羅方云綜述，黃晨愷，朱 萱審校

0 引 言

肝纖維化是肝對各種慢性損傷發(fā)生修復(fù)反應(yīng)的動態(tài)過程，其主要以細胞外基質(zhì)（extracellular ma?trix，ECM）過度沉積為特點，肌成纖維細胞（myofi?broblasts，MFB）的遷移是ECM的主要來源，且活化的肝星狀細胞（hepatic stellate cells，HSCs）在形態(tài)和功能發(fā)生一系列改變后將轉(zhuǎn)化為MFB，故HSCs的活化是肝纖維化的中心環(huán)節(jié)［1-2］。大量研究證實還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（reduced nico?tinamide adenine dinucleotide phosphate，NADPH）氧化酶（NADPH oxidase，NOX）介導(dǎo)的氧化應(yīng)激與肝纖維化的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，而其亞基NOX4產(chǎn)生的活性氧簇（reactive oxygen species，ROS）及其介導(dǎo)的相關(guān)信號通路引起HSCs的持續(xù)激活、ECM的形成、肝細胞的凋亡及MFB的遷移等促進肝纖維化的形成起了關(guān)鍵作用［3］。因此闡明NOX4相關(guān)信號通路在肝纖維化發(fā)病機制中的作用將為臨床肝纖維化的治療提供理論依據(jù)。

1NOX家族及其亞型NOX4

NOX是最早發(fā)現(xiàn)于吞噬細胞中的一種多亞基跨膜酶復(fù)合體［4］。其主要利用NADPH將電子傳遞給氧分子，從而產(chǎn)生超氧自由基及活性氧。NOX家族主要包括7個亞基，分別為吞噬細胞型NOX2，非吞噬細胞型NOX1、NOX3、NOX4、NOX5及兩個雙重氧化酶Duox1和Doux2，均具有一定的組織特異性［5］，其中NOX4是NOX的催化性亞基中分布最廣泛的一種，且相較于其他NOXs的同工酶有其獨特的特點［6］。NOXs的激活通常需要胞質(zhì)內(nèi)的亞基（p40phox、p47phox、p67phox、小 RhoGTP 酶、Rac1/Rac2）遷移至細胞膜與p22phox/NOX2異二聚體相互作用，而NOX4的活化并不需要以上細胞質(zhì)內(nèi)亞基的存在，僅需胞質(zhì)調(diào)節(jié)亞基p22phox的募集［7］。研究發(fā)現(xiàn)，NOX4在肝損傷及之后的纖維化過程中起著更為廣泛的作用。NOX4在肝細胞及HSCs中高度表達，且活化的HSCs中表達更加明顯。在膽管結(jié)扎致肝纖維化的大鼠模型中，NOX4的表達與造模時間呈正相關(guān)，且膽管結(jié)扎再通后，NOX4的升高趨勢受到抑制［8］。在慢性丙型肝炎病毒（chronic hepatitis C virus，HCV）患者中，NOX4的上調(diào)較其他NOXs更為顯著，且NOX1未見任何變化［9］。在血管緊張素II（angiotensinII，AngII）刺激的HSCs中，內(nèi)源性干擾NOX4表達后抑制了AngII對細胞中線粒體ROS的誘導(dǎo)作用，阻止了HSCs的活化及膠原生成［10］。由此表明NOX4在肝纖維化過程中扮演了重要角色。

2NOX4介導(dǎo)ROS致肝纖維化作用

氧化應(yīng)激是指機體遭受各種有害刺激時，體內(nèi)氧化與抗氧化作用失衡，傾向于氧化，導(dǎo)致中性粒細胞炎性浸潤，蛋白酶分泌增加，產(chǎn)生大量的活性氧自由基和活性氮自由基從而引起細胞和組織的生理與病理反應(yīng)［11］。在生理狀態(tài)下，ROS作為正常代謝產(chǎn)物參與正常細胞的增殖、分化和凋亡；但在病理狀態(tài)下，ROS過量產(chǎn)生則會導(dǎo)致氧化應(yīng)激，其可通過多種機制損傷細胞的結(jié)構(gòu)和功能，如直接氧化細胞組分，導(dǎo)致脂質(zhì)過氧化或激活細胞內(nèi)氧化還原信號通路，促進細胞凋亡等，參與多種疾病的發(fā)生與發(fā)展［12］。大量研究證實，在乙醇、病毒感染、血吸蟲感染、慢性膽汁淤積、CCL4誘導(dǎo)慢性肝損傷的發(fā)病過程中都存在著氧化應(yīng)激作用［13］。近年來研究發(fā)現(xiàn)，NOXs是ROS主要來源之一，且NOX4介導(dǎo)的ROS在肝纖維化的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用［14］。Weyemi和Dupuy等［15］認為位于人各類細胞的核膜中NOX4產(chǎn)生的ROS可對細胞核內(nèi)DNA產(chǎn)生氧化損傷，促進細胞凋亡，且NOX4對人類基因組具有不穩(wěn)定性。ROS可促進組織纖溶酶原激活物抑制劑?1（plasminogen activator inhibitor?1，PAI?1）的表達，而PAI?1的過度表達可導(dǎo)致膠原在受損的肝組織中過度沉積，ECM降解減少，最終導(dǎo)致肝纖維化的形成［16］。各種細胞因子、生長因子、介質(zhì)等，如血小板源 性 生 長 因 子（platelet?derived growth factor，PDGF）、AngII、瘦素、及吞噬細胞凋亡小體可上調(diào)HSCs內(nèi)的NOX4，產(chǎn)生大量ROS，直接誘導(dǎo)HSCs活化，或觸發(fā)TGF?B/Smad信號通路、ERK1/2信號通路、JAK/STAT信號通路等促進HSCs合成金屬蛋白酶組織抑制劑（metalloproteinase tissue inhibitors，TIMPs）并抑制基質(zhì)金屬蛋白酶?1（matrix metallopro?teinase?1，MMP?1）基因的表達，從而導(dǎo)致膠原沉積，促進肝纖維化的發(fā)展［17］，產(chǎn)生的ROS還可通過P38和JNK信號通路促進核因子?κB（nuclear factor?κB，NF?κB）的激活，或通過氧化還原修飾使AKT和MAPKs磷酸化，增強核轉(zhuǎn)錄因子激活蛋白?1（nucle?ar transcription factor activation protein ?1，AP?1）的DNA結(jié)合活性，誘導(dǎo)炎性細胞因子的表達以介導(dǎo)肝炎癥，促進肝纖維化的發(fā)展［18］。此外，NOX4也可通過抑制肉毒堿棕櫚?；D(zhuǎn)移酶1A進而增強脂肪酸氧化途徑，促進NLRP3炎癥小體的活化及其下游相關(guān)因子的表達，間接引起HSCs的活化及體內(nèi)炎癥級聯(lián)反應(yīng)，促進肝細胞損傷，肝纖維化的發(fā)生與發(fā)展［19］。Brenner等［20］發(fā)現(xiàn) NOX4 抑制劑 GKT137831可阻斷AngII、LPS和PDGF刺激的HSCs內(nèi)ROS的表達，導(dǎo)致HSCs內(nèi)的趨化因子基因及增殖基因表達下降，且同時在動物體內(nèi)發(fā)現(xiàn)CCL4處理的NOX4基因敲除小鼠較野生型小鼠具有更輕肝損傷及肝纖維化程度，表明NOX4低表達可通過抑制炎癥和增殖信號傳導(dǎo)來防止HSCs活化。目前抗氧化劑無法對抗與氧化應(yīng)激相關(guān)的疾病，可能是由于抗氧化劑與ROS相互作用失衡導(dǎo)致效果不明顯，相反，在肝纖維化過程中，阻斷ROS來源的酶類?NOXs可能是解決問題的關(guān)鍵，而NOX4可能是NOX家族中較好的治療靶點［21］。

3 NOX4通過TGF?β/smad信號通路參與肝纖維化

大量研究表明，TGF?β亞族參與了細胞的生長分化、腫瘤發(fā)生和損傷修復(fù)等多種生物學(xué)效應(yīng)，且以Smad依賴形式參與多種纖維化的形成，其中TGF?β1為肝纖維化進程的關(guān)鍵執(zhí)行者，主要介導(dǎo)HSCs的激活及肝細胞的凋亡［22］。NOX4介導(dǎo)的肝纖維化主要通過TGF?β1/Smad2/3信號通路起作用。Fabre?gat等［23］發(fā)現(xiàn)TGF?β1介導(dǎo)的HSCs活化及肝細胞的凋亡依賴NOX4產(chǎn)生的ROS，且NOX4的調(diào)節(jié)主要發(fā)生在轉(zhuǎn)錄水平；在人肝細胞中也觀察到TGF?β1上調(diào)NOX4，與肝細胞凋亡同時發(fā)生，siRNA靶向敲除NOX4減輕了TGF?β1誘導(dǎo)的凋亡。Pan等［24］表明在慢性砷中毒誘導(dǎo)肝氧化導(dǎo)致的肝纖維化小鼠中，抗氧化劑?GSE或NOX4 siRNA阻斷了砷誘導(dǎo)的ROS產(chǎn)生，且觀察到GSE呈劑量依賴性地抑制TGF?β1表達及其誘導(dǎo)的Smad應(yīng)答元件P3TP?Lux的反式激活，降低了Smad3表達及TGF?β1誘導(dǎo)的Coll?I和α?SMA mRNA的表達。Sancho等［25］通過分析HCV患者和各種肝疾病的動物模型的肝組織基因表達發(fā)現(xiàn)，NOX4表達增加伴隨著肝纖維化的形成及TGF?β途徑活化，且體外TGF?β處理HSCs誘導(dǎo)的NOX4表達與靜止型HSCs向MFB轉(zhuǎn)化密切相關(guān)，敲除NOX4可抑制TGF?β誘導(dǎo)的靜止型HSCs向MFB轉(zhuǎn)化，但并不抑制TGF?β及其受體的表達，也不影響Smad2/3的磷酸化水平，表明在HSCs活化過程中，NOX4為TGF?β/Smad信號通路的下游分子。Ikeda等［26］也發(fā)現(xiàn)，在人類HSCs中，多烯磷脂酰膽堿正是通過抑制TGF?β1誘導(dǎo)的NOX4及ROS而發(fā)揮抑制HSCs活化功能。由此表明，NOX4介導(dǎo)ROS的產(chǎn)生與TGF?β/Smad信號通路密切相關(guān)，是促肝纖維化的一條關(guān)鍵通路。

4 TLR4/NOX4信號通路參與肝纖維化

迄今為止，TLR家族在哺乳動物中發(fā)現(xiàn)至少有13個成員，其中TLR4不僅是介導(dǎo)外源性LPS配體應(yīng)答的最主要受體，還能結(jié)合機體自身產(chǎn)生的一些內(nèi)源性分子，從而激活機體產(chǎn)生免疫應(yīng)答［27］。最新研究表明TLR4介導(dǎo)的NOX4信號通路參與了肝組織的病理反應(yīng)。Singh等［28］研究發(fā)現(xiàn)在LPS處理的人體肝細胞及野生型小鼠體內(nèi)，NOX4、TNF?a、PC?NA表達上調(diào)，促進了肝細胞異常增殖及小鼠肝的炎癥反應(yīng)，而在NOX4基因敲除小鼠及siRNA靶向敲除NOX4的人體肝細胞中抑制了該現(xiàn)象的發(fā)生。肝纖維化進程中NOX4介導(dǎo)的LPS?TLR4信號主要通過NF?κB及AP?1途徑起作用?；罨腘F?κB誘導(dǎo)炎癥細胞因子的釋放及抑制凋亡基因表達來促進肝內(nèi)炎癥反應(yīng)并參與肝細胞癌的發(fā)生［29］；而體內(nèi)的細胞因子、纖維連接蛋白等可通過激活MAPK及JNK途徑，刺激活化的HSCs中AP?1的活性，使c?jun或c?jun同二聚體、c?fos異二聚體等表達增強，誘導(dǎo)TIMPs的合成，抑制 ECM的降解［30］。Bataller等［31］研究也證實AngII可通過刺激HSCs內(nèi)的 AP?1的DNA結(jié)合活性，誘導(dǎo)肝纖維化發(fā)生。Singh等［28］發(fā)現(xiàn)在LPS刺激的肝細胞中，NF?κB及AP?1受體表達增加，且P65蛋白及ERK1/2磷酸化水平也升高，而NOX4 siRNA處理阻止了該現(xiàn)象的發(fā)生。同樣，有實驗驗證了LPS處理的細胞中，TLR4介導(dǎo)NOX4產(chǎn)生大量ROS，誘導(dǎo)了NF?κB的活化及其下游的炎癥因子如IL?1β、IL?6、TNF?a的表達，而在同樣壞境下TLR4 siRNA或NOX4 siRNA靶向干擾抑制了NF?κB激活及其下游炎癥因子的表達［32］。也有研究表明由LPS誘導(dǎo)的肝損傷，其作用機制大多與上調(diào)TLR4?NOX4?NF?κB信號通路中TLR4 mRNA、NOX4產(chǎn)生的ROS及NF?κB p65蛋白磷酸化水平、增加促炎因子IL?6表達等過程有關(guān)［33］。由此可見，TLR4介導(dǎo)的NOX4信號通路在肝纖維化的發(fā)生發(fā)展中起重要作用。

5 NOX4/NLRP3信號通路參與肝纖維化

NLRP家族有NLRP1～NLRP14等14個成員，NLRP分子激活后與銜接分子ASC及效應(yīng)分子pro?caspase?1形成炎癥小體［34］。其中NLRP3炎癥小體被研究的最深入。NLRP3炎癥小體可感受細胞內(nèi)的危險信號分子，特別是細胞內(nèi)大量生成的ROS，NLRP3活化聚集并裂解caspase?1前體形成其活化形式，誘導(dǎo)細胞凋亡，同時活化的caspase?1又以蛋白水解的方式裂解炎癥介質(zhì)IL?1β和IL?18前體，促其活化，誘發(fā)組織內(nèi)炎癥反應(yīng)［35］。目前NLRP3炎癥小體參與了酒精性肝病、非酒精性脂肪肝、HCV、血吸蟲性肝病、藥物及缺血再灌注損傷性肝病的病理過程已被證實。最新研究發(fā)現(xiàn)NOX4介導(dǎo)的NLRP3信號通路在肝纖維化的進程中起了重要作用。Zhang等［10］在體內(nèi)、體外實驗中發(fā)現(xiàn)，AngII可促進NOX4高表達進而激活NLRP3炎癥小體誘導(dǎo)EMT形成，且該過程可被NLRP3siRNA、NOX4siRNA所阻止；Ang?（1?7）正是通過阻斷NOX4 衍生的 H2O2激活的NLRP3炎性小體/IL?1β/Smad通路來抑制AngII或膽管結(jié)扎所致的肝纖維化。也有研究報道，NOX4介導(dǎo)的脂肪酸氧化誘導(dǎo)NLRP3炎癥小體及其下游因子IL?1β的活化與胰島素信號傳導(dǎo)功能障礙密切相關(guān)，進而引起肝內(nèi)代謝紊亂，誘導(dǎo)肝纖維化的發(fā)生與發(fā)展［36］。研究表明新生血管的形成是肝纖維化的一個重要病理特征，其中氧化應(yīng)激是新生血管形成的關(guān)鍵因素。Wang等［37］發(fā)現(xiàn)蘆丁可通過抑制NOX4?ROS?NLRP3信號通路降低肝內(nèi)血管內(nèi)皮炎癥，調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮功能，抑制胞外基質(zhì)的改變，降低肝纖維化的程度。綜上表明NOX4介導(dǎo)的NL?RP3在肝內(nèi)的炎癥損傷引起的肝纖維化方面起重要作用。

6 NOX4相關(guān)的其他信號通路參與肝纖維化

NOX4可通過各種細胞信號通路參與肝纖維化的發(fā)生、發(fā)展，其機制復(fù)雜且相互影響。目前除以上陳述的比較明確的信號通路外，一些新興的信號通路參與肝纖維化的發(fā)生發(fā)展與NOX4密切相關(guān)。Hedgehog信號通路的激活在誘導(dǎo)干細胞擴增、肝再生、促進炎性細胞聚集、肝損傷、血管重塑及肝纖維化的過程中起重要作用。Shh作為Hedgehog蛋白的重要編碼基因之一，在HSCs的活化中扮演了重要角色。PDGF可通過AKT途徑誘導(dǎo)HSCs表達Shh，進而促進HSCs中ROS產(chǎn)生，使用NOX4抑制劑可阻斷ROS的產(chǎn)生及Hh信號通路的活化，抑制Hh誘導(dǎo)的EMT 形成［20，38］。絲裂原活化蛋白激酶（mitogen?activated protein kinase，MAPK）在肝纖維化過程中對NOX4起負性調(diào)控作用。黃連素可通過活化AMPK途徑抑制NOX4的表達改善肝纖維化［39］。然而，NOX4相關(guān)信號通路除以上促肝纖維化發(fā)生發(fā)展外，在肝生長代謝方面有一定的改善作用。研究發(fā)現(xiàn)機體在受到損傷、感染、炎癥刺激時一方面可有誘導(dǎo)肝細胞內(nèi)NOX4產(chǎn)生大量ROS，活化NF?κB，引起IL?6的釋放，促進肝的進一步損傷，IL?6也可通過Smad4或JAKs途徑誘導(dǎo)鐵調(diào)素的表達，調(diào)節(jié)鐵代謝紊亂；另一方面，肝細胞內(nèi)NOX4產(chǎn)生的H202可促進STAT3蛋白磷酸化，使STAT3進入細胞核，直接與鐵調(diào)素基因啟動子相應(yīng)位點結(jié)合，促進鐵調(diào)素的表達，改善鐵沉積性肝纖維化［40?41］。生長激素通過激活轉(zhuǎn)化生長因子STAT5誘導(dǎo)ROS生成酶NOX4基因的表達，促進凋亡因子Puma、Bim的激活，控制細胞外基質(zhì)的異常增生，誘導(dǎo)HSCs的凋亡，阻止肝纖維化的進展［42］。

7 結(jié) 語

綜上所述，NOX4在肝損傷致纖維化過程中具有十分重要作用。NOX4作為細胞主要產(chǎn)生ROS的酶類，可通過ROS進一步激活細胞內(nèi)多種信號通路，如TGF?β/Smad、TLR4、NLRP3、Hedgehog、MAPK等通路激活調(diào)節(jié)肝內(nèi)細胞的增殖、分化、代謝，對肝纖維化的發(fā)生發(fā)展起至關(guān)重要的作用。因此，阻斷NOX4及其產(chǎn)生的ROS介導(dǎo)的信號通路對抗肝纖維化具有重要意義，但完全抑制NOX4活性可能影響細胞的正常生長、分裂、分化過程，這值得我們進一步研究，同時也為研發(fā)新的抗肝纖維化藥物應(yīng)用于臨床提供一定的理論基礎(chǔ)。