李若夢， 鄒金茂， 李雅晴， 陳少杰， 練國達， 陳茵婷， 蘇 紅， 黃開紅

(中山大學孫逸仙紀念醫(yī)院消化內(nèi)科， 廣東省惡性腫瘤表觀遺傳和基因調(diào)控重點實驗室， 廣東 廣州 510120)

胰腺癌發(fā)病隱匿，早期即可發(fā)生遠處轉(zhuǎn)移，且對放化療均不敏感，因此臨床預后極差，5年生存率僅為6%[1-2]。近年來，越來越多的證據(jù)表明腫瘤微環(huán)境(tumor microenvironment，TME)在胰腺癌的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用[3]?；|(zhì)細胞衍生因子1 (stromal cell-derived factor-1，SDF-1; 又稱趨化因子CXCL12)作為胰腺癌微環(huán)境中一種重要的趨化因子，主要在腫瘤間充質(zhì)細胞中表達，而腫瘤細胞則高表達其特異性受體CXCR4。SDF-1/CXCR4軸可激活多條下游信號通路，參與胰腺癌的發(fā)生發(fā)展過程，尤其是侵襲和轉(zhuǎn)移[4]。本研究旨在探討SDF-1/CXCR4軸對胰腺癌細胞遷移和侵襲能力的影響及其作用機制。

材 料 和 方 法

1 細胞

人胰腺癌細胞株P(guān)ANC-1和Capan-2購自ATCC, BxPc-3和SW1990購自中國科學院細胞庫。

2 主要試劑和儀器

SDF-1α購自Peprotech；AMD3100購自Sigma-Aldrich；兔抗人E-cadherin單克隆抗體、兔抗人N-cadherin單克隆抗體、兔抗人波形蛋白(vimentin)單克隆抗體、鼠抗人SNAIL單克隆抗體和鼠抗人β-actin單克隆抗體均購自Cell Signaling Technology；兔抗人TWIST多克隆抗體購自Abcam；高糖DMEM培養(yǎng)液購自Gibco；胎牛血清購自HyClone；TRIzol購自TaKaRa；基質(zhì)膠和Transwell小室(8 μm孔徑，聚碳酸酯膜)購自Corning；HRP標記山羊抗兔IgG(H+L)購自上海愛必信公司；HRP標記山羊抗鼠IgG(H+L)購自Merck Millipore；MTS試劑購自Promega；其它生化試劑均為進口分裝或國產(chǎn)分析純。PCR引物由上海生工生物工程公司合成，見表1。LightCycler 96 Real-Time PCR System(Roche)；G:BOX XT4智能成像系統(tǒng)(Syngene)；Eclipse 80i正置成像顯微鏡 (Nikon)。

表1 引物序列

3 主要方法

3.1細胞培養(yǎng) 人胰腺癌細胞株P(guān)ANC-1、BxPc-3、SW1990和Capan-2均培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液、恒溫37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)瓶中的細胞貼壁生長至80%～90%融合時用0.25%胰蛋白酶消化傳代。

3.2SDF-1α及AMD3100處理PANC-1細胞實驗分組 將細胞接種于12孔板中，每孔加入1 mL完全培養(yǎng)液，含1.5×105個細胞。待細胞貼壁生長至約80%融合時，去掉培養(yǎng)液，用PBS洗2遍后，每孔加入1 mL無血清培養(yǎng)液饑餓處理細胞12 h。12 h后，去掉培養(yǎng)液。為檢測SDF-1α處理不同時間對細胞上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)相關(guān)標志物表達的影響，各組分別加入1 mL含100 μg/L SDF-1α無血清培養(yǎng)液處理細胞12 h、24 h、48 h和72 h；為檢測不同濃度SDF-1α對細胞EMT相關(guān)標志物表達的影響，參考相關(guān)文獻的濃度分組[5]，我們設置了50 μg/L、100 μg/L和200 μg/L 3個SDF-1α濃度梯度組，即各組分別加入1 mL含50 μg/L、100 μg/L和200 μg/L SDF-1α無血清培養(yǎng)液處理細胞48 h；為檢測激活或阻斷CXCR4對細胞EMT相關(guān)標志物表達的影響，我們設置了對照組、SDF-1處理組、SDF-1+AMD3100處理組和AMD3100處理組，對照組僅加入1 mL無血清培養(yǎng)液，SDF-1處理組加入1 mL含100 μg/L SDF-1α的無血清培養(yǎng)液，SDF-1+AMD3100處理組先加入1 mL含1 mg/L AMD3100的無血清培養(yǎng)液于培養(yǎng)箱孵育30 min后再加入100 μg/L SDF-1α，AMD3100處理組加入1 mL含1 mg/L AMD3100的無血清培養(yǎng)液,處理細胞48 h。

3.3RT-qPCR實驗檢測CXCR4的表達 按TRIzol說明書提取細胞總RNA,逆轉(zhuǎn)錄為CDNA。PCR反應在LightCycler 96 PCR儀上進行，每個樣品同時設3個復孔。反應程序為：95 ℃ 30 s，1個循環(huán)；95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，97 ℃ 1 s，40個循環(huán)；37 ℃ 30 s，1個循環(huán)。反應結(jié)束后，記錄擴增曲線、熔解曲線及樣本的循環(huán)閾值(Ct)，以β-actin為內(nèi)參照校正各組mRNA的表達水平，采用2-ΔΔCt公式進行相對定量計算。實驗獨立重復3次。

3.4Western blot實驗 細胞處理相應時間后，用PBS洗3次，加RIPA裂解15 min后提取細胞蛋白，用BCA試劑盒測定蛋白濃度。20 μg等量蛋白上樣，SDS-PAGE (70 mV恒壓電泳至肉眼可見Marker分離后，換100 mV恒壓電泳)，用0.45 μm PVDF膜200 mA恒流電轉(zhuǎn)150 min，5%脫脂奶粉封閉1 h，加入Ⅰ抗稀釋液(1∶1 000)4 ℃孵育過夜;TBST洗膜后，加入Ⅱ抗稀釋液 (1∶5 000)室溫孵育1 h。洗膜后用化學發(fā)光法(ECL)顯像。

3.5Transwell遷移和侵襲實驗 將Transwell小室置于24孔板中。侵襲實驗前，在小室上室鋪70 μL 1∶10稀釋基質(zhì)膠，置于培養(yǎng)箱過夜，待膠凝固后備用。遷移試驗無需鋪膠。將處于對數(shù)生長期的PANC-1細胞消化后用PBS洗1遍，用無血清培養(yǎng)液制成3×108/L的細胞懸液，分為對照組、SDF-1處理組、SDF-1+AMD3100處理組和AMD3100處理組：對照組和SDF-1處理組為僅含無血清培養(yǎng)液的細胞懸液，SDF-1+AMD3100處理組和AMD3100處理組的細胞懸液中先加入1 mg/L AMD3100于培養(yǎng)箱孵育30 min。向各組每個小室上室加入100 μL細胞懸液；對照組和AMD3100處理組下室加入500 μL含1%血清的培養(yǎng)液，SDF-1處理組和SDF-1+AMD3100處理組下室加入500 μL含1%血清和100 μg/L SDF-1α的培養(yǎng)液。將含小室的24孔板置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)16 h(遷移試驗)和48 h(侵襲試驗)。培養(yǎng)相應時間后，取出小室，用棉簽輕輕擦去上室面細胞；純甲醇室溫固定下室面細胞15 min，PBS洗2次，棉簽擦干上室面，室溫放置5 min晾干；用結(jié)晶紫染色液染30 min，用雙蒸水洗3次，室溫充分風干；置于顯微鏡下觀察并拍照，計算穿膜細胞數(shù)。實驗獨立重復3次。

3.6MTS實驗 分為對照組、SDF-1處理組、SDF-1+AMD3100處理組和AMD3100處理組，對照組為僅用完全培養(yǎng)液重懸的細胞懸液，SDF-1處理組為含100 μg/L SDF-1α的細胞懸液，SDF-1+AMD3100處理組細胞懸液中先加入1 mg/L AMD3100于培養(yǎng)箱孵育30 min后再加入100 μg/L SDF-1α，AMD3100處理組為含1 mg/L AMD3100的細胞懸液。將PANC-1細胞懸液接種于96孔板，每孔加入200 μL培養(yǎng)液，含1×103個細胞。貼壁生長0 h(種板8 h)、24 h、48 h和72 h后去除培養(yǎng)液，每孔加入100 μL含有10% MTS溶液的DMEM培養(yǎng)液，37 ℃、 5%CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)3 h。以空白組調(diào)零，酶標儀檢測490 nm吸光度(A)值。實驗獨立重復3次。

4 統(tǒng)計學處理

用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件進行分析。數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標準差(mean±SD)表示，多組間比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，組間兩兩比較采用Bonferroni法。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

1 不同胰腺癌細胞株中CXCR4的mRNA表達情況

4種細胞株中均存在CXCR4 mRNA的表達，其中PANC-1細胞株中的表達水平最高，SW1990 細胞株中最低(P<0.05),見圖1,因此，后續(xù)實驗選擇PANC-1細胞為研究對象。

Figure 1.The mRNA levels of CXCR4 in SW1990, BxPc-3, Capan-2 and PANC-1 cells were detected by RT-qPCR. Mean±SD.n=3.*P<0.05，**P<0.01vsSW1990.

圖1胰腺癌細胞株SW1990、BxPc-3、Capan-2和PANC-1中CXCR4mRNA表達水平

2 激活或阻斷CXCR4對PANC-1細胞株遷移和侵襲功能的影響

與對照組相比，100 μg/L SDF-1α組可顯著促進PANC-1細胞遷移和侵襲(P<0.05)；與SDF-1α組相比，預先用1 mg/L AMD3100處理PANC-1細胞后再加入100 μg/L SDF-1α，PANC-1細胞的遷移和侵襲能力顯著降低(P<0.01),與對照組相比無明顯差異，見圖2、表2。

Figure 2.The migration and invasion PANC-1 cells treated with SDF-1α and AMD3100 (×100).

圖2PANC-1細胞株經(jīng)SDF-1α及AMD3100處理后遷移和侵襲能力的變化

表2 每視野遷移和侵襲細胞數(shù)

**P<0.01vscontrol group;##P<0.01vsSDF-1α group.

3 激活或阻斷CXCR4對PANC-1細胞株活力的影響

PANC-1細胞經(jīng)100 μg/L SDF-1α組處理72 h后，吸光度相比對照組增加(P<0.05)，即細胞活力增強；而預先用1 mg/L AMD3100處理PANC-1細胞后再加入100 μg/L SDF-1α以及僅使用1 mg/L AMD3100處理PANC-1細胞，與對照組相比，對PANC-1細胞活力無顯著影響,見圖3。

Figure 3.The MTS absorbance (A) value of PANC-1 cells. Mean±SD.n=3.**P<0.01vscontrol group;##P<0.01vsSDF-1α group.

圖3PANC-1細胞株經(jīng)SDF-1α及AMD3100處理后0h、24h、48h和72h的吸光度值

4 SDF-1α對PANC-1細胞株EMT相關(guān)標志物及EMT誘導轉(zhuǎn)錄因子表達的影響

PANC-1細胞株分別經(jīng)100 μg/L SDF-1α處理12 h、24 h、48 h和72 h后，E-cadherin表達水平在48 h和72 h明顯下降，N-cadherin、vimentin和SNAIL表達水平在12 h～48 h明顯上升，而在72 h時稍升高，綜合各EMT相關(guān)指標，24 h和48 h為SDF-1α最佳作用時間，見圖4A。PANC-1細胞株分別經(jīng)50 μg/L、100 μg/L和200 μg/L SDF-1α處理后，E-cadherin表達水平隨SDF-1α濃度升高而逐漸降低，vimentin、SNAIL和TWIST表達均升高(P<0.01)。綜合各EMT相關(guān)指標，SDF-1α最佳作用濃度為100 μg/L,見圖4B。

5 激活或阻斷CXCR4對PANC-1細胞株EMT相關(guān)標志物及EMT誘導轉(zhuǎn)錄因子表達的影響

PANC-1細胞株經(jīng)100 μg/L SDF-1α處理48 h后，E-cadherin表達水平相比對照組下降，vimentin、SNAIL和TWIST表達水平上升；而經(jīng)100 μg/L SDF-1α+1 mg/L AMD3100和1 mg/L AMD3100分別處理48 h后，E-cadherin、vimentin、SNAIL和TWIST表達水平與對照組無明顯差異，見圖5。

討 論

SDF-1又名CXCL12，屬于CXC趨化因子家族，在多種組織細胞中廣泛表達，對各種成熟和不成熟的造血細胞有顯著趨化作用[5-6]。SDF-1主要有α和β 2種亞型，SDF-1α為優(yōu)勢表型，由骨髓基質(zhì)細胞和內(nèi)皮細胞分泌，幾乎存在于所有器官中，促進組織破壞[7]。CXCR4是一種高度保守的7次跨膜G蛋白偶聯(lián)受體，在許多正常組織中不表達或低表達，而在多種腫瘤包括胰腺癌中高表達[8]，通過與SDF-1α結(jié)合形成SDF-1/CXCR4軸，激活ERK1/2、JNK、Akt、p38 MAPK、GSK-3β等通路，參與腫瘤增殖、轉(zhuǎn)移、血管生成等過程[7, 9-11]。

在本研究中，檢測了4種胰腺癌細胞株中的CXCR4 mRNA表達水平，觀察到低分化的胰腺癌細胞株P(guān)ANC-1相比其它3種細胞株顯著高表達CXCR4 mRNA，這與文獻報道一致[5]，即CXCR4在胰腺癌細胞中的表達水平與細胞惡性程度有關(guān)，CXCR4可能參與胰腺癌細胞的轉(zhuǎn)移。應用PANC-1進行生物學功能實驗，證實SDF-1α能促進高表達CXCR4的PANC-1細胞遷移和侵襲，并增強其活力。研究認為SDF-1/CXCR4軸可激活MAPK、PI3K等通路，介導腫瘤細胞增殖[12]。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)SDF-1可促進PANC-1細胞間充質(zhì)標志物表達上調(diào)，而上皮標志物表達下調(diào)，并伴隨EMT誘導轉(zhuǎn)錄因子SNAIL和TWIST的改變。EMT是細胞形態(tài)由上皮表型向間質(zhì)表型的轉(zhuǎn)化，在此過程中，腫瘤細胞緊密黏附蛋白如E-cadherin蛋白表達下調(diào)，N-cadherin和vimentin等蛋白表達上調(diào)，導致細胞間緊密連接及細胞極性破壞，細胞間黏附減弱，細胞由多邊形變?yōu)樗笮?，運動性增強，遷移和侵襲能力增強。EMT調(diào)控機制復雜，涉及表觀修飾及轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)，EMT誘導轉(zhuǎn)錄因子如SNAIL和TWIST是其中的關(guān)鍵分子，SNAIL主要抑制上皮標志物的表達，而TWIST能誘導間充質(zhì)標志物的表達[13-16]。因而，我們的結(jié)果提示SDF-1/CXCR4軸能通過調(diào)控SNAIL和TWIST而促進PANC-1細胞發(fā)生EMT，進而增強其遷移和侵襲能力。更為重要的是，加入AMD3100后，這種促進作用可被阻斷。AMD3100是一種CXCR4的高度特異性非肽類拮抗劑，可與CXCR4結(jié)合而阻斷SDF-1/CXCR4軸[17]。近年來已有針對該靶點的治療方案在研究中，包括化療藥物聯(lián)合CXCR4拮抗劑[18]、CXCR4抗體[19-20]和AMD3100納米微粒[20]等。

Figure 4.The expression levels of EMT-related markers and EMT-inducing transcription factors. A: PANC-1 cells were treated with 100 μg/L SDF-1α for different hours; B: PANC-1 cells were treated with different concentrations of SDF-1α for 48 h. Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vs0 h or 0 μg/L.

圖4PANC-1細胞株經(jīng)SDF-1α處理后EMT相關(guān)標志物及EMT誘導轉(zhuǎn)錄因子的表達

Figure 5.The expression levels of EMT-related markers and EMT-inducing transcription factors in PANC-1 cells treated with SDF-1α and AMD3100 for 48 h. Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vscontrol group;#P<0.05,##P<0.01vsSDF-1α group.

圖5PANC-1細胞株經(jīng)SDF-1α及AMD3100處理后EMT相關(guān)標志物及EMT誘導轉(zhuǎn)錄因子的表達

綜上所述，SDF-1α/CXCR4軸在胰腺癌侵襲與轉(zhuǎn)移中發(fā)揮了一定作用，有望成為胰腺癌治療的有效靶點。