增加，分別為CK株系的9.5倍、6.1倍和9.9倍，而內(nèi)參基因TaActin的表達(dá)水平在各株系間無(wú)顯著差異。半定量分析結(jié)果(圖1B)顯示，TaERECTA在轉(zhuǎn)基因株系中電泳帶型明亮，在CK株系和WT株系中電泳帶型微弱，而內(nèi)參基因TaActin在各株系中電泳帶型亮度一致，無(wú)明顯差異，此結(jié)果與qRT-PCR結(jié)果一致，進(jìn)一步證實(shí)TaERECTA基因在轉(zhuǎn)基因小麥株系中均可以穩(wěn)定超表達(dá)。說(shuō)明TaERECTA基因轉(zhuǎn)入小麥可以顯著增加其在小麥中的轉(zhuǎn)錄水平。
2.2 揚(yáng)花期高溫脅迫對(duì)轉(zhuǎn)基因小麥抗氧化酶活性的影響
由表1可知，高溫脅迫下3個(gè)轉(zhuǎn)基因株系的SOD活性均較高，脅迫1、2、4和5 h后，3個(gè)轉(zhuǎn)基因株系的SOD活性均顯著(P<0.05)高于野生型株系。高溫脅迫1 h后，L3和L6株系的SOD活性顯著高于CK株系(P<0.05)；高溫脅迫2、3和5 h 后，L15株系的SOD活性均顯著高于CK株系(P<0.05)；脅迫4 h后，L6株系的SOD活性顯著高于CK株系(P<0.05)。
由表2可知，高溫脅迫處理下，3個(gè)轉(zhuǎn)基因株系的POD活性基本上都顯著高于野生型株系和CK株系(P<0.05)，其中，脅迫1 h后，轉(zhuǎn)基因株系L3和L15的POD活性分別較CK株系高24%和45%；高溫脅迫處理2、3和4 h后，3個(gè)轉(zhuǎn)基因株系的POD活性平均值分別較CK株系高24%、49%和63%；而處理5 h后，L3和L6株系的POD活性分別較CK株系高18%和59%。
由表3可知，不同處理時(shí)間段內(nèi)，3個(gè)轉(zhuǎn)基因株系的CAT活性均顯著高于野生型株系和CK株系(P<0.05)。高溫脅迫處理1、2、3、4和5 h后，3個(gè)轉(zhuǎn)基因株系的CAT活性平均值分別較CK株系高68%、42%、53%、59%和24%，差異均達(dá)到顯著水平(P<0.05)。
植物體內(nèi)的SOD、POD和CAT對(duì)清除活性氧有重要作用，可使植物對(duì)高溫脅迫產(chǎn)生一定的抵抗力。在揚(yáng)花期高溫脅迫下，轉(zhuǎn)TaERECTA基因小麥具有較高的SOD、POD和CAT活性，說(shuō)明TaERECTA基因在小麥中超表達(dá)對(duì)小麥的耐熱性有一定的調(diào)控作用。
WT：野生型小麥；CK：轉(zhuǎn)bar基因的對(duì)照株系； L3、L6和L15：轉(zhuǎn)TaERECTA基因株系；***表示與對(duì)照之間有極顯著差異(P<0.001)。下同。
WT:Wild type of Cadenza; CK:Thebartransgenic plants; L3,L6 and L15:TaERECTAtransgenic plants; *** means significant difference between transgenic lines and control at 0.001 level.The same in other figures and tables.
圖1轉(zhuǎn)基因小麥株系中TaERECTA基因超表達(dá)水平的qRT-PCR分析(A)和半定量分析(B)結(jié)果
Fig.1qRT-PCRandRT-PCRanalysisofTaERECTAgeneoverexpressionintransgenicwheatlines
2.3 揚(yáng)花期高溫脅迫對(duì)轉(zhuǎn)基因小麥葉片膜透性的影響
表1高溫脅迫下轉(zhuǎn)基因小麥的SOD活性
Table1SODactivityoftransgenicwheatlinesunderhigh-temperaturestress
U·g-1FW·min-1
同列數(shù)據(jù)后小寫字母不同表示在0.05水平差異顯著(P<0.05)。下同。
The lower-case letters in the same column indicate significant difference at 0.05 level. The same in tables 2～4.
表2 高溫脅迫下轉(zhuǎn)基因小麥的POD活性
表3 高溫脅迫下轉(zhuǎn)基因小麥的CAT活性
表4 高溫脅迫下轉(zhuǎn)基因小麥的MDA含量Table 4 MDA content in transgenic wheat lines under high-temperature stress μmol·g-1 FW
MDA是植物器官在遭受逆境或衰老時(shí)脂膜過(guò)氧化作用的產(chǎn)物之一，通常把它作為脂膜過(guò)氧化的指標(biāo)，用以反映細(xì)胞脂膜過(guò)氧化程度和植物對(duì)逆境響應(yīng)的強(qiáng)弱[18]。由表4可知，高溫脅迫下，各小麥葉片的MDA含量整體呈先增后降的變化趨勢(shì)。在高溫脅迫處理1～4 h后，3個(gè)轉(zhuǎn)基因株系的MDA含量均顯著低于野生型株系(P<0.05)；且高溫脅迫1、2和4 h 后，L3、L6和L15株系的MDA含量平均值分別較CK株系低22%、39%和31%，差異達(dá)到顯著水平(P<0.05)，而高溫脅迫3 h和5 h后，僅L6株系的MDA含量與CK株系間的差異達(dá)到顯著水平(P<0.05)。
高溫經(jīng)常伴隨植物體內(nèi)水分散失和葉片卷曲。本研究中，隨高溫脅迫時(shí)間延長(zhǎng)，小麥植株的相對(duì)水分含量(RWC)呈降低趨勢(shì)。脅迫3 h后，小麥各株系葉片卷曲嚴(yán)重，個(gè)別植株底部葉片出現(xiàn)枯死，株系間RWC差異不明顯，故本文只分析了高溫脅迫3 h以內(nèi)RWC的變化。由圖2可知，脅迫1 h后，僅L3株系的RWC與CK株系間的差異達(dá)到顯著水平(P<0.05)；脅迫2 h后，L3、L6和L15株系的RWC均顯著(P<0.01)高于CK株系； 脅迫3 h后，各小麥株系的RWC均明顯降低，僅L6轉(zhuǎn)基因株系的RWC顯著高于CK(P<0.05)。說(shuō)明短時(shí)間高溫脅迫下， 轉(zhuǎn)TaERECTA基因小麥具有較高的相對(duì)水分含量。
相對(duì)電導(dǎo)率是評(píng)價(jià)細(xì)胞膜透性的有效方法。有研究表明，小麥葉片在高溫脅迫71 min后，相對(duì)電導(dǎo)率達(dá)50%，植物組織就已經(jīng)死亡[8]，故本研究只檢測(cè)了高溫脅迫30、60和120 min后小麥葉片相對(duì)電導(dǎo)率的變化情況。由圖3可知，高溫脅迫下，轉(zhuǎn)基因小麥的REC明顯低于CK株系。高溫脅迫30 min后， L3和L15株系的REC顯著低于對(duì)照株系(P<0.05)；60 min后，L6和L15株系的REC分別顯著(P<0.05)和極顯著(P<0.01)低于對(duì)照株系；120 min后，L3和L5株系的REC極顯著低于CK株系(P<0.01)，而L6株系的REC顯著低于CK株系(P<0.05)。說(shuō)明高溫脅迫下，轉(zhuǎn)基因小麥脂膜的損傷較小，這與MDA測(cè)定顯示的結(jié)果基本一致。
同一處理時(shí)間段圖柱上的*和**分別表示轉(zhuǎn)基因小麥株系與對(duì)照(CK)株系間在0.05和0.01水平上差異顯著。圖3同。
* and ** in the same treatment stage indicate significant difference between transgenic lines and control at 0.05 and 0.01 levels,respectively.The same in figure 3.
圖2高溫脅迫下轉(zhuǎn)基因小麥的相對(duì)含水量
Fig.2Relativewatercontentintransgenicwheatlinesunderhigh-temperaturestress
圖3 高溫脅迫下轉(zhuǎn)基因小麥的相對(duì)電導(dǎo)率
2.4 揚(yáng)花期高溫脅迫對(duì)轉(zhuǎn)基因小麥SPAD值及光合作用參數(shù)的影響
高溫脅迫能影響小麥葉片葉綠素的合成。由圖4可知，隨高溫脅迫時(shí)間延長(zhǎng)，各處理小麥葉片的SPAD值整體呈下降趨勢(shì)，但轉(zhuǎn)TaERECTA基因株系的SPAD與CK株系間的差異均未達(dá)到顯著水平(P>0.05)。說(shuō)明高溫脅迫下，TaERECTA基因?qū)π←溔~綠素含量無(wú)明顯影響。
由表5可知，在揚(yáng)花期高溫脅迫5 h后，與對(duì)照(CK)株系相比，轉(zhuǎn)基因小麥L3、L6和L15株系的光合速率(A)分別較CK株系增加35%、33%和51%，而三個(gè)轉(zhuǎn)基因株系瞬時(shí)水分利用效率分別較CK株系增加53%、67%和47%，差異均達(dá)到極顯著水平(P<0.01),胞間CO2濃度(Ci)和蒸騰速率(Tr)在轉(zhuǎn)基因株系中均降低，僅有L6株系與CK株系間差異達(dá)到顯著水平(P<0.05)。氣孔導(dǎo)度(Gs)在轉(zhuǎn)基因株系和CK株系間無(wú)顯著差異。這說(shuō)明TaERECTA基因過(guò)表達(dá)可以顯著提高小麥的光合速率和瞬時(shí)水分利用效率。
圖4 高溫脅迫下轉(zhuǎn)基因小麥的SPAD值
小麥株系Wheat line高溫脅迫下轉(zhuǎn)基因小麥的光合參數(shù)Photosynthetic parameters of transgenic wheat lines under high-temperature stress光合速率A/(μmol·m-2·s-1)氣孔導(dǎo)度Gs/(mmol·m-2·s-1)胞間CO2濃度Ci /(μmol·mol-1)蒸騰速率Tr/(mmol·m-2·s-1) 瞬時(shí)水分利用效率 WUEi/(μmol·mmol-1)WT12.77±0.310.12±0.01204.89±17.072.83±0.324.52±0.05CK13.74±0.200.20±0.01266.71±11.403.87±0.233.66±0.11L318.48±0.34??0.18±0.01215.81±7.643.30±0.475.61±0.03??L618.29±0.57??0.16±0.00183.45±8.01?2.99±0.39?6.12±0.39??L1520.78±0.46??0.23±0.00233.53±1.553.75±0.285.37±0.15??
表中同列數(shù)據(jù)后*和**分別表示轉(zhuǎn)基因小麥株系與對(duì)照(CK)株系間在0.05和0.01水平上差異顯著。
* and ** in the same column indicate significant difference between transgenic lines and control at 0.05 and 0.01 levels,respectively.
3 討 論
本研究表明，花期高溫脅迫下，轉(zhuǎn)TaERECTA基因的小麥株系葉片中SOD、POD和CAT活性明顯高于CK株系，暗示轉(zhuǎn)TaERECTA基因小麥活性氧的清除能力較強(qiáng)。TaERECTA基因參與調(diào)控植物細(xì)胞內(nèi)電子傳遞鏈[19]，推測(cè)可能會(huì)影響細(xì)胞內(nèi)SOD活性，提高小麥耐熱性，但其具體機(jī)理還需進(jìn)一步研究。
本研究表明，高溫脅迫導(dǎo)致小麥葉片的MDA含量和REC迅速增加，說(shuō)明高溫脅迫打破了小麥葉片自由基產(chǎn)生和清除的動(dòng)態(tài)平衡，使膜脂過(guò)氧化程度加劇，質(zhì)膜透性加大，電解質(zhì)外滲；本研究還顯示，高溫脅迫3 h后各株系小麥葉片RWC迅速降低，說(shuō)明隨高溫脅迫時(shí)間延長(zhǎng)，蒸騰速率升高，小麥葉片RWC迅速減少。與CK株系相比，轉(zhuǎn)TaERECTA基因小麥的MDA含量相對(duì)較低，兩者之間差異顯著；同時(shí)， 轉(zhuǎn)TaERECTA基因小麥的REC也較低，且隨脅迫時(shí)間延長(zhǎng)，與CK株系間的差異更加明顯。高溫脅迫2 h后，轉(zhuǎn)TaERECTA基因小麥的RWC極顯著高于CK株系，但隨高溫延續(xù)，小麥蒸騰速率加快，此差異逐漸消失。說(shuō)明高溫脅迫下TaERECTA基因可能參與調(diào)控細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的相對(duì)穩(wěn)定性，減少細(xì)胞內(nèi)容物外滲，降低高溫對(duì)葉片的傷害。
ERECTA基因在擬南芥、水稻和番茄中超量表達(dá)后，能夠顯著提高植株的耐熱性，而擬南芥er突變體植株中H2O2含量較高，對(duì)熱脅迫特別敏感，推測(cè)是由于ERECTA可以保護(hù)細(xì)胞膜免受高溫脅迫引起的細(xì)胞損傷和細(xì)胞死亡，保護(hù)脂膜的完整性[3]。本研究表明TaERECTA基因可能參與調(diào)控小麥細(xì)胞膜的穩(wěn)定性。然而，關(guān)于ERECTA通過(guò)調(diào)控作物光合電子傳遞和呼吸電子傳遞，影響逆境下細(xì)胞膜穩(wěn)定，提高作物耐熱性的分子機(jī)制卻沒(méi)有報(bào)道，也缺乏ERECTA基因在高溫脅迫下降低作物葉片細(xì)胞等離子膜發(fā)生起泡、褶皺、質(zhì)壁分離等損害的直接證據(jù)，這些均亟待后續(xù)研究。
高溫脅迫5 h后，轉(zhuǎn)TaERECTA基因小麥的A和WUEi均顯著高于CK株系，說(shuō)明高溫脅迫下TaERECTA超表達(dá)可以提高小麥的光合能力，這與前期轉(zhuǎn)TaERECTA基因小麥在正常條件下具有較高光合效率的研究結(jié)果一致。小麥光合作用變化既受氣孔因素影響也受非氣孔因素影響，Ci和Gs均降低導(dǎo)致光合作用下降主要是由氣孔因素引起的，而Ci升高和Gs下降則是非氣孔因素引起的[20]，高溫脅迫下轉(zhuǎn)TaERECTA基因小麥光合較低主要是由非氣孔因素引起，進(jìn)一步補(bǔ)充說(shuō)明TaERECTA基因功能與擬南芥ERECTA家族成員不同，并不是通過(guò)調(diào)控小麥葉片的氣孔發(fā)育途徑來(lái)提高小麥耐熱性，應(yīng)該有其他獨(dú)立的調(diào)控通路。
猜你喜歡
過(guò)表達(dá)NtMYB4a基因增強(qiáng)煙草抗旱能力亞熱帶植物科學(xué)(2022年1期)2022-05-17 12:39:32 大豆：花期結(jié)莢期巧管理今日農(nóng)業(yè)(2021年15期)2021-10-14 08:20:24 嫦娥5號(hào)返回式試驗(yàn)衛(wèi)星小麥育種材料研究進(jìn)展情況四川農(nóng)業(yè)科技(2019年5期)2019-07-01 09:46:46 Current status and challenges in sentinel node navigation surgery for early gastric cancerChinese Journal of Cancer Research(2017年2期)2017-07-18 11:01:15 耐熱性能優(yōu)異的鋁合金鋁加工(2017年1期)2017-03-07 00:53:33 衢州椪柑變異株系—黃皮椪柑相關(guān)特性研究浙江柑橘(2016年1期)2016-03-11 20:12:31 退火對(duì)聚乳酸結(jié)晶及耐熱性能的影響中國(guó)塑料(2015年6期)2015-11-13 03:02:52 誤區(qū)：耐熱性好，維生素E不會(huì)損失質(zhì)量與標(biāo)準(zhǔn)化(2015年11期)2015-07-21 14:54:29 不同濃度CaCl2對(duì)“普紅”和“梅紅”西洋杜鵑耐熱性影響研究福建林業(yè)(2015年2期)2015-04-09 06:35:58 容顏盛放，花期未至香謝涼傳奇故事(破繭成蝶)(2015年8期)2015-02-28 09:29:44
鄭甲成，尤依錦，劉 婷，徐 祥，李杰勤，王 歆，程昕昕，許 峰，詹秋文
(安徽科技學(xué)院農(nóng)學(xué)院，安徽鳳陽(yáng) 233100)
黃淮海地區(qū)是小麥的主產(chǎn)區(qū)之一，在小麥生長(zhǎng)季節(jié)尤其是生育后期(開花期和灌漿期)，經(jīng)常出現(xiàn)干熱風(fēng)等高溫天氣，出現(xiàn)“高溫逼熟”嚴(yán)重災(zāi)害，導(dǎo)致小麥籽粒產(chǎn)量下降和品質(zhì)變劣。ERECTA是分離自擬南芥的類受體激酶(RLKs)，主要參與植物的細(xì)胞分裂和組織發(fā)育[1]。ERECTA參與調(diào)控?cái)M南芥AS1/AS2基因信號(hào)通路中葉片上下表皮極性發(fā)育進(jìn)程，降低擬南芥植株對(duì)熱脅迫的敏感性[2]。在擬南芥、番茄和水稻中分別過(guò)量表達(dá)ERECTA基因后，轉(zhuǎn)基因株系耐熱性顯著增加，而擬南芥er突變體對(duì)熱脅迫敏感[3]。小麥?zhǔn)侨蜃钪匾募Z食作物之一，世界上40%的人口以小麥為主糧[4]。因此，研究小麥TaERECTA基因提高小麥耐熱性的生理機(jī)制，對(duì)改良黃淮海地區(qū)小麥耐熱性、培育耐熱性小麥新品種具有重要意義。
小麥屬于喜涼作物，高溫對(duì)整個(gè)生育期都會(huì)產(chǎn)生影響，但以抽穗揚(yáng)花期最敏感[5]。高溫脅迫會(huì)導(dǎo)致小麥產(chǎn)生大量活性氧，丙二醛(MDA)含量增加，膜脂過(guò)氧化加劇，植株功能期縮短，甚至死亡[6]。超氧化物歧化酶(SOD)、過(guò)氧化物酶(POD)、過(guò)氧化氫酶(CAT)等被認(rèn)為是清除植物體內(nèi)活性氧的主要抗氧化物質(zhì)，可使植物對(duì)脅迫產(chǎn)生一定的耐受力[7]。相對(duì)電導(dǎo)率(relative electrical conductivity,REC)是評(píng)價(jià)植物遭受逆境脅迫時(shí)電解質(zhì)外滲率的重要指標(biāo)，可以反映逆境脅迫對(duì)植物細(xì)胞膜的損壞程度[8]。本研究以T3代轉(zhuǎn)TaERECTA基因小麥為材料，在揚(yáng)花期(Z65)[9]進(jìn)行高溫脅迫處理，測(cè)定其抗氧化酶活性、REC、MDA含量等，以及揚(yáng)花期的相關(guān)光合參數(shù)，以明確TaERECTA基因在小麥開花期調(diào)控耐熱性的生理機(jī)制。
1 材料與方法
1.1 試驗(yàn)材料
轉(zhuǎn)TaERECTA基因小麥株系的選育在英國(guó)洛桑研究所的小麥遺傳轉(zhuǎn)化平臺(tái)完成，受體為半冬性小麥品種Cadenza。于2015、2016和2017年對(duì)轉(zhuǎn)TaERECTA基因小麥的T0、T1和T2代，連續(xù)進(jìn)行PCR陽(yáng)性檢測(cè)和過(guò)表達(dá)鑒定，獲得穩(wěn)定遺傳的30個(gè)小麥單株(分為12個(gè)轉(zhuǎn)基因小麥株系)。2017年11月，通過(guò)盆栽方式將對(duì)照株系(CK，轉(zhuǎn)Bar基因)、野生型株系(WT)以及3個(gè)超表達(dá)水平穩(wěn)定的轉(zhuǎn)基因小麥株系L3、L6和L15種植于安徽科技學(xué)院隔離室。
1.2 T3代轉(zhuǎn)基因材料中TaERECTA基因的超表達(dá)分析
通過(guò)試劑盒(天根，北京)提取轉(zhuǎn)基因小麥幼苗的總RNA，并反轉(zhuǎn)錄合成cDNA(TaKaRa，日本)。采用半定量和實(shí)時(shí)定量(qRT-PCR)方法同時(shí)檢測(cè)TaERECTA的超表達(dá)水平。內(nèi)參基因TaActin的引物為TaActin-F：TTGCTGACCGT ATGAGCAAG和TaActin-R：ACCCTCCAAT CCAGACACTG；目標(biāo)基因TaERECTA的引物為TaERECTAQ-F：CAACGAGTACGTGAGC CTGCG和TaERECTAQ-R：GACTGACTACC TGCTTGCTGCATC。半定量和定量的實(shí)施步驟、數(shù)據(jù)分析參見Zheng等[10-11]的方法。
1.3 轉(zhuǎn)基因株系高溫脅迫處理
參照國(guó)際小麥生育期的劃分標(biāo)準(zhǔn)[9]設(shè)定小麥取樣生育時(shí)期和取樣日期。在抽穗前期(Z49)，將各株系移至光照培養(yǎng)室(室溫22～25 ℃，白天光照16 h，光強(qiáng)525 μmol·s-1·m-2，夜間暗培養(yǎng)8 h)培養(yǎng)1周，每個(gè)株系種植4盆，每盆2株。于揚(yáng)花中期(Z65)[9]9:00開始進(jìn)行40 ℃高溫脅迫處理，分別在處理的1、2、3、4和5 h取樣測(cè)定相關(guān)生理指標(biāo)。
1.4 小麥生理指標(biāo)的測(cè)定
選擇小麥倒二葉進(jìn)行生理指標(biāo)測(cè)定。超氧化物酶(SOD)活性測(cè)定采用氮藍(lán)四唑(NBT)法[12]，過(guò)氧化物酶(POD)活性測(cè)定采用愈創(chuàng)木酚顯色法[13]，過(guò)氧化氫酶(CAT)活性測(cè)定采用紫外吸收比色法[14]，丙二醛(MDA)含量測(cè)定采用硫代巴比妥酸法[15]，相對(duì)含水量(RWC)測(cè)定參照黃芬肖等[16]的方法，相對(duì)電導(dǎo)率(REC)測(cè)定參照張憲政[17]的方法。
1.5 光合作用參數(shù)的測(cè)定
揚(yáng)花中期(Z65)[9]高溫脅迫處理5h后，將各株系移回光照培養(yǎng)室，繼續(xù)培養(yǎng)3 d后，在早晨9:00-11:00，用光合儀(美國(guó), Li-6400)測(cè)定脅迫后小麥植株旗葉的光合速率、氣孔導(dǎo)度、蒸騰速率和胞間CO2濃度。溫室內(nèi)采用內(nèi)置光源，光強(qiáng)設(shè)定1 000 μmol·m-2·s-1，CO2參比濃度為400 μmol·mol-1，相對(duì)濕度為50%～70%，氣室溫度為25 ℃。每株系測(cè)定6個(gè)單株。同時(shí)，高溫脅迫后測(cè)定小麥植株的SPAD值，測(cè)定方法參照儀器(SPAD-502plus，Minoda)說(shuō)明書，每株系測(cè)定6個(gè)單株。
1.6 數(shù)據(jù)處理與制圖
采用Microsoft Excel 2010、SPSS 18.0進(jìn)行數(shù)據(jù)處理、差異顯著性分析及圖表繪制。
2 結(jié)果與分析
2.1 轉(zhuǎn)基因小麥超表達(dá)水平穩(wěn)定性分析
qRT-PCR分析結(jié)果(圖1A)顯示，3個(gè)轉(zhuǎn)基因小麥株系(L3、L6和L15)中，TaERECTA基因的表達(dá)水平均極顯著(P<0.001)增加，分別為CK株系的9.5倍、6.1倍和9.9倍，而內(nèi)參基因TaActin的表達(dá)水平在各株系間無(wú)顯著差異。半定量分析結(jié)果(圖1B)顯示，TaERECTA在轉(zhuǎn)基因株系中電泳帶型明亮，在CK株系和WT株系中電泳帶型微弱，而內(nèi)參基因TaActin在各株系中電泳帶型亮度一致，無(wú)明顯差異，此結(jié)果與qRT-PCR結(jié)果一致，進(jìn)一步證實(shí)TaERECTA基因在轉(zhuǎn)基因小麥株系中均可以穩(wěn)定超表達(dá)。說(shuō)明TaERECTA基因轉(zhuǎn)入小麥可以顯著增加其在小麥中的轉(zhuǎn)錄水平。
2.2 揚(yáng)花期高溫脅迫對(duì)轉(zhuǎn)基因小麥抗氧化酶活性的影響
由表1可知，高溫脅迫下3個(gè)轉(zhuǎn)基因株系的SOD活性均較高，脅迫1、2、4和5 h后，3個(gè)轉(zhuǎn)基因株系的SOD活性均顯著(P<0.05)高于野生型株系。高溫脅迫1 h后，L3和L6株系的SOD活性顯著高于CK株系(P<0.05)；高溫脅迫2、3和5 h 后，L15株系的SOD活性均顯著高于CK株系(P<0.05)；脅迫4 h后，L6株系的SOD活性顯著高于CK株系(P<0.05)。
由表2可知，高溫脅迫處理下，3個(gè)轉(zhuǎn)基因株系的POD活性基本上都顯著高于野生型株系和CK株系(P<0.05)，其中，脅迫1 h后，轉(zhuǎn)基因株系L3和L15的POD活性分別較CK株系高24%和45%；高溫脅迫處理2、3和4 h后，3個(gè)轉(zhuǎn)基因株系的POD活性平均值分別較CK株系高24%、49%和63%；而處理5 h后，L3和L6株系的POD活性分別較CK株系高18%和59%。
由表3可知，不同處理時(shí)間段內(nèi)，3個(gè)轉(zhuǎn)基因株系的CAT活性均顯著高于野生型株系和CK株系(P<0.05)。高溫脅迫處理1、2、3、4和5 h后，3個(gè)轉(zhuǎn)基因株系的CAT活性平均值分別較CK株系高68%、42%、53%、59%和24%，差異均達(dá)到顯著水平(P<0.05)。
植物體內(nèi)的SOD、POD和CAT對(duì)清除活性氧有重要作用，可使植物對(duì)高溫脅迫產(chǎn)生一定的抵抗力。在揚(yáng)花期高溫脅迫下，轉(zhuǎn)TaERECTA基因小麥具有較高的SOD、POD和CAT活性，說(shuō)明TaERECTA基因在小麥中超表達(dá)對(duì)小麥的耐熱性有一定的調(diào)控作用。
WT：野生型小麥；CK：轉(zhuǎn)bar基因的對(duì)照株系； L3、L6和L15：轉(zhuǎn)TaERECTA基因株系；***表示與對(duì)照之間有極顯著差異(P<0.001)。下同。
WT:Wild type of Cadenza; CK:Thebartransgenic plants; L3,L6 and L15:TaERECTAtransgenic plants; *** means significant difference between transgenic lines and control at 0.001 level.The same in other figures and tables.
圖1轉(zhuǎn)基因小麥株系中TaERECTA基因超表達(dá)水平的qRT-PCR分析(A)和半定量分析(B)結(jié)果
Fig.1qRT-PCRandRT-PCRanalysisofTaERECTAgeneoverexpressionintransgenicwheatlines
2.3 揚(yáng)花期高溫脅迫對(duì)轉(zhuǎn)基因小麥葉片膜透性的影響
表1高溫脅迫下轉(zhuǎn)基因小麥的SOD活性
Table1SODactivityoftransgenicwheatlinesunderhigh-temperaturestress
U·g-1FW·min-1
同列數(shù)據(jù)后小寫字母不同表示在0.05水平差異顯著(P<0.05)。下同。
The lower-case letters in the same column indicate significant difference at 0.05 level. The same in tables 2～4.
表2 高溫脅迫下轉(zhuǎn)基因小麥的POD活性
表3 高溫脅迫下轉(zhuǎn)基因小麥的CAT活性
表4 高溫脅迫下轉(zhuǎn)基因小麥的MDA含量Table 4 MDA content in transgenic wheat lines under high-temperature stress μmol·g-1 FW
MDA是植物器官在遭受逆境或衰老時(shí)脂膜過(guò)氧化作用的產(chǎn)物之一，通常把它作為脂膜過(guò)氧化的指標(biāo)，用以反映細(xì)胞脂膜過(guò)氧化程度和植物對(duì)逆境響應(yīng)的強(qiáng)弱[18]。由表4可知，高溫脅迫下，各小麥葉片的MDA含量整體呈先增后降的變化趨勢(shì)。在高溫脅迫處理1～4 h后，3個(gè)轉(zhuǎn)基因株系的MDA含量均顯著低于野生型株系(P<0.05)；且高溫脅迫1、2和4 h 后，L3、L6和L15株系的MDA含量平均值分別較CK株系低22%、39%和31%，差異達(dá)到顯著水平(P<0.05)，而高溫脅迫3 h和5 h后，僅L6株系的MDA含量與CK株系間的差異達(dá)到顯著水平(P<0.05)。
高溫經(jīng)常伴隨植物體內(nèi)水分散失和葉片卷曲。本研究中，隨高溫脅迫時(shí)間延長(zhǎng)，小麥植株的相對(duì)水分含量(RWC)呈降低趨勢(shì)。脅迫3 h后，小麥各株系葉片卷曲嚴(yán)重，個(gè)別植株底部葉片出現(xiàn)枯死，株系間RWC差異不明顯，故本文只分析了高溫脅迫3 h以內(nèi)RWC的變化。由圖2可知，脅迫1 h后，僅L3株系的RWC與CK株系間的差異達(dá)到顯著水平(P<0.05)；脅迫2 h后，L3、L6和L15株系的RWC均顯著(P<0.01)高于CK株系； 脅迫3 h后，各小麥株系的RWC均明顯降低，僅L6轉(zhuǎn)基因株系的RWC顯著高于CK(P<0.05)。說(shuō)明短時(shí)間高溫脅迫下， 轉(zhuǎn)TaERECTA基因小麥具有較高的相對(duì)水分含量。
相對(duì)電導(dǎo)率是評(píng)價(jià)細(xì)胞膜透性的有效方法。有研究表明，小麥葉片在高溫脅迫71 min后，相對(duì)電導(dǎo)率達(dá)50%，植物組織就已經(jīng)死亡[8]，故本研究只檢測(cè)了高溫脅迫30、60和120 min后小麥葉片相對(duì)電導(dǎo)率的變化情況。由圖3可知，高溫脅迫下，轉(zhuǎn)基因小麥的REC明顯低于CK株系。高溫脅迫30 min后， L3和L15株系的REC顯著低于對(duì)照株系(P<0.05)；60 min后，L6和L15株系的REC分別顯著(P<0.05)和極顯著(P<0.01)低于對(duì)照株系；120 min后，L3和L5株系的REC極顯著低于CK株系(P<0.01)，而L6株系的REC顯著低于CK株系(P<0.05)。說(shuō)明高溫脅迫下，轉(zhuǎn)基因小麥脂膜的損傷較小，這與MDA測(cè)定顯示的結(jié)果基本一致。
同一處理時(shí)間段圖柱上的*和**分別表示轉(zhuǎn)基因小麥株系與對(duì)照(CK)株系間在0.05和0.01水平上差異顯著。圖3同。
* and ** in the same treatment stage indicate significant difference between transgenic lines and control at 0.05 and 0.01 levels,respectively.The same in figure 3.
圖2高溫脅迫下轉(zhuǎn)基因小麥的相對(duì)含水量
Fig.2Relativewatercontentintransgenicwheatlinesunderhigh-temperaturestress
圖3 高溫脅迫下轉(zhuǎn)基因小麥的相對(duì)電導(dǎo)率
2.4 揚(yáng)花期高溫脅迫對(duì)轉(zhuǎn)基因小麥SPAD值及光合作用參數(shù)的影響
高溫脅迫能影響小麥葉片葉綠素的合成。由圖4可知，隨高溫脅迫時(shí)間延長(zhǎng)，各處理小麥葉片的SPAD值整體呈下降趨勢(shì)，但轉(zhuǎn)TaERECTA基因株系的SPAD與CK株系間的差異均未達(dá)到顯著水平(P>0.05)。說(shuō)明高溫脅迫下，TaERECTA基因?qū)π←溔~綠素含量無(wú)明顯影響。
由表5可知，在揚(yáng)花期高溫脅迫5 h后，與對(duì)照(CK)株系相比，轉(zhuǎn)基因小麥L3、L6和L15株系的光合速率(A)分別較CK株系增加35%、33%和51%，而三個(gè)轉(zhuǎn)基因株系瞬時(shí)水分利用效率分別較CK株系增加53%、67%和47%，差異均達(dá)到極顯著水平(P<0.01),胞間CO2濃度(Ci)和蒸騰速率(Tr)在轉(zhuǎn)基因株系中均降低，僅有L6株系與CK株系間差異達(dá)到顯著水平(P<0.05)。氣孔導(dǎo)度(Gs)在轉(zhuǎn)基因株系和CK株系間無(wú)顯著差異。這說(shuō)明TaERECTA基因過(guò)表達(dá)可以顯著提高小麥的光合速率和瞬時(shí)水分利用效率。
圖4 高溫脅迫下轉(zhuǎn)基因小麥的SPAD值
小麥株系Wheat line高溫脅迫下轉(zhuǎn)基因小麥的光合參數(shù)Photosynthetic parameters of transgenic wheat lines under high-temperature stress光合速率A/(μmol·m-2·s-1)氣孔導(dǎo)度Gs/(mmol·m-2·s-1)胞間CO2濃度Ci /(μmol·mol-1)蒸騰速率Tr/(mmol·m-2·s-1) 瞬時(shí)水分利用效率 WUEi/(μmol·mmol-1)WT12.77±0.310.12±0.01204.89±17.072.83±0.324.52±0.05CK13.74±0.200.20±0.01266.71±11.403.87±0.233.66±0.11L318.48±0.34??0.18±0.01215.81±7.643.30±0.475.61±0.03??L618.29±0.57??0.16±0.00183.45±8.01?2.99±0.39?6.12±0.39??L1520.78±0.46??0.23±0.00233.53±1.553.75±0.285.37±0.15??
表中同列數(shù)據(jù)后*和**分別表示轉(zhuǎn)基因小麥株系與對(duì)照(CK)株系間在0.05和0.01水平上差異顯著。
* and ** in the same column indicate significant difference between transgenic lines and control at 0.05 and 0.01 levels,respectively.
3 討 論
本研究表明，花期高溫脅迫下，轉(zhuǎn)TaERECTA基因的小麥株系葉片中SOD、POD和CAT活性明顯高于CK株系，暗示轉(zhuǎn)TaERECTA基因小麥活性氧的清除能力較強(qiáng)。TaERECTA基因參與調(diào)控植物細(xì)胞內(nèi)電子傳遞鏈[19]，推測(cè)可能會(huì)影響細(xì)胞內(nèi)SOD活性，提高小麥耐熱性，但其具體機(jī)理還需進(jìn)一步研究。
本研究表明，高溫脅迫導(dǎo)致小麥葉片的MDA含量和REC迅速增加，說(shuō)明高溫脅迫打破了小麥葉片自由基產(chǎn)生和清除的動(dòng)態(tài)平衡，使膜脂過(guò)氧化程度加劇，質(zhì)膜透性加大，電解質(zhì)外滲；本研究還顯示，高溫脅迫3 h后各株系小麥葉片RWC迅速降低，說(shuō)明隨高溫脅迫時(shí)間延長(zhǎng)，蒸騰速率升高，小麥葉片RWC迅速減少。與CK株系相比，轉(zhuǎn)TaERECTA基因小麥的MDA含量相對(duì)較低，兩者之間差異顯著；同時(shí)， 轉(zhuǎn)TaERECTA基因小麥的REC也較低，且隨脅迫時(shí)間延長(zhǎng)，與CK株系間的差異更加明顯。高溫脅迫2 h后，轉(zhuǎn)TaERECTA基因小麥的RWC極顯著高于CK株系，但隨高溫延續(xù)，小麥蒸騰速率加快，此差異逐漸消失。說(shuō)明高溫脅迫下TaERECTA基因可能參與調(diào)控細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的相對(duì)穩(wěn)定性，減少細(xì)胞內(nèi)容物外滲，降低高溫對(duì)葉片的傷害。
ERECTA基因在擬南芥、水稻和番茄中超量表達(dá)后，能夠顯著提高植株的耐熱性，而擬南芥er突變體植株中H2O2含量較高，對(duì)熱脅迫特別敏感，推測(cè)是由于ERECTA可以保護(hù)細(xì)胞膜免受高溫脅迫引起的細(xì)胞損傷和細(xì)胞死亡，保護(hù)脂膜的完整性[3]。本研究表明TaERECTA基因可能參與調(diào)控小麥細(xì)胞膜的穩(wěn)定性。然而，關(guān)于ERECTA通過(guò)調(diào)控作物光合電子傳遞和呼吸電子傳遞，影響逆境下細(xì)胞膜穩(wěn)定，提高作物耐熱性的分子機(jī)制卻沒(méi)有報(bào)道，也缺乏ERECTA基因在高溫脅迫下降低作物葉片細(xì)胞等離子膜發(fā)生起泡、褶皺、質(zhì)壁分離等損害的直接證據(jù)，這些均亟待后續(xù)研究。
高溫脅迫5 h后，轉(zhuǎn)TaERECTA基因小麥的A和WUEi均顯著高于CK株系，說(shuō)明高溫脅迫下TaERECTA超表達(dá)可以提高小麥的光合能力，這與前期轉(zhuǎn)TaERECTA基因小麥在正常條件下具有較高光合效率的研究結(jié)果一致。小麥光合作用變化既受氣孔因素影響也受非氣孔因素影響，Ci和Gs均降低導(dǎo)致光合作用下降主要是由氣孔因素引起的，而Ci升高和Gs下降則是非氣孔因素引起的[20]，高溫脅迫下轉(zhuǎn)TaERECTA基因小麥光合較低主要是由非氣孔因素引起，進(jìn)一步補(bǔ)充說(shuō)明TaERECTA基因功能與擬南芥ERECTA家族成員不同，并不是通過(guò)調(diào)控小麥葉片的氣孔發(fā)育途徑來(lái)提高小麥耐熱性，應(yīng)該有其他獨(dú)立的調(diào)控通路。
猜你喜歡
亞熱帶植物科學(xué)(2022年1期)2022-05-17 12:39:32
今日農(nóng)業(yè)(2021年15期)2021-10-14 08:20:24
四川農(nóng)業(yè)科技(2019年5期)2019-07-01 09:46:46
Chinese Journal of Cancer Research(2017年2期)2017-07-18 11:01:15
鋁加工(2017年1期)2017-03-07 00:53:33
浙江柑橘(2016年1期)2016-03-11 20:12:31
中國(guó)塑料(2015年6期)2015-11-13 03:02:52
質(zhì)量與標(biāo)準(zhǔn)化(2015年11期)2015-07-21 14:54:29
福建林業(yè)(2015年2期)2015-04-09 06:35:58
傳奇故事(破繭成蝶)(2015年8期)2015-02-28 09:29:44
