楊金姬，李紅義

(武裝警察部隊(duì)特色醫(yī)學(xué)中心軍人生殖醫(yī)學(xué)科，天津 100162)

卵母細(xì)胞冷凍是輔助生殖的關(guān)鍵技術(shù)之一。卵母細(xì)胞具有體積大、表面積與體積比小、含水量高和存在減數(shù)分裂紡錘體等特點(diǎn)，故成熟卵母細(xì)胞是最難成功冷凍的細(xì)胞之一。與精子和胚胎冷凍相比，卵母細(xì)胞冷凍保存技術(shù)的發(fā)展較緩慢。1986年，Chen[1]首次報(bào)道，采用慢速冷凍技術(shù)將人卵母細(xì)胞進(jìn)行低溫保存，解凍時(shí)將冷凍管浸入37 ℃水浴中進(jìn)行快速復(fù)溫，隨后進(jìn)行體外受精和胚胎移植術(shù)，成功獲得雙胎妊娠。卵胞質(zhì)內(nèi)單精子顯微注射技術(shù)可有效解決卵母細(xì)胞冷凍過程中因卵母細(xì)胞皮質(zhì)顆粒過早釋放造成的透明帶硬化，并可避免冷凍過程對受精率的影響[2]。1997年，Porcu等[3]利用卵胞質(zhì)內(nèi)單精子顯微注射作為人冷凍卵母細(xì)胞的體外受精方式，成功獲得妊娠并出生1名健康女嬰。20世紀(jì)八九十年代，人卵母細(xì)胞冷凍的研究取得了較大進(jìn)展，但卵母細(xì)胞復(fù)蘇存活率仍較低，玻璃化冷凍技術(shù)的出現(xiàn)較大程度上提高了卵母細(xì)胞的復(fù)蘇存活率。1999年，Kuleshova等[4]對1名47歲女性成功實(shí)施了玻璃化冷凍卵子胚胎移植，使其成功妊娠并獲得1名健康女嬰。此后，多項(xiàng)研究證實(shí)，與慢速冷凍相比，玻璃化冷凍技術(shù)可使冷凍卵母細(xì)胞獲得更高的存活率和妊娠率[5-7]。2004年，意大利立法禁止進(jìn)行胚胎冷凍，此措施加速了卵母細(xì)胞冷凍技術(shù)的發(fā)展[8]。2013年美國生殖醫(yī)學(xué)協(xié)會和輔助生殖技術(shù)協(xié)會執(zhí)業(yè)委員會指出，卵母細(xì)胞冷凍-復(fù)蘇不應(yīng)再被認(rèn)為是實(shí)驗(yàn)性的[9]。卵母細(xì)胞冷凍技術(shù)的日趨成熟為醫(yī)學(xué)或非醫(yī)學(xué)原因希望保持生育能力的女性提供了一個新的選擇。但由于卵母細(xì)胞本身特殊結(jié)構(gòu)以及冷凍技術(shù)的差異，與新鮮卵母細(xì)胞相比，冷凍卵母細(xì)胞的臨床結(jié)局尚未達(dá)到令人滿意的效果?，F(xiàn)對人卵母細(xì)胞冷凍的研究進(jìn)展予以綜述。

1 卵母細(xì)胞冷凍的應(yīng)用

胚胎冷凍保存是一種非常穩(wěn)定的現(xiàn)有生育力保存技術(shù)，廣泛應(yīng)用于體外受精治療，但對于無男性伴侶或不愿使用供精者精子獲得胚胎的女性而言，則無法通過胚胎冷凍實(shí)現(xiàn)生育力保存，母細(xì)胞冷凍技術(shù)可為這部分有生育力保存愿望的女性提供新的選擇。

目前，卵母細(xì)胞冷凍主要應(yīng)用于：①面臨放療和化療的腫瘤患者以及需要預(yù)防性切除卵巢的遺傳性疾病患者，卵母細(xì)胞冷凍保存使患者疾病治愈后仍有生育可能[10]；②輔助生殖治療的需要：取卵當(dāng)日男方無法提供足夠精子，可將女方卵母細(xì)胞冷凍儲存[11]；③受法律、宗教、倫理的限制而無法進(jìn)行胚胎冷凍的人群[8]；④因社會因素需要延遲生育的女性，卵母細(xì)胞冷凍儲存可為其需要生育時(shí)提供幫助[12]；⑤卵巢低反應(yīng)女性可通過卵母細(xì)胞冷凍技術(shù)累積卵子。

我國《人類輔助生殖技術(shù)規(guī)范》中規(guī)定：禁止單身婦女實(shí)施人類輔助生殖技術(shù)，因此目前我國卵母細(xì)胞冷凍技術(shù)主要應(yīng)用于輔助生殖治療過程，單身女性尚不能通過卵母細(xì)胞冷凍保存生育力[13]。

2 影響卵母細(xì)胞冷凍臨床結(jié)局的因素

2.1卵母細(xì)胞冷凍方法 目前，人卵母細(xì)胞冷凍主要有慢速冷凍和玻璃化冷凍兩種。慢速冷凍也稱程序化冷凍，將卵母細(xì)胞在緩沖液中短暫平衡數(shù)秒后放入含滲透性冷凍保護(hù)劑中初步脫水10 min，隨后將卵母細(xì)胞移至含滲透性和非滲透性冷凍保護(hù)劑中進(jìn)一步脫水5 min，最后將其裝入冷凍載體并放入程序冷凍儀；程序化冷凍的降溫速度為0.2～2.0 ℃/min，緩慢降溫使細(xì)胞充分脫水，溫度降至-5～-7 ℃時(shí)，行人工植冰并繼續(xù)慢速降溫至-80 ℃左右，最后將冷凍麥管置于液氮中保存[14]。

早期關(guān)于成功卵母細(xì)胞冷凍的報(bào)道均采用慢速冷凍技術(shù)。慢速冷凍所用的冷凍保護(hù)劑的濃度相對較低，對卵母細(xì)胞的毒性較低，但降溫速度慢，冷凍時(shí)間較長，冷凍和復(fù)蘇過程中易形成冰晶，導(dǎo)致卵母細(xì)胞損傷，此外，慢速冷凍所需冷凍設(shè)備價(jià)格昂貴，冷凍過程對設(shè)備以及相關(guān)保障措施的要求較高。

玻璃化冷凍是將在較低濃度冷凍保護(hù)劑中平衡5～10 min后的卵母細(xì)胞轉(zhuǎn)入更高濃度冷凍保護(hù)劑中再平衡1 min，隨后將含有卵母細(xì)胞的微量冷凍保護(hù)液滴裝入冷凍載體直接投入液氮中進(jìn)行保存直至使用。玻璃化冷凍利用更高濃度冷凍保護(hù)劑使卵母細(xì)胞充分脫水，通過快速降溫(降溫速率可達(dá)20 000 ℃/min)可使細(xì)胞內(nèi)外液體均達(dá)到玻璃化狀態(tài)，但不會形成冰晶。與慢速冷凍相比，玻璃化冷凍液的濃度更高，高濃度的冷凍保護(hù)劑可能對卵母細(xì)胞產(chǎn)生毒性影響，為了降低其毒性，通常采用濃度逐漸升高的冷凍液使卵母細(xì)胞逐步脫水[14]。玻璃化冷凍的操作步驟相對簡單，但需要在較短時(shí)間內(nèi)完成精細(xì)操作，對操作人員的技術(shù)要求較高，操作的熟練程度將直接影響卵母細(xì)胞存活率。

1999年，人卵母細(xì)胞玻璃化冷凍首次獲得成功，標(biāo)志著卵母細(xì)胞冷凍研究取得了突破性進(jìn)展[4]。據(jù)報(bào)道，玻璃化冷凍卵母細(xì)胞解凍存活率達(dá)90%～97%，體外受精率達(dá)71%～79%，移植率為17%～41%，每次移植的臨床妊娠率為 36%～61%[9]。近年來，多項(xiàng)研究表明，與慢速冷凍相比，玻璃化冷凍的卵母細(xì)胞存活率、臨床妊娠率和活產(chǎn)率均更高[15-17]。目前玻璃化冷凍已經(jīng)逐步取代慢速冷凍成為人卵母細(xì)胞冷凍的首選方法[18]。以意大利為例，2007年，玻璃化冷凍卵母細(xì)胞僅占17.8%，慢速冷凍占82.2%，而2013年，慢速冷凍卵母細(xì)胞僅占14.4%，玻璃化冷凍卵母細(xì)胞占85.6%[19]。有學(xué)者建議，仍使用慢速冷凍的實(shí)驗(yàn)室，應(yīng)該考慮改用玻璃化冷凍技術(shù)進(jìn)行卵母細(xì)胞冷凍[7]。

2.2女性年齡 女性年齡是影響卵母細(xì)胞冷凍臨床結(jié)局的重要因素[20-21]。無論采用何種冷凍方法，冷凍卵母細(xì)胞的臨床妊娠率和活產(chǎn)率均隨女性年齡的增長而降低[22-23]。一項(xiàng)回顧性研究顯示，35歲及35歲以下女性卵母細(xì)胞冷凍活產(chǎn)率為50%，而35歲以上女性卵母細(xì)胞冷凍活產(chǎn)率僅為23%；與35歲以上女性相比，35歲及35歲以下女性的累計(jì)活產(chǎn)率更高，并隨冷凍卵母細(xì)胞數(shù)量的增加，其累計(jì)活產(chǎn)率增長速度更快，當(dāng)冷凍5枚卵母細(xì)胞時(shí)，35歲及35歲以下女性的累計(jì)活產(chǎn)率為15.4%，當(dāng)冷凍8枚卵母細(xì)胞時(shí)，35歲及35歲以下女性的累計(jì)活產(chǎn)率可升至40.8%，由此可見，每增加1枚卵母細(xì)胞，35歲及35歲以下女性的累計(jì)活產(chǎn)率可升高8.4%，而35歲以上女性的累計(jì)活產(chǎn)率僅從冷凍5枚卵母細(xì)胞的5.1%升至冷凍8枚卵母細(xì)胞的19.9%。當(dāng)冷凍卵母細(xì)胞為10～15枚時(shí)，35歲及35歲以下女性的累計(jì)活產(chǎn)率可達(dá)60.5%～85.2%，而35歲以上女性卵母細(xì)胞數(shù)增至11枚以上時(shí)，累計(jì)活產(chǎn)率為35.6%[21]。

目前，對有效冷凍保存卵母細(xì)胞的最佳年齡尚不清楚。隨著年齡的增長，女性獲卵數(shù)不斷減少，非整倍體卵母細(xì)胞數(shù)量不斷增加，故建議計(jì)劃保存生育力女性在30～35歲行卵母細(xì)胞冷凍，即在女性自然生育能力下降之前行卵母細(xì)胞冷凍[18]。

2.3卵母細(xì)胞冷凍載體 高效的卵母細(xì)胞存活率是保證卵母細(xì)胞冷凍成功的首要條件，極高的冷卻和升溫速率是卵母細(xì)胞冷凍的關(guān)鍵技術(shù)環(huán)節(jié)，故冷凍載體的選擇極其重要。目前，大多數(shù)中心使用的卵母細(xì)胞冷凍載體為改良的吸管、毛細(xì)管和尼龍環(huán)等，此類載體一般由塑料薄膜連接到桿上，冷凍時(shí)將樣本微滴放置于薄膜片末端，將其直接浸入液氮，再使用管狀封套封閉裝載樣本的另一端，可在一定程度上保護(hù)樣本，但冷凍樣本仍與液氮長期直接接觸，故稱為“開放系統(tǒng)”。開放式載體的冷卻速率(>20 000 ℃/min)極高，使卵母細(xì)胞的存活率較高，但卵母細(xì)胞直接暴露于未經(jīng)消毒的液氮中，存在交叉污染的風(fēng)險(xiǎn)[15]。目前尚未有開放式載體相關(guān)傳染性疾病擴(kuò)散的報(bào)道，但污染風(fēng)險(xiǎn)可隨卵母細(xì)胞存儲時(shí)間的延長而增加。為了避免交叉污染，另一種“封閉系統(tǒng)”應(yīng)運(yùn)而生。封閉式載體在樣品和液氮之間提供了一個物理屏障，在理論上提高了生物安全性。但與開放式載體相比，封閉式載體的冷卻/復(fù)溫速率相對較慢，冷凍效果不佳[24]。另有學(xué)者認(rèn)為，玻璃化冷凍卵母細(xì)胞的存活率主要受復(fù)溫速率的影響，提高封閉式載體的復(fù)溫速率也可獲得較好的冷凍效果[25-26]。

開放式和封閉式載體各有優(yōu)缺點(diǎn)，有關(guān)最適合卵母細(xì)胞冷凍的載體形式目前尚無定論。有學(xué)者建議通過以下3種方法降低卵母細(xì)胞冷凍儲存過程中可能發(fā)生污染的風(fēng)險(xiǎn)：①使用經(jīng)紫外線消毒的液氮；②儲存于液氮的氣相中，液氮?dú)庀嘀协h(huán)境空氣污染物的濃度較低；③使用無菌空氣[27]。

2.4卵母細(xì)胞成熟度 GV期、MⅠ期卵母細(xì)胞為不成熟卵母細(xì)胞，MⅡ期卵母細(xì)胞為成熟卵母細(xì)胞，目前文獻(xiàn)報(bào)道的成功案例絕大多數(shù)為MⅡ期的成熟卵母細(xì)胞，而未成熟卵母細(xì)胞冷凍成功妊娠的報(bào)道較少[28-29]。未成熟卵母細(xì)胞易獲得且數(shù)量多，其細(xì)胞染色體仍處于核內(nèi)，尚未形成易受冷凍損傷的紡錘體，且未成熟卵母細(xì)胞的胞膜通透性可能優(yōu)于MⅡ期卵母細(xì)胞，因此理論上未成熟卵母細(xì)胞冷凍更具優(yōu)勢。但目前未成熟卵母細(xì)胞體外成熟培養(yǎng)技術(shù)尚不成熟，未成熟卵母細(xì)胞解凍后體外培養(yǎng)的成熟率、受精率及妊娠率均較低，多數(shù)研究認(rèn)為，將GV和MⅠ期未成熟卵母細(xì)胞在體外成熟培養(yǎng)后，再行玻璃化冷凍的效果可能更好[30-31]。

2.5卵母細(xì)胞冷凍保存時(shí)間 目前，關(guān)于人卵母細(xì)胞冷凍保存時(shí)限尚無定論，Urquiza等[32]采用慢速冷凍技術(shù)保存了1名24歲不孕患者的6枚成熟卵母細(xì)胞，14.5年后經(jīng)患者要求將卵母細(xì)胞解凍，其中只有2枚卵母細(xì)胞存活，卵胞質(zhì)內(nèi)單精子顯微注射后只有1枚卵母細(xì)胞正常受精，胚胎移植后成功獲得妊娠，并足月分娩1名健康女嬰，這是目前報(bào)道的儲存時(shí)間最長并獲得活產(chǎn)的案例。

卵母細(xì)胞玻璃化冷凍的應(yīng)用相對較晚，儲存時(shí)間對其臨床結(jié)局影響的報(bào)告尚不多。一項(xiàng)大型回顧性研究顯示，超過4.2萬個卵母細(xì)胞在玻璃化冷凍6個月以內(nèi)、6～12個月、12～18個月、18～24個月、24～36個月、36～48個月, 48～60個月、60個月以上8種不同儲存時(shí)長的存活率、臨床妊娠率和持續(xù)妊娠率的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[33]。有數(shù)據(jù)顯示，卵母細(xì)胞較長時(shí)間的冷凍保存似乎不會對臨床結(jié)局產(chǎn)生不利影響，但卵母細(xì)胞在液氮罐中長期儲存卻存在一定風(fēng)險(xiǎn)[34]。因此，每個中心都應(yīng)該安裝儲罐報(bào)警系統(tǒng)，并制定應(yīng)急計(jì)劃，以應(yīng)對儲罐破裂等突發(fā)事件，減少儲存材料損失。

3 卵母細(xì)胞冷凍損傷

由于卵母細(xì)胞體積大、含水量高以及其特殊的細(xì)胞內(nèi)含物和結(jié)構(gòu)，其對低溫特別敏感，易發(fā)生冷凍損傷。溫度驟降會導(dǎo)致卵母細(xì)胞的溫度敏感結(jié)構(gòu)發(fā)生冷休克，影響其功能，如改變膜的通透性或破壞細(xì)胞內(nèi)的細(xì)胞器[35]。有研究證實(shí),不管是采用何種冷凍技術(shù)，冷凍卵母細(xì)胞2/3的皮質(zhì)顆粒均發(fā)生釋放，皮質(zhì)顆粒非生理性釋放導(dǎo)致卵母細(xì)胞透明帶過早硬化，影響正常受精[36-37]。為避免冷凍卵母細(xì)胞受精失敗，可選擇胞質(zhì)內(nèi)單精子注射作為冷凍卵母細(xì)胞的體外授精方式。此外，減數(shù)分裂紡錘體對溫度也極其敏感，即使卵母細(xì)胞在室溫下短暫暴露，也會造成紡錘體結(jié)構(gòu)的不可逆破壞，當(dāng)溫度降到0 ℃時(shí)，則發(fā)生快速去極化[38]。在冷凍過程中，將卵母細(xì)胞暴露于冷凍保護(hù)劑中，紡錘體的結(jié)構(gòu)可能保留下來，但在解凍過程中紡錘體的結(jié)構(gòu)完全喪失[39-40]。進(jìn)一步研究證實(shí)，低溫保存紡錘體可使其恢復(fù)重新組裝的能力[41]。紡錘體微管的重新組裝是受精后染色體正確排列和分離的必要條件。卵母細(xì)胞減數(shù)分裂紡錘體的破壞可能導(dǎo)致非整倍體胚胎發(fā)生，但這一假說尚未得到證實(shí)。有研究顯示，慢速冷凍和玻璃化冷凍技術(shù)處理的冷凍卵母細(xì)胞胚胎中均未觀察到非整倍體率的增加[42]。降低卵母細(xì)胞冷凍損傷以及提高卵母細(xì)胞冷凍的安全性是目前卵母細(xì)胞冷凍研究的熱點(diǎn)之一。

4 冷凍卵母細(xì)胞子代的安全性

與其他輔助生殖技術(shù)一樣，冷凍卵母細(xì)胞子代的安全性亦非常重要。Noyes等[43]對1986—2008年936名卵母細(xì)胞冷凍出生嬰兒(包括慢速和玻璃化)資料的回顧分析發(fā)現(xiàn)，1.3%(12/936)存在出生異常，與同期自然受孕分娩嬰兒相比，兩者出生缺陷率無明顯差異。Cobo等[44]比較玻璃化冷凍卵母細(xì)胞出生的804名嬰兒與新鮮卵母細(xì)胞出生的996名嬰兒相關(guān)數(shù)據(jù)的研究發(fā)現(xiàn)，兩者的孕期并發(fā)癥、出生體重、Apgar評分、新生兒出生缺陷、重癥監(jiān)護(hù)室住院率及病死率的差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，Levi-Setti等[19]的大樣本研究結(jié)果與此類似。已有證據(jù)表明，卵母細(xì)胞冷凍保存與產(chǎn)科和圍生期并發(fā)癥的增加無關(guān)，但尚缺乏長期隨訪研究的支持，臨床應(yīng)用仍需謹(jǐn)慎。

5 結(jié) 語

20世紀(jì)80年代，人卵母細(xì)胞冷凍取得了第一次成功，隨后，玻璃化冷凍技術(shù)的出現(xiàn)大大改善了人卵母細(xì)胞冷凍的臨床結(jié)局。目前，卵母細(xì)胞冷凍已成為保存女性生育力的重要方法，并已廣泛應(yīng)用于臨床，但由于卵母細(xì)胞本身特殊結(jié)構(gòu)和冷凍技術(shù)的差異，卵母細(xì)胞冷凍的臨床結(jié)局仍未獲得令人滿意的一致結(jié)果。冷凍技術(shù)的標(biāo)準(zhǔn)化和(或)自動化是未來卵母細(xì)胞冷凍技術(shù)的研究重點(diǎn)，期待相關(guān)研究取得更大進(jìn)展，以提高卵母細(xì)胞冷凍的一致性及效率。