劉成芳， 任芳芳， 和榮麗， 張衛(wèi)國， 皇甫平， 吳博威

(山西醫(yī)科大學(xué) 1人體解剖學(xué)教研室， 2生理學(xué)教研室， 山西 太原 030001)

慢性充血性心力衰竭(congestive heart failure，CHF)是冠心病、高血壓、心肌病和瓣膜性心臟病等各種類型心血管疾病的終末階段和共同歸宿。心室重構(gòu)(ventricular remodeling，VR)是心力衰竭發(fā)生的基本機(jī)制[1]。已有研究發(fā)現(xiàn)，心肌梗死(myocardial infarction, MI)及其后引起的心力衰竭進(jìn)程中和壓力超負(fù)荷導(dǎo)致的慢性心力衰竭動(dòng)物模型中，均有心肌內(nèi)向整流鉀通道(inward rectifier potassium channel，IK1)蛋白表達(dá)的下調(diào)趨勢[2-4]，因此，IK1的變化涉及心室重構(gòu)的過程，增強(qiáng)IK1可能具有改善心室重構(gòu)的作用。我們的前期研究發(fā)現(xiàn)并證實(shí)了首個(gè)IK1選擇性激動(dòng)劑扎考比利(zacopride，ZAC)，其對(duì)大鼠心室肌IK1表現(xiàn)出特異性的激動(dòng)作用[5]。隨后我們的研究證實(shí)ZAC對(duì)心肌梗死和異丙腎上腺素所致心室重構(gòu)有改善作用[6-7]，故本研究觀察IK1選擇性激動(dòng)劑ZAC對(duì)腹主動(dòng)脈縮窄所致壓力超負(fù)荷性心室重構(gòu)的改善作用, 為IK1成為治療心力衰竭的新靶點(diǎn)進(jìn)一步提供實(shí)驗(yàn)證據(jù)。

材 料 和 方 法

1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

清潔級(jí)雄性SD 大鼠，體重200～220 g,由山西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，許可證號(hào)為SCXK(晉)2009-0001。

2 實(shí)驗(yàn)試劑及儀器

鹽酸扎考比利購自Tocris；磷酸氯喹(chloroquine，Chlor)購自 Sigma；兔抗鼠IK1抗體購自Santa Cruz；兔抗鼠β-actin抗體及RNA 提取及逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司。Vivid7/Dimension超聲儀(GE)；捷達(dá)801系列凝膠電泳圖像分析系統(tǒng)(江蘇省捷達(dá)科技發(fā)展有限公司)。

3 方法

3.1壓力超負(fù)荷模型的建立 隨機(jī)選取10只大鼠為假手術(shù)(sham)組，其余制作腹主動(dòng)脈縮窄模型。大鼠備皮后用10%水合氯醛(300 mg/kg)腹腔麻醉。常規(guī)消毒后于劍突下縱向切開腹部皮膚、肌層，并沿腹白線打開腹腔，以紗布包裹腸管并小心向下推移，使腹主動(dòng)脈充分暴露，在左腎動(dòng)脈上方0.5 cm處鈍性分離腹主動(dòng)脈，并將7號(hào)針頭與腹主動(dòng)脈一起結(jié)扎，然后抽出空針，造成腹主動(dòng)脈縮窄(橫截面減少約50%)，縫閉腹腔，以青霉素4×104U/d連續(xù) 3 d 抗感染。假手術(shù)組只開腹，暴露腹主動(dòng)脈穿線但不縮窄。

3.2實(shí)驗(yàn)分組及藥物干預(yù) 將腹主動(dòng)脈縮窄造模成功的80只大鼠入組實(shí)驗(yàn)研究，隨機(jī)分為均等的4組：溶劑對(duì)照(vehicle)組，每日腹腔內(nèi)注射0.2 mL生理鹽水；ZAC組：每日腹腔內(nèi)注射 ZAC(15 μg/kg，溶于0.2 mL生理鹽水)；Chlor組：每日腹腔內(nèi)注射 Chlor(7.5 μg/kg，溶于0.2 mL生理鹽水)；ZAC+Chlor組：每日腹腔內(nèi)注射ZAC和Chlor，劑量同前，溶于0.2 mL生理鹽水中。Sham組每日腹腔內(nèi)注射0.2 mL生理鹽水。腹主動(dòng)脈縮窄手術(shù)24 h后開始給藥，大鼠每3 d 稱重 1 次，根據(jù)體重調(diào)整用藥量。連續(xù)給藥8周。觀察大鼠的存活率，8周后進(jìn)行各指標(biāo)的檢測。

3.3超聲心動(dòng)圖檢測大鼠心功能 各組大鼠麻醉后仰臥位固定、胸部剃毛備皮、暴露。采用GE Vi-vid7超聲儀上配備的10S探頭進(jìn)行檢測。取胸骨旁左室長軸和短軸切面，由二維超聲引導(dǎo)M型曲線并進(jìn)行測量。測量指標(biāo)包括：左心室舒張末期內(nèi)徑(left ventricular end-diastolic dimension， LVEDD)、左心室收縮末期內(nèi)徑(left ventricular end-systolic dimension，LVESD)、左心室射血分?jǐn)?shù)(left ventricular ejection fraction，LVEF)和左心室短軸縮短率(left ventricular fractional shortening，LVFS)。各指標(biāo)均在連續(xù)3個(gè)心動(dòng)周期上測量后取其平均值。

3.4全心質(zhì)量指數(shù)和左心室質(zhì)量指數(shù)的測量 摘取心臟，剪去周圍大血管，在冰生理鹽水中洗凈血液，濾紙吸干，稱取全心重量(heart weight，HW)，沿房室交界處去除左右心房，再剪去右心室游離壁，保留左心室及室間隔，稱取左心室重量(left ventricular weight，LVW)。分別計(jì)算全心質(zhì)量指數(shù)(HW/BW)和左心室質(zhì)量指數(shù)(LVW/BW)。取左心室心肌組織，1 mm×1 mm×1 mm大小共5塊，用于電鏡檢查。其余組織分為2部分，分別用4%的PBS多聚甲醛固定和-80 ℃超低溫冰箱儲(chǔ)存。

3.5心肌組織HE染色 將留取的心臟標(biāo)本用4%多聚甲醛固定后，常規(guī)石蠟包埋、切片，厚度為5 μm，行常規(guī)HE 染色，于普通光鏡下觀察攝片，高倍鏡下進(jìn)行心肌細(xì)胞橫斷面積測定。

3.6透射電鏡觀察心肌超微結(jié)構(gòu) 2.5%戊二醛和四氧化鋨雙重固定左室心肌組織標(biāo)本，經(jīng)丙酮脫水，環(huán)氧樹脂包埋，溫箱聚合后，切片，厚度50～70 nm，醋酸雙氧鈾染色20 min，檸檬酸鉛染色20 min后，在透射電鏡下觀察各組大鼠心肌組織超微結(jié)構(gòu)。

3.7Western blot檢測各組大鼠心肌組織IK1蛋白的表達(dá) 取各實(shí)驗(yàn)組大鼠新鮮心肌組織0.5 g，提取組織中的總蛋白，定量及變性后通過Western blot 檢測各組大鼠心肌組織IK1(抗體稀釋1∶200)和內(nèi)參照β-actin(抗體稀釋1∶2 000)的蛋白表達(dá)，以各組IK1與β-actin的灰度比值來評(píng)定各組大鼠之間心肌組織中IK1的蛋白表達(dá)水平。

3.8RT-PCR檢測大鼠心肌組織中Kir2.1的mRNA表達(dá) 取各組大鼠新鮮左心室組織，用Invitrogen TRIzol進(jìn)行RNA提取，然后將RNA 逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，根據(jù)GenBank序列，設(shè)計(jì)Kir2.1和GAPDH引物序列并合成：Kir2.1的上游引物序列為5’-CCCCTTGGACCAGATAGACA-3’，下游引物序列為5’-ATGCCTTCCAGGATGACAAC-3’；GAPDH的上游引物序列為5’-AATCCCATCACCATCTTC-3’，下游引物序列為5’-CATCACGCCACAGTTTCC-3’。經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分析，以Labwork 圖像分析系統(tǒng)分析條帶灰度，計(jì)算Kir2.1與GAPDH 擴(kuò)增產(chǎn)物的比值來表示Kir2.1的mRNA 表達(dá)水平。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。生存率的比較用卡方檢驗(yàn)，其它數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，用單因素方差分析(one-way ANOVA)比較組間差異。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 各組大鼠的存活率、HW/BW和LVW/BW的比較

在整個(gè)實(shí)驗(yàn)期間，sham組大鼠無1例死亡，而vehicle組及藥物干預(yù)組大鼠都有不同程度的死亡，經(jīng)2分析各組大鼠存活率的差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(P=0.226)，見表1。

與sham組比較，vehicle組、Chlor組和ZAC+Chlor組大鼠的HW/BW和LVW/BW顯著增高(P<0.05);與vehicle組相比，ZAC組大鼠的HW/BW和LVW/BW顯著降低(P<0.05)， 見表1。

表1各組大鼠的存活率、心重/體重比和左心室/體重比的比較

Table 1.The survival rate, the ratio of HW/BW and the ratio of LVW/BW of rats in different groups (Mean±SD.n=10)

GroupSurvival rate (%)HW/BW (mg/g)LVW/BW (mg/g)Sham1002.83±0.312.18±0.22Vehicle753.61±0.35??3.05±0.41??ZAC853.17±0.28#2.43±0.20##Chlor753.70±0.33??3.08±0.39??ZAC+Chlor703.47±0.27?2.97±0.18?

HW: heart weight; BW: body weight; LVW: left ventricle weight; ZAC: zacopride; Chlor: chloroquine.*P<0.05,**P<0.01vssham group;#P<0.05,##P<0.01vsvehicle group.

2 各組大鼠心功能的變化

大鼠腹主動(dòng)脈結(jié)扎8周后M型超聲心動(dòng)圖顯示，與sham組相比，vehicle組大鼠的左室腔擴(kuò)大，LVEDS和LVEDD均顯著增加，LVEF和LVFS明顯降低(P<0.01)，提示vehicle組大鼠左心功能降低；ZAC預(yù)防性給藥組的LVEDS和LVEDD均較vehicle組明顯降低(P<0.05)，LVEF和LVFS顯著升高(P<0.01)；給予Chlor后阻斷了ZAC對(duì)腹主動(dòng)脈縮窄大鼠心功能的保護(hù)作用，見圖1。

3 各組大鼠心肌組織HE染色觀察

Sham組大鼠的心肌纖維完整，排列整齊，無血管擴(kuò)張及血管壁增厚等表現(xiàn)；vehicle組、Chlor組和ZAC+Chlor組大鼠的心肌細(xì)胞肥大，細(xì)胞核大而深染、心肌橫斷面積增大；心肌纖維增粗且排列紊亂、間隙增寬；ZAC組的心肌細(xì)胞輕度肥大，心肌纖維排列欠整齊、稍顯紊亂、細(xì)胞核偏大。與vehicle組相比，ZAC組心肌細(xì)胞橫斷面積明顯減小,見圖2。

4 各組大鼠的心肌超微結(jié)構(gòu)觀察

Sham組心肌肌絲排列整齊，肌膜完整,線粒體顯示清楚，排列均勻，嵴排列整齊；vehicle組、Chlor組和ZAC+Chlor組的心肌組織可見局灶性肌絲溶解，線粒體明顯腫脹，可見空泡樣變性，排列紊亂;ZAC治療組心肌超微結(jié)構(gòu)較vehicle組有明顯改善，心肌細(xì)胞未見明顯變性，肌絲纖維排列規(guī)則，線粒體結(jié)構(gòu)尚清；閏盤結(jié)構(gòu)整齊，見圖3。

5 Western blot檢測各組大鼠心肌組織IK1蛋白的表達(dá)

與sham組相比，vehicle組、Chlor組和ZAC+Chlor組大鼠的心肌組織IK1蛋白表達(dá)明顯降低，ZAC組的IK1蛋白表達(dá)水平顯著高于vehicle組(P<0.01),見圖4。

6 RT-PCR檢測各組大鼠心肌組織Kir2.1的mRNA表達(dá)

與sham組相比，vehicle組、Chlor組和ZAC+Chlor組Kir2.1的mRNA 表達(dá)顯著減少，與vehicle組相比， ZAC組Kir2.1的mRNA 表達(dá)顯著增加(P<0.01),見圖5。

討 論

本研究采用腹主動(dòng)脈縮窄壓力超負(fù)荷大鼠模型，其機(jī)制是通過腹主動(dòng)脈縮窄，使主動(dòng)脈壓力升高，心臟后負(fù)荷增加，心肌代償性肥厚，心室容積增加，心臟擴(kuò)大，后期心臟失代償，最終形成心力衰竭[8]。心衰形成過程中，心臟結(jié)構(gòu)及功能變化是一個(gè)動(dòng)態(tài)演變過程。腹主動(dòng)脈縮窄8周是大鼠心衰發(fā)生發(fā)展非常重要的時(shí)期[9],故我們選取8周作為心室重構(gòu)的觀察點(diǎn)。本研究預(yù)防性腹腔給予IK1激動(dòng)劑ZAC，8周后觀察到ZAC對(duì)壓力超負(fù)荷大鼠心功能、心肌細(xì)胞形態(tài)有明顯的改善作用，具體表現(xiàn)在：與vehicle組相比，ZAC組大鼠LVEDD及LVESD明顯減小，LVEF顯著升高；ZAC組大鼠HW/BW和LVW/BW顯著降低，心肌細(xì)胞肥大程度減輕，橫斷面積明顯減小；超微結(jié)構(gòu)明顯改善，說明ZAC抑制了壓力超負(fù)荷大鼠心臟結(jié)構(gòu)與功能的惡化。

Figure 1.Left ventricular function of the rats in different groups. Mean±SD.n=6.*P<0.05,**P<0.01vssham group;#P<0.05,##P<0.01vsvehicle group.

圖1各組大鼠的左室心功能

本研究結(jié)果還發(fā)現(xiàn)，vehicle組IK1蛋白表達(dá)水平顯著降低，這與心衰時(shí)心肌IK1蛋白表達(dá)水平下降的研究報(bào)道是一致的[4]，而ZAC組大鼠心肌組織中Ik1蛋白表達(dá)水平顯著高于vehicle組。心肌IK1通道主要是由Kir2.1、Kir2.2和Kir2.3 3種亞單位構(gòu)成的同源或異源四聚體。研究證實(shí)，Kir2.1通道是構(gòu)成IK1的主要亞型，所介導(dǎo)的電流占總 IK1電流的80%以上[10]。我們前期研究進(jìn)一步證實(shí)，ZAC激動(dòng)IK1的有效靶點(diǎn)只是Kir2.1的同源聚合體，它對(duì)Kir2.2和Kir2.3的同源體以及這3種亞單位任意組合的異聚體都無效[11]。本研究中ZAC組大鼠心肌Kir2.1基因表達(dá)水平明顯高于vehicle組，進(jìn)一步說明ZAC可能是通過激動(dòng)Ik1中Kir2.1亞型發(fā)揮抗壓力超負(fù)荷性心室重構(gòu)的作用。

Figure 2.HE staining and the cross-sectional area of the cardiomyocytes (×400). Mean±SD.n=10.*P<0.05,**P<0.01vssham group;##P<0.01vsvehicle group.

圖2心肌HE染色及心肌細(xì)胞的橫斷面積

Figure 3.The ultrastructure of the rat cardiomyocytes in different groups (×20 000). M: mitochondrion.

圖3各組大鼠的心肌超微結(jié)構(gòu)

Figure 4.The protein expression of IK1in the rat myocardium. Mean±SD.n=6.**P<0.01vssham group;##P<0.01vsvehicle group.

圖4大鼠心肌IK1蛋白的表達(dá)

Figure 5.The mRNA expression of Kir2.1 in the rat myocar-dium. Mean±SD.n=6.**P<0.01vssham group;##P<0.01vsvehicle group.

圖5大鼠心肌Kir2.1的mRNA表達(dá)

心室重構(gòu)中，心肌細(xì)胞的電生理異常主要是動(dòng)作電位時(shí)程(action potential duration, APD)延長，心肌L型Ca通道開放時(shí)間增加，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度升高[7,12]；升高的Ca2+可以激活下游的鈣/鈣調(diào)蛋白依賴性蛋白激酶Ⅱ(calcium/calmodulin-dependent protein kinase II，CaMKII)[13]，而CaMKII可激活磷酸化的磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K)。PI3K是細(xì)胞內(nèi)重要的蛋白激酶，磷酸化的磷脂作為第二信使募集和活化下游蛋白激酶B(protein kinase B，PKB/Akt)，活化的PI3K-Akt可進(jìn)一步激活其下游分子哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)和p70 S6激酶(p70 S6 kinase, p70S6K), 促進(jìn)心肌細(xì)胞的肥大、分化和凋亡等活動(dòng)[14-15]，Ca2+激活的信號(hào)通路在心室重構(gòu)中發(fā)揮關(guān)鍵作用。我們的前期研究已經(jīng)證實(shí)IK1激動(dòng)劑ZAC可減輕口服左甲狀腺素及心肌梗死后所致心室重構(gòu)的損傷程度，并且ZAC組心肌細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度顯著低于模型組，且靜息膜電位(resting membrane electric potential, RMP)增大，APD縮短[6-7]；ZAC組大鼠心肌組織中mTOR和p70 S6K蛋白表達(dá)水平明顯下降[6]。故ZAC是否是通過增強(qiáng)IK1通道活性，增大RMP，縮短APD，減少電壓門控Ca2+內(nèi)流，抑制CaMKII-PI3K-Akt-mTOR-p70S6K磷酸化信號(hào)通路，從而改善壓力超負(fù)荷性心室重構(gòu)的發(fā)生，有待我們進(jìn)一步研究。