崔海鵬， 劉 凱， 郭天嬌， 孫曉旭， 王 途， 謝亞芹， 李 穎， 苗光新， 趙 娟

(承德醫(yī)學(xué)院病理生理學(xué)教研室， 河北 承德 067000)

動(dòng)脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)是一種血脂異常及血管壁成分改變的動(dòng)脈疾病，是冠心病、腦梗死和外周血管疾病等疾病的主要原因[1]。脂質(zhì)代謝障礙為AS的病變基礎(chǔ)，肝臟被視為脂質(zhì)代謝的重要場(chǎng)所，而在AS的發(fā)生過程中往往伴有肝功能異常[2]。Urantide是在人尾加壓素II(urotensin Ⅱ,UII)基礎(chǔ)上衍生而來(lái)的受體拮抗劑[3-4]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，urantide可降解胸主動(dòng)脈壁內(nèi)的膠原蛋白，抑制UII對(duì)胸主動(dòng)脈的損傷作用[3-5]。然而urantide對(duì)AS大鼠肝臟功能的具體作用機(jī)制尚不清楚。本研究利用Wistar大鼠建立AS模型作為研究對(duì)象，初步探討了urantide對(duì)AS大鼠肝臟的影響，為臨床工作中urantide治療AS以及對(duì)肝臟的保護(hù)作用提供理論依據(jù)。

材 料 和 方 法

1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)Wistar雄性大鼠，3周齡，體重180～200 g，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)為SCXK(京)-2016-0011，生產(chǎn)合格證為1140070012720。

2 主要試劑

Urantide由蘇州強(qiáng)耀生物公司合成；辛伐他汀(simvastatin,SIM)購(gòu)于北京諾華制藥有限公司；維生素D3(vitamin D3， VD3)購(gòu)于哈爾濱市華晟科技動(dòng)物藥品廠；膽固醇和膽酸鈉購(gòu)于Sigma；TRIzol裂解液、RIPA裂解液、Bradford蛋白濃度測(cè)定試劑盒和超敏ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒購(gòu)于碧云天生物技術(shù)有限公司；TIANScript cDNA第一鏈合成試劑盒和SuperReal PreMix SYBR Green購(gòu)于天根生化科技有限公司；UII及其受體GPR14的RT-qPCR引物由大連寶生物工程有限公司合成；兔抗大鼠UII和GPR14抗體購(gòu)于Santa；兔抗大鼠β-actin抗體和HRP標(biāo)記山羊抗兔Ⅱ抗購(gòu)于Bioworlde。

3 主要方法

3.1AS模型復(fù)制及分組 Wistar大鼠180只適應(yīng)性飼養(yǎng)1周[恒定溫度(22±2)℃，相對(duì)濕度(50±10)%，正常攝食及飲水]后，隨機(jī)分為2組，即正常對(duì)照(normal control,NC)組30只和AS模型(AS)組150只。其中，NC組給予普通飼料，自由飲水；AS組給予高脂飼料，自由飲水，并于造模開始時(shí)，連續(xù)3 d腹腔注射VD3(150 U·kg-1·d-1)，復(fù)制大鼠AS模型，實(shí)驗(yàn)周期為4周。剪取大鼠胸主動(dòng)脈，進(jìn)行血脂成分分析及病理學(xué)檢測(cè)，以判斷造模是否成功。以隨機(jī)數(shù)字表法，將AS模型組大鼠隨機(jī)分為模型(AS)組、陽(yáng)性藥(SIM)組及urantide給藥3 d(U3)、7 d(U7)和14 d(U14)組，其中，NC組和AS組每只大鼠連續(xù)14 d每天尾靜脈注射生理鹽水(30 μg/kg)，SIM組每只大鼠連續(xù)14 d每天灌胃辛伐他汀(5 μg/kg)，urantide各組每只大鼠每天尾靜脈注射urantide (30 μg/kg)，給藥周期分別為3、7和14 d。高脂飼料由80.8%基礎(chǔ)飼料、3.5%膽固醇、10%豬油、0.2%丙硫氧嘧啶、0.5%膽酸鈉和5%白糖配制而成[3-5]。

3.2樣本采集 樣本采集前各組大鼠禁食12 h，麻醉，胸主動(dòng)脈取血于采血管，離心15 min(4 ℃、3 000 r/min)分離血清，進(jìn)行肝功能檢測(cè)；分別取大鼠胸主動(dòng)脈和肝臟，生理鹽水洗去血跡后，各組隨機(jī)選取15只用4%多聚甲醛固定，待形態(tài)學(xué)檢測(cè)；剩余15只迅速冷凍于液氮，待后續(xù)分子生物學(xué)檢查。

3.3大鼠肝功能檢測(cè) 全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)大鼠血清中丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(alanine aminotransferase,ALT)、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(aspartate aminotransferase, AST)、γ-谷氨酰轉(zhuǎn)移酶(γ-glutamyltransferase, γ-GT)、乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase, LDH)、總膽紅素(total bilirubin, TBIL)、直接膽紅素(direct bilirubin, DBIL)、間接膽紅素(indirect bilirubin, IBIL)、堿性磷酸酶(alkalin phosphatase, ALP)、總蛋白(total protein, TP)、球蛋白(globulin, GLB)和白蛋白(albumin, ALB)的含量。

3.4大鼠胸主動(dòng)脈和肝臟的組織形態(tài)學(xué)觀察 將固定好的大鼠胸主動(dòng)脈和肝臟組織經(jīng)脫水、透明、浸蠟、包埋后制備成石蠟切片，經(jīng)二甲苯脫蠟、梯度乙醇水化后，常規(guī)HE染色后光鏡下拍照觀察病理學(xué)變化。

3.5RT-qPCR法檢測(cè)大鼠肝臟UII與GPR14的mRNA表達(dá) TRIzol法提取肝臟組織總RNA，紫外分光光度計(jì)進(jìn)行定量，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，熒光定量檢測(cè)試劑盒分別檢測(cè)UII、GPR14和β-actin mRNA的Ct值，引物序列見表1。擴(kuò)增條件：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，60 ℃ 34 s，40個(gè)循環(huán)；做熔解曲線。以各基因Ct值與β-actin Ct值的差值為ΔCt，采用2-ΔΔCt法計(jì)算各基因mRNA的相對(duì)表達(dá)水平。

表1 RT-qPCR的引物序列

3.6Western blot法檢測(cè)大鼠肝臟UII與GPR14 的蛋白表達(dá) RIPA裂解液提取肝組織樣本的總蛋白，Bradford蛋白濃度測(cè)定試劑盒進(jìn)行蛋白定量。45 μg蛋白于SDS-PAGE 12%分離膠分離并轉(zhuǎn)膜，常溫封閉1 h，加入U(xiǎn)II(1 ∶200)、GPR14(1∶100)和β-actin(1∶10 000)兔抗大鼠Ⅰ抗，4 ℃孵育過夜，洗膜后，加入HRP標(biāo)記山羊抗兔Ⅱ抗(1∶5 000)，常溫孵育l h，洗膜后用超敏ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒顯影。各蛋白條帶灰度值與β-actin條帶灰度值的比值為各蛋白的相對(duì)表達(dá)水平。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，多組間比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 Urantide對(duì)各組大鼠ALT、AST、γ-GT及LDH的影響

與NC組相比，AS組大鼠血清中ALT、AST、γ-GT和LDH水平顯著升高(P<0.05)；urantide各治療組大鼠上述各項(xiàng)指標(biāo)較AS組均顯著降低(P<0.05),其中U7組中ALT、AST和γ-GT水平最接近于SIM組，見表2。

表2 Urantide對(duì)各組大鼠ALT、AST、γ-GT及LDH的影響

*P<0.05vsNG group;△P<0.05vsAS group.

2 Urantide對(duì)各組大鼠TBIL、DBIL、IBIL及ALP的影響

與NC組相比，AS組大鼠血清中TBIL、IBIL和ALP水平顯著升高(P<0.05)；urantide各治療組大鼠上述各項(xiàng)指標(biāo)較AS組均呈顯著降低趨勢(shì)(P<0.05),其中TBIL和IBIL水平隨給藥時(shí)間呈逐漸降低趨勢(shì)，U3和U7組ALP水平接近于NC組。各組血清中DBIL水平均無(wú)顯著變化，見表3。

表3 Urantide對(duì)各組大鼠TBIL、DBIL、IBIL及ALP的影響

*P<0.05vsNC group;△P<0.05vsAS group.

3 Urantide對(duì)各組大鼠TP、GLB及ALB的影響

Urantide對(duì)各組大鼠血清中TP、GLB和ALB水平均無(wú)顯著影響，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見表4。

4 AS大鼠胸主動(dòng)脈的組織結(jié)構(gòu)改變

表4Urantide對(duì)各組大鼠TP、GLB及ALB的影響

Table 4.The effect of urantide on TP, GLB and ALB in the rats of each group (g/L. Mean±SD.n=10)

GroupTPGLBALBNC61.14±4.6725.75±2.1535.38±2.80AS55.42±8.9725.40±5.4830.02±3.80SIM60.77±7.8427.01±4.7333.76±3.43U352.57±3.9924.68±2.4327.84±2.11U759.79±3.1224.88±11.8734.91±1.53U1456.31±5.6726.64±3.7629.67±2.43

HE染色結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)第6周，NC組大鼠胸主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞完整，中膜平滑肌細(xì)胞排列整齊，且外彈力纖維層結(jié)構(gòu)清晰，呈環(huán)形排列，外膜由疏松結(jié)締組織構(gòu)成，內(nèi)膜、中膜、外膜分界清晰完整；AS組大鼠胸主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞破壞，出現(xiàn)明顯的鈣化，中膜平滑肌細(xì)胞增殖、萎縮，彈力纖維斷裂，為典型AS病理變化，表明AS模型建立成功，見圖1。

5 Urantide對(duì)各組大鼠肝組織形態(tài)學(xué)的影響

HE染色結(jié)果顯示，NC組大鼠肝組織結(jié)構(gòu)完整、清晰，肝小葉結(jié)構(gòu)正常，肝細(xì)胞形態(tài)正常，肝索排列均勻規(guī)則，無(wú)壞死、脂肪變性；AS組大鼠肝小葉變形，界限不清晰，肝索排列紊亂，肝細(xì)胞腫脹變形，大小不均勻，可見局部壞死，細(xì)胞質(zhì)中見大小不等的空泡，為脂滴，部分細(xì)胞核偏向細(xì)胞一側(cè)，為典型的肝細(xì)胞脂肪變性；SIM組肝小葉結(jié)構(gòu)清晰，肝細(xì)胞形態(tài)基本正常，大小基本均勻，肝索排列尚可；U3組肝小葉少有變形，肝細(xì)胞形態(tài)偶有變形，細(xì)胞質(zhì)中空泡減少，脂肪變性程度減輕；U7與U14組肝小葉結(jié)構(gòu)基本正常，細(xì)胞形態(tài)基本趨于CG組，見圖2。

Figure 1.Morphological changes of thoracic aorta in atherosclerotic (AS) rats (HE staining, ×400). Arrows 1: vascular tunica externa; 2: vascular tunica media; 3: vascular tunica intima; 4: elastic fibers; 5: broken elastic fibers in vascular tunica media in atherosclerotic state; 6: calcification in atherosclerotic state.

圖1AS大鼠胸主動(dòng)脈的組織結(jié)構(gòu)

Figure 2.The effect of urantide on liver tissues in the rats of each group (HE staining, ×200). Arrows 1: steatosis in hepatocyte; 2: hepatocyte nuclear deviation.

圖2Urantide對(duì)各組大鼠肝組織形態(tài)學(xué)改變的影響

6 Urantide對(duì)各組大鼠肝臟UII和GPR14 mRNA及蛋白表達(dá)的影響

與NC組相比，AS組大鼠肝臟中UII和GPR14 mRNA及蛋白表達(dá)顯著升高(P<0.05)；與AS組相比，urantide各給藥組大鼠肝臟中UII及GPR14 mRNA表達(dá)顯著降低(P<0.05)，并且接近于NC組，隨給藥時(shí)間呈逐漸降低趨勢(shì),見圖3A；urantide各給藥組大鼠肝臟中GPR14蛋白表達(dá)較AS組均顯著降低(P<0.05)；而U3組UII蛋白表達(dá)較AS組顯著升高(P<0.05)，U7和U14組UII蛋白表達(dá)較AS組顯著降低(P<0.05)，見圖3B。

Figure 3.The mRNA and protein expression of UII and GPR14 in the liver tissues. A: the mRNA expression of UII and GPR14 was detected by RT-qPCR; B: the protein expression of UII and GPR14 was detected by Western blot. Mean±SD.n=10.*P<0.05vsNC group;△P<0.05vsAS group.

圖3大鼠肝臟UII和GPR14mRNA及蛋白表達(dá)的變化

討 論

目前研究表明，高脂飲食可增加血液中游離脂肪酸水平，從而顯著增加肝臟中甘油三酯的合成，肝臟負(fù)荷過重，可導(dǎo)致肝功能受損[6-7]。有研究發(fā)現(xiàn)肝細(xì)胞脂肪變性及其伴隨的肝臟壞死性炎癥對(duì)AS有促進(jìn)作用，脂肪肝成為AS形成的危險(xiǎn)性因素[8];同時(shí)，AS發(fā)生時(shí)，常常伴有血脂升高，肝臟脂質(zhì)代謝功能降低，以及肝功能異常。據(jù)此，本實(shí)驗(yàn)通過飼喂大鼠高脂飼料聯(lián)合給予VD3的方法建立AS模型，高脂飲食大大加重了大鼠肝臟負(fù)荷。本研究中，肝功能檢測(cè)顯示，AS組大鼠血清中ALT、AST、γ-GT、LDH、TBIL、IBIL及ALP水平較CG組顯著升高，而TP、GLB和ALB無(wú)顯著變化，表明大鼠在發(fā)生AS時(shí)伴有肝細(xì)胞實(shí)質(zhì)性損傷以及肝臟排泄功能障礙，對(duì)肝臟本身合成功能無(wú)顯著影響。病理學(xué)檢測(cè)結(jié)果顯示，AS組大鼠肝細(xì)胞腫脹變形，胞質(zhì)內(nèi)形成大量脂滴，發(fā)生嚴(yán)重的脂肪變性。以上結(jié)果表明，肝細(xì)胞受損可導(dǎo)致大鼠脂質(zhì)代謝紊亂，對(duì)加重AS的發(fā)生發(fā)展起到關(guān)鍵作用。

AS的發(fā)生是多因素相互作用的復(fù)雜的病理生理過程。UII作為一種生長(zhǎng)抑素樣環(huán)肽被視為促進(jìn)AS發(fā)生發(fā)展的主要發(fā)病機(jī)制之一[9]。UII可與其特異性受體GPR14相結(jié)合而構(gòu)成UII/UT 系統(tǒng)進(jìn)入細(xì)胞中發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)，如促進(jìn)血管收縮和炎癥反應(yīng)等[9-10]。有文獻(xiàn)報(bào)道，在人AS斑塊、血管平滑肌細(xì)胞和巨噬細(xì)胞中有大量的UII及其受體GPR14表達(dá)[11]。本研究發(fā)現(xiàn)，UII及其受體GPR14在AS大鼠肝臟中也大量表達(dá)，UII/GPR14在AS大鼠肝臟脂質(zhì)代謝紊亂中可能發(fā)揮關(guān)鍵生物學(xué)作用。

他汀類藥物作為目前最有效的降脂類藥物可有效地預(yù)防AS和血栓的形成[12-13]，本研究采用辛伐他汀作為陽(yáng)性藥物，用于評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)用藥對(duì)AS大鼠的治療作用，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，辛伐他汀對(duì)AS大鼠的肝脂肪變性治療效果顯著，辛伐他汀可通過降低AS大鼠血脂水平起到保護(hù)肝臟的作用。然而有研究表明，長(zhǎng)時(shí)間服用他汀類藥物可導(dǎo)致血液中轉(zhuǎn)氨酶異常升高，尤其多發(fā)于肝功能不全患者[14]。本研究中辛伐他汀因給藥時(shí)間相對(duì)較短，不足以誘發(fā)大鼠自身肝臟的損傷，而長(zhǎng)期服用辛伐他汀對(duì)AS大鼠的肝臟影響有待進(jìn)一步研究。

隨著生物技術(shù)與多肽合成技術(shù)的日臻成熟，多肽類藥物因適應(yīng)廣、安全性高且療效顯著已被廣泛應(yīng)用于腫瘤、肝炎和糖尿病等疾病的預(yù)防、診斷和治療。Urantide目前被認(rèn)為是最有效的多肽類UII受體拮抗劑[3-4, 10]，本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，urantide可阻斷UII與其受體GPR14結(jié)合抑制炎癥反應(yīng)，保護(hù)大鼠胸主動(dòng)脈，起到治療AS的作用[3, 5]。但urantide對(duì)AS大鼠肝臟具體作用尚不清楚。本實(shí)驗(yàn)采用尾靜脈注射urantide對(duì)AS大鼠分別給予3 d、7 d和14 d治療。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，urantide顯著降低了AS大鼠血清中ALT、AST、γ-GT、LDH、TBIL、IBIL及ALP水平，同時(shí)urantide可明顯改善AS大鼠肝臟脂肪變性，減輕肝細(xì)胞損傷，說(shuō)明urantide對(duì)AS大鼠肝臟具有一定的保護(hù)作用。

根據(jù)以上研究結(jié)果，我們推測(cè)其作用機(jī)制可能是由于urantide通過抑制AS大鼠肝臟中UII與其受體GPR14結(jié)合進(jìn)而起到對(duì)肝細(xì)胞的保護(hù)作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，隨著urantide給藥時(shí)間的延長(zhǎng)，AS組大鼠肝臟中UII和GPR14的mRNA及蛋白表達(dá)水平顯著降低。由此，證實(shí)了我們的假設(shè)，urantide通過抑制大鼠肝臟中UII及其受體GPR14的表達(dá)，導(dǎo)致GPR14無(wú)法進(jìn)入細(xì)胞發(fā)揮生物學(xué)作用，進(jìn)而抑制炎癥反應(yīng)發(fā)生，減輕肝功能的損傷，緩解大鼠的肝脂肪病變，脂質(zhì)代謝得以恢復(fù)，有效地緩解大鼠的AS病變。而其具體作用機(jī)制有待于進(jìn)一步證實(shí)。

總之，urantide在治療大鼠AS的同時(shí)，本研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，urantide對(duì)AS大鼠的非酒精性脂肪肝病變具有明顯的修復(fù)作用。為臨床應(yīng)用urantide治療AS及其并發(fā)癥非酒精性脂肪肝提供數(shù)據(jù)支持。