馬海明， 強(qiáng) 玲， 劉曉康， 張寶軒△

[1廣饒縣人民醫(yī)院腫瘤科， 山東 東營(yíng) 257300； 2山東省腫瘤防治研究院乳腺淋巴瘤科(內(nèi)十科)， 山東 濟(jì)南 250117]

腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)具有廣泛的抗腫瘤作用，而對(duì)于其在腫瘤生物學(xué)中的作用仍然存在爭(zhēng)議。TNF-α是目前常用的腫瘤生物治療因子，其參與生物機(jī)體內(nèi)的炎癥反應(yīng)和細(xì)胞凋亡等過(guò)程[1]。研究報(bào)道顯示，TNF-α可以誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞的凋亡，促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移[2-3]。高遷移率族蛋白B1(high mobility group box-1，HMGB1)能夠調(diào)控細(xì)胞的DNA重組、細(xì)胞自噬和炎性損傷等，并且與腫瘤細(xì)胞的多種生物學(xué)特性有關(guān)，下調(diào)HMGB1表達(dá)可以減弱乳腺癌MCF-7細(xì)胞的侵襲和遷移能力，并誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞凋亡，下調(diào)HMGB1在乳腺癌中發(fā)揮抑制作用[4-5]。本研究擬通過(guò)體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，以乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231為對(duì)象，用小干擾RNA(small interfering RNA, siRNA)敲減乳腺癌細(xì)胞中HMGB1的表達(dá)，探討HMGB1對(duì)TNF-α誘導(dǎo)的乳腺癌細(xì)胞侵襲和遷移能力的影響，為明確HMGB1在免疫微環(huán)境中對(duì)乳腺癌的作用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

材 料 和 方 法

1 主要材料

HMGB1 siRNA和陰性對(duì)照siRNA(siRNA negative control, siRNA-NC)購(gòu)自Abbexa；熒光定量PCR試劑盒購(gòu)自TaKaRa；Lipofectamine 2000購(gòu)自Invitrogen；TNF-α購(gòu)自Peprotech；胰蛋白酶購(gòu)自Amresco；兔抗Bax抗體和兔抗HMGB1抗體購(gòu)自Saierbio；兔抗上皮鈣黏素(E-cadherin)抗體購(gòu)自Novus Biologicals；兔抗基質(zhì)金屬蛋白酶2(matrix metalloprotease 2，MMP-2)抗體、兔抗神經(jīng)鈣黏素(N-cadherin)抗體、兔抗基質(zhì)金屬蛋白酶9(matrix metalloprotease 9，MMP-9)抗體和HRP標(biāo)記的II抗購(gòu)自Santa Cruz；GAPDH引物和HMGB1引物為南京金斯瑞合成；細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自北京索萊寶。

2 方法

2.1細(xì)胞分組處理 乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞(購(gòu)自ATCC，用10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)，0.25%胰蛋白酶?jìng)鞔?分為對(duì)照(control)組、TNF-α組、siRNA-NC+TNF-α組、HMGB1 siRNA+TNF-α組、siRNA-NC組和HMGB1 siRNA組，其中TNF-α組、siRNA-NC+TNF-α組和HMGB1 siRNA+TNF-α組的細(xì)胞于實(shí)驗(yàn)開(kāi)始時(shí)在培養(yǎng)液中添加15 μg/L的TNF-α；HMGB1 siRNA+TNF-α組和HMGB1 siRNA組為轉(zhuǎn)染HMGB1 siRNA后的MDA-MB-231細(xì)胞； siRNA-NC+TNF-α組和siRNA-NC組為轉(zhuǎn)染siRNA-NC后的MDA-MB-231細(xì)胞；control組和TNF-α組為不做轉(zhuǎn)染的MDA-MB-231細(xì)胞；control組細(xì)胞的培養(yǎng)液中不添加TNF-α。MDA-MB-231細(xì)胞轉(zhuǎn)染按照Lipofectamine 2000脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑說(shuō)明書(shū)操作。

2.2實(shí)時(shí)熒光定量PCR測(cè)定HMGB1的mRNA水平 Control組、siRNA-NC組和HMGB1 siRNA組細(xì)胞培養(yǎng)24 h以后收集細(xì)胞，用細(xì)胞總RNA提取試劑盒提取細(xì)胞中的總RNA。用分光光度計(jì)測(cè)定各組樣品中的RNA的濃度。以GAPDH為內(nèi)參照，按照實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒說(shuō)明書(shū)，首先合成cDNA的第一鏈，然后以cDNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR程序?yàn)椋?5 ℃ 10 min; 95 ℃ 15 s、 60 ℃ 60 s, 40個(gè)循環(huán)。用2-ΔΔCt法計(jì)算各組樣品中的HMGB1水平。HMGB1的上游引物序列為5’-GCGAAGAAACTGGGAGAGATGTG-3’，下游引物序列為5’-GCATCAGGTTTCCTTTAGCTCG-3’；GAPDH的上游引物序列為5’-TCATTGACCTCAACTACATGGTTT-3’，下游引物序列為5’-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3’。

2.3Western blot測(cè)定HMGB1蛋白水平 Control組、siRNA-NC組和HMGB1 siRNA組細(xì)胞培養(yǎng)24 h后，加入含PMSF的蛋白裂解液，在冰上放置5 min，使蛋白充分裂解;用細(xì)胞刮刀收集細(xì)胞，轉(zhuǎn)移到離心管中，放在4 ℃的低溫離心機(jī)中，14 000 ×g離心20 min。用BCA法對(duì)各組蛋白樣品進(jìn)行定量檢測(cè)。用10%的分離膠進(jìn)行蛋白電泳，電泳前按照每個(gè)泳道中添加40 μg的樣品將各組蛋白樣品煮沸變性，在濃縮膠中以80 V的電壓電泳，當(dāng)?shù)鞍走M(jìn)入到分離膠以后，用120 V的電壓繼續(xù)電泳至結(jié)束。100 V的條件下，在冰上將凝膠上的蛋白電轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，封閉，與1∶800稀釋后的 I 抗反應(yīng)以后，與1∶3 000稀釋的 II抗結(jié)合，以ECL發(fā)光，用Quantity One對(duì)各自蛋白條帶定量分析(GAPDH為內(nèi)參照)。

2.4流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定細(xì)胞凋亡 Control組、TNF-α組、siRNA-NC+TNF-α組和HMGB1 siRNA+TNF-α組細(xì)胞按照上述方法處理培養(yǎng)24 h后，PBS洗細(xì)胞2次，用胰蛋白酶消化各組細(xì)胞后，收集細(xì)胞沉淀，加入結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞，再依次添加Annexin V-FITC和PI后，把各組細(xì)胞放在避光條件下結(jié)合15 min以后，在1 h內(nèi)上機(jī)檢測(cè)。

2.5Transwell小室法測(cè)定細(xì)胞的侵襲能力 Control組、TNF-α組、siRNA-NC+TNF-α組和HMGB1 siRNA+TNF-α組細(xì)胞按照上述方法處理，用不含血清的培養(yǎng)液把細(xì)胞濃度都調(diào)整為1×108/L，分別吸取500 μL的各組細(xì)胞懸浮液加入基質(zhì)膠濕化以后的Transwell小室的上室，并且在其下室中添加600 μL含有血清的培養(yǎng)液，培養(yǎng)24 h后，乙醇固定、HE染色以后，在400倍的顯微鏡下隨機(jī)選5個(gè)視野對(duì)侵襲細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)。

2.6細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)測(cè)定遷移能力 Control組、TNF-α組、siRNA-NC+TNF-α組和HMGB1 siRNA+TNF-α組細(xì)胞融合度超過(guò)90%以后，按照2.5方法處理，在長(zhǎng)滿(mǎn)的細(xì)胞底上畫(huà)一條細(xì)痕，并用PBS洗滌2次。添加新鮮的細(xì)胞培養(yǎng)液，24 h后，用Image-Pro Plus測(cè)定劃痕的距離，結(jié)果取平均值。以遷移的距離占劃痕初始寬度的百分比表示遷移率。

2.7Western blot測(cè)定E-cadherin、MMP-2、N-cadhe-rin、MMP-9和Bax的蛋白水平 Control組、TNF-α組、siRNA-NC+TNF-α組和HMGB1 siRNA+TNF-α組細(xì)胞按照上述方法處理培養(yǎng)24 h后，用Western blot方法測(cè)定E-cadherin、MMP-2、N-cadherin、MMP-9和Bax蛋白水平,方法同2.3。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均采用SPSS 21.0分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示。多組間差異的比較用單因素方差分析，多重比較均采用SNK-q檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 轉(zhuǎn)染后細(xì)胞中HMGB1的表達(dá)

轉(zhuǎn)染HMGB1 siRNA后，MDA-MB-231細(xì)胞中HMGB1的mRNA和蛋白水平均明顯下降(P<0.05)，而轉(zhuǎn)染siRNA-NC對(duì)乳腺癌細(xì)胞中HMGB1的mRNA和蛋白水平?jīng)]有影響，見(jiàn)圖1。

Figure 1.The expression of HMGB1 at mRNA (A) and protein (B) levels in transfected breast cancer cells determined by RT-qPCR and Western blot. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vssiRNA-NC group.

圖1RT-qPCR和Westernblot測(cè)定轉(zhuǎn)染后的乳腺癌細(xì)胞中HMGB1的表達(dá)水平

2 敲低HMGB1表達(dá)增加TNF-α對(duì)乳腺癌細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)作用

MDA-MB-231細(xì)胞經(jīng)過(guò)TNF-α作用以后，與對(duì)照組相比凋亡率明顯升高(P<0.05)，說(shuō)明TNF-α可以誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞凋亡；轉(zhuǎn)染HMGB1 siRNA后經(jīng)TNF-α處理，細(xì)胞凋亡率更高(P<0.05)，敲減HMGB1表達(dá)和TNF-α刺激可以共同誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞凋亡，見(jiàn)圖2。

3 敲減HMGB1表達(dá)減弱TNF-α對(duì)乳腺癌細(xì)胞侵襲的誘導(dǎo)作用

MDA-MB-231細(xì)胞經(jīng)TNF-α處理后侵襲細(xì)胞的數(shù)目較對(duì)照組明顯增多(P<0.05)，說(shuō)明TNF-α誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞侵襲；轉(zhuǎn)染HMGB1 siRNA后經(jīng)TNF-α誘導(dǎo)的侵襲細(xì)胞數(shù)目減少(P<0.05)，說(shuō)明HMGB1 siRNA可以減弱TNF-α誘導(dǎo)的乳腺癌細(xì)胞的侵襲能力,見(jiàn)圖3。

Figure 2.The apoptosis rate in each group analyzed by flow cytometry. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vssiRNA-NC+TNF-α group.

圖2流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定各組細(xì)胞的凋亡水平

Figure 3.Transwell chamber determination of the invasion ability of breast cancer cells in each group (×200). Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vssiRNA-NC+TNF-α group.

圖3Transwell小室測(cè)定各組乳腺癌細(xì)胞的侵襲能力

4 敲減HMGB1表達(dá)減弱TNF-α對(duì)乳腺癌細(xì)胞遷移的誘導(dǎo)作用

MDA-MB-231細(xì)胞經(jīng)TNF-α處理后的遷移率明顯升高(P<0.05)，說(shuō)明TNF-α誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞遷移；轉(zhuǎn)染HMGB1 siRNA后經(jīng)TNF-α誘導(dǎo)的細(xì)胞遷移率降低(P<0.05)，說(shuō)明HMGB1 siRNA可以降低TNF-α誘導(dǎo)的乳腺癌細(xì)胞的遷移能力，見(jiàn)圖4。

5 敲減HMGB1表達(dá)減弱TNF-α對(duì)乳腺癌細(xì)胞上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)的誘導(dǎo)作用

經(jīng)TNF-α處理后MDA-MB-231細(xì)胞中的上皮細(xì)胞標(biāo)志蛋白E-cadherin表達(dá)下調(diào)，而間充質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志蛋白N-cadherin表達(dá)升高(P<0.05)，提示TNF-α誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞EMT;轉(zhuǎn)染HMGB1 siRNA后經(jīng)TNF-α誘導(dǎo)的細(xì)胞中上皮細(xì)胞標(biāo)志蛋白E-cadherin表達(dá)升高，而間充質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志蛋白N-cadherin表達(dá)降低(P<0.05)，說(shuō)明HMGB1 siRNA可以抑制TNF-α誘導(dǎo)的乳腺癌細(xì)胞EMT，見(jiàn)圖5。

6 敲減HMGB1表達(dá)對(duì)TNF-α作用的乳腺癌細(xì)胞MMP-2、MMP-9和Bax蛋白表達(dá)的影響

MDA-MB-231細(xì)胞經(jīng)TNF-α處理后MMP-2、MMP-9和Bax蛋白的表達(dá)水平升高(P<0.05);轉(zhuǎn)染HMGB1 siRNA后經(jīng)TNF-α處理細(xì)胞中的MMP-2和MMP-9蛋白表達(dá)水平降低，而B(niǎo)ax蛋白表達(dá)水平升高(P<0.05)，說(shuō)明HMGB1 siRNA對(duì)TNF-α處理后的乳腺癌細(xì)胞的作用與MMP-2、MMP-9和Bax蛋白表達(dá)有關(guān)，見(jiàn)圖6。

Figure 4.The migration ability of breast cancer MDA-MB-231 cells in each group detected by cell scratch test (×200). Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vssiRNA-NC+TNF-α group.

圖4細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)測(cè)定各組乳腺癌細(xì)胞的遷移能力

Figure 5.The expression of EMT marker proteins E-cadherin and N-cadherin in breast cancer MDA-MB-231 cells of each group determined by Western blot. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vssiRNA-NC+TNF-α group.

圖5Westernblot測(cè)定各組乳腺癌細(xì)胞中EMT標(biāo)志蛋白E-cadherin和N-cadherin的表達(dá)

Figure 6.The protein expression of MMP-2, MMP-9 and Bax in the breast cancer MDA-MB-231 cells of each group determined by Western blot. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vssiRNA-NC+TNF-α group.

圖6Westernblot測(cè)定各組乳腺癌細(xì)胞中MMP-2、MMP-9和Bax的蛋白水平

討 論

TNF-α是一種主要由免疫細(xì)胞分泌的抗腫瘤因子，其屬于跨膜蛋白，在腸炎、關(guān)節(jié)炎和牛皮癬等自身免疫疾病中具有關(guān)鍵作用[6-7]。腫瘤小鼠模型經(jīng)過(guò)脂多糖或微生物等處理后，TNF-α是主要的免疫反應(yīng)因子，其可以引起炎癥[8-9]。腫瘤的發(fā)生過(guò)程中，混亂的基因表達(dá)和轉(zhuǎn)錄引起腫瘤細(xì)胞對(duì)TNF-α的敏感度增加，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞凋亡增多[10-12]。在多種體外實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，外源性的TNF-α可以促進(jìn)腫瘤的轉(zhuǎn)移，而在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)自身接種TNF-α可以減少黑色素瘤小鼠模型的腫瘤轉(zhuǎn)移[13]。李曉敏等[14]的研究報(bào)道顯示，給予乳腺癌細(xì)胞外源性的TNF-α刺激以后，Transwell小室實(shí)驗(yàn)中的乳腺癌細(xì)胞穿膜數(shù)目增加。侯娟[15]在探討TNF-α對(duì)乳腺癌化療敏感性的研究中發(fā)現(xiàn)，TNF-α可以誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞的凋亡，增加其化療敏感性。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，TNF-α可以誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231的凋亡，促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的侵襲和遷移，這與上述實(shí)驗(yàn)報(bào)道相符。

HMGB1含有一個(gè)可以調(diào)控轉(zhuǎn)錄的C端和2個(gè)可以與DNA結(jié)合的結(jié)構(gòu)域，其能夠與Toll樣受體結(jié)合，調(diào)控多種炎癥因子的釋放[16]。在細(xì)胞受到外界環(huán)境的作用后，HMGB1可以促進(jìn)TNF-α和內(nèi)毒素等的釋放，介導(dǎo)炎性損傷[17]。在肝癌和乳腺癌等多種腫瘤中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)HMGB1過(guò)度表達(dá)，并且可以調(diào)控腫瘤細(xì)胞的凋亡、侵襲和遷移過(guò)程，影響腫瘤細(xì)胞釋放免疫因子[18-20]。Ni 等[4]通過(guò)細(xì)胞轉(zhuǎn)染化學(xué)合成的HMGB1 siRNA構(gòu)建下調(diào)HMGB1的乳腺癌MCF-7細(xì)胞，通過(guò)檢測(cè)HMGB1表達(dá)及細(xì)胞增殖、凋亡和遷移水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，HMGB1沉默抑制人乳腺癌細(xì)胞的侵襲和遷移，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，提示HMGB1沉默可能是一種潛在的治療靶點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)表明，HMGB1敲低后的乳腺癌細(xì)胞經(jīng)過(guò)TNF-α誘導(dǎo)以后，細(xì)胞的凋亡水平進(jìn)一步增加，而細(xì)胞的侵襲和遷移能力下降，這說(shuō)明HMGB1敲低可以與TNF-α共同發(fā)揮抗腫瘤的作用，綜合上述實(shí)驗(yàn)報(bào)道，下調(diào)HMGB1不僅具有抗乳腺癌作用，還能夠與TNF-α協(xié)同共同抑制乳腺癌發(fā)生。

腫瘤細(xì)胞的侵襲、遷移和凋亡等多種生物學(xué)特性都受到細(xì)胞內(nèi)多種蛋白的嚴(yán)格調(diào)控。Bax是Bcl-2家族中的促凋亡蛋白，其在腫瘤組織中表達(dá)下調(diào)，而促進(jìn)其表達(dá)后可以誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡[21-24]。在腫瘤的轉(zhuǎn)移中，腫瘤細(xì)胞能夠降解細(xì)胞外基質(zhì)的蛋白酶，為腫瘤細(xì)胞突破組織屏障提供條件，MMP-2和MMP-9是目前研究發(fā)現(xiàn)的能夠降解細(xì)胞外基質(zhì)的主要蛋白酶，在多種腫瘤組織中表達(dá)升高[25-27]。在腫瘤轉(zhuǎn)移過(guò)程中，腫瘤細(xì)胞的上皮細(xì)胞特性逐漸消失，而間充質(zhì)細(xì)胞特性逐漸增加，這成為腫瘤細(xì)胞的EMT，E-cadherin是上皮細(xì)胞的標(biāo)志性蛋白，而N-cadherin是間充質(zhì)細(xì)胞的標(biāo)志蛋白，E-cadherin在腫瘤組織中表達(dá)下調(diào)，而N-cadherin在腫瘤組織中表達(dá)升高[28-30]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，TNF-α處理后的乳腺癌細(xì)胞中E-cadherin表達(dá)水平下降，N-cadherin表達(dá)水平升高，TNF-α誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞EMT，并且細(xì)胞中的Bax表達(dá)升高，MMP-2和MMP-9水平也升高，而下調(diào)HMGB1可以抑制TNF-α誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞EMT，降低細(xì)胞中MMP-2和MMP-9水平，促進(jìn)Bax的表達(dá)，這提示下調(diào)HMGB1可以通過(guò)調(diào)控細(xì)胞EMT及Bax、MMP-2和MMP-9蛋白表達(dá)影響TNF-α對(duì)乳腺癌細(xì)胞的凋亡、侵襲和遷移的影響。