王晨霄， 王夢秋， 李 思， 馮 穎， 馬 芳， 吳衣論， 王 琳， 馬 學

(1四川大學華西醫(yī)院小兒泌尿外科， 2四川大學華西第二醫(yī)院出生缺陷與相關(guān)婦兒疾病教育部重點實驗室, 3四川大學華西基礎(chǔ)醫(yī)學與法醫(yī)學院, 四川 成都 610041)

前列腺癌是一種發(fā)病隱匿、起病緩、對人體健康造成極大威脅的惡性腫瘤,居我國男性惡性腫瘤發(fā)病率的第6位，雖然其發(fā)病率及死亡率尚不及一些西方國家，但近年來發(fā)病率和死亡率有逐漸上升的趨勢[1]。前列腺癌在我國的篩查和治療技術(shù)也尚未發(fā)展完善[2]。大多數(shù)前列腺癌生長進程緩慢，然而，有些腫瘤細胞可從前列腺擴散到身體的其它部位，尤其是骨骼和淋巴結(jié)，對全身各系統(tǒng)都有不可逆轉(zhuǎn)的損傷。因此對于前列腺癌細胞凋亡和侵襲力的深入研究，有利于進一步了解前列腺癌的致病機制。

唾液酸酶(sialidase;又稱神經(jīng)氨酸酶，neuraminidase，NEU)是一種可以通過水解α-糖苷鍵而切斷唾液酸與糖蛋白或糖脂上糖復合物連接的糖苷酶，廣泛分布在脊椎動物和微生物中，包括病毒、細菌、真菌、支原體和原生動物等[3]。近年來，唾液酸酶在人體中的作用愈發(fā)受到關(guān)注[1]。除了參與調(diào)節(jié)生理過程外，唾液酸酶還與很多疾病的發(fā)生發(fā)展相關(guān)，如參與調(diào)控腫瘤細胞的增殖分化、侵襲轉(zhuǎn)移以及凋亡過程[4]。研究顯示哺乳動物體內(nèi)的唾液酸酶可被分為4種不同的類型，即神經(jīng)氨酸酶1(NEU1)、神經(jīng)氨酸酶2(NEU2)、神經(jīng)氨酸酶3(NEU3)和神經(jīng)氨酸酶4(NEU4)。不同類型的唾液酸酶在腫瘤細胞內(nèi)的分布和功能不盡相同，它們在亞細胞定位、酶學性質(zhì)及染色體定位上有不同，并以組織特有的方式表達[5]。NEU3定位于細胞的漿膜上，調(diào)節(jié)細胞凋亡和神經(jīng)分化。在結(jié)腸癌等腫瘤細胞中，NEU3的表達明顯上調(diào)[6]，而這種異常增加與腫瘤細胞的生物學行為密切相關(guān)。已知的研究表明，在一些細胞中，NEU3可以增強細胞的增殖能力，增強腫瘤細胞的侵襲能力，抑制細胞凋亡，其它3種唾液酸酶的作用則與之相反[4]。因此，NEU3可能是腫瘤起始、促進和進展一個顯著的決定因素，是治療的一個潛在靶點。然而有關(guān)前列腺癌發(fā)生發(fā)展中，唾液酸酶，尤其是NEU3的作用還未見報道。本文以人前列腺癌DU145細胞為研究對象，探討NEU3與人前列腺癌DU145細胞的活力、侵襲和凋亡的關(guān)系。

材 料 和 方 法

1 實驗試劑

人前列腺癌細胞系DU145購自上海博谷生物科技有限公司。DMEM、Opti-MEM和MEM培養(yǎng)基(Gibco)；胎牛血清(ScienCell)；胰蛋白酶(Invitrogen)；2-脫氧-2， 3-二脫氫-N-乙酰神經(jīng)氨酸(2-deoxy-2, 3-didehydro-N-acetylneuraminic acid，DANA; Santa Cruz Biotechnology)；siRNA(銳博生物)；Lipofectamine 3000(Thermo Fisher Scientific)；TRIzol(Life Technologies)；CCK-8和凋亡檢測試劑盒(Dojindo)；抗NEU3兔單克隆抗體、抗基質(zhì)金屬蛋白酶2(matrix metalloproteinase 2，MMP2)鼠單克隆抗體和抗凋亡抑制因子Bcl-2兔單克隆抗體(Zen BioScience)；HRP化學發(fā)光底物、Transwell小室和Matrigel(Millipore)；絲裂霉素(Sigma)；hBcl-2和hNEU3引物(成都擎科梓熙生物技術(shù)公司)；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(TaKaRa)。

2 實驗方法

2.1細胞培養(yǎng)與分組處理 DU145細胞在含10% 胎牛血清的DMEM完全培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培養(yǎng)箱恒溫37 ℃，含5% CO2，飽和濕度。每日觀察細胞生長情況，1～2 d換液，待細胞長滿至6孔板80%(1.5×105個)左右傳代，取生長狀態(tài)良好的對數(shù)生長期細胞進行實驗。分為空白對照(blank)組、DANA組和siRNA組,空白對照組用正常培養(yǎng)基培養(yǎng)，DANA組用含1 mmol/L DANA的培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h， siRNA組加入NEU3 siRNA轉(zhuǎn)染處理。

2.2RNA干擾靶向沉默NEU3 配制siRNA組培養(yǎng)基：siRNA組培養(yǎng)基每100 μL含siRNA(50 nmol/L) 0.25 μL、Buffer(v2)6 μL、Lipofectamine 3000 0.3 μL、Opti-MEM 5.95 μL和MEM培養(yǎng)基87.5 μL。前后搖動細胞板混合均勻，37 ℃孵育24 h。

2.3CCK-8法檢測細胞活力 各組細胞培養(yǎng)于96孔板中，加藥處理48 h后，每孔加CCK-8 10 μL，37 ℃避光孵育1～4 h。酶標儀450 nm波長下測定吸光度(A)值，其中每個樣品設(shè)3復孔。根據(jù)公式繪制出標準曲線,計算出各組細胞的活力。

2.4Western blot法檢測NEU3、MMP2和Bcl-2蛋白的表達水平 BCA法測蛋白濃度，將蛋白樣本與5×Loading Buffer以4∶1的比例配制上樣終液，95 ℃變性5 min，配膠(10%分離膠，5%濃縮膠)后進行SDS-PAGE分離(80～100 V，2 h)，恒壓(70 V，30 min)轉(zhuǎn)膜后將PVDF膜夾至封閉液(5%脫脂牛奶)中，室溫封閉1 h。加入 I 抗，4 ℃搖床過夜?；厥?I 抗，然后TBST搖動洗膜4次，每次10 min。然后在低速搖床上進行 II 抗孵育1 h，TBST搖動洗膜4次，每次10 min。發(fā)光底物按1∶1的比例配制，加入有膜的孵育盒，吹打1 min后，轉(zhuǎn)移到濕潤保鮮膜上。用膠帶粘于暗盒中進行曝光。Western blot結(jié)果應用ImageJ軟件進行灰度分析。

2.5Transwell法檢測細胞侵襲能力 Transwell小室放入24孔板中，在小室內(nèi)鋪上用PBS 1∶8稀釋的Matrigel(50 mg/L)，細胞用絲裂霉素處理30 min后消化細胞，細胞計數(shù),鋪板于小室內(nèi),每孔1.5×104個細胞,小室內(nèi)無血清培養(yǎng)基，24孔板為30%血清培養(yǎng)基，37 ℃孵育48 h(干擾表達實驗)或24 h(過表達實驗)后，4%多聚甲醛室溫固定10 min，PBS清洗數(shù)次，結(jié)晶紫染色5 min，PBS清洗后，使用Nickon EclipseTi-U顯微鏡拍照。

2.6qPCR法檢測2種處理方式對凋亡蛋白Bcl-2 mRNA水平的影響 參照TRIzol說明書提取細胞總RNA，隨后DNA酶處理去除DNA的影響。逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA。程序為： 37 ℃ 15 min、85 ℃ 5 s、4 ℃ 保存。合成引物進行qPCR擴增，hNEU3的上游引物序列為5’-AATGTGAAGTGGCAGAGGTGA-3’，下游引物序列為5’-TCACAGAGCTGTCGACTCAGG-3’；hBcl-2的上游引物序列為5’-GGTGGGGTCATGTGTGTGG-3’，下游引物序列為5’-CGGTTCAGGTACTCAGTCATCC-3’;hGAPDH的上游引物序列為5’-AACTTTGGTATCGTGGAAGG-3’,下游引物序列為5’-GCCAGTAGAGGCAGGGATGA-3’。用cDNA作為模板，采用SYBR染料熒光標記，Life 7500定量PCR儀檢測。

2.7流式細胞術(shù)檢測2種處理方式對細胞凋亡水平的影響 用PBS洗細胞2次，胰蛋白酶消化細胞，1 000 r/min離心3 min，棄上清。加入PBS后1 000 r/min離心3 min，重復1次后加入1×Annexin V Binding Solution，制成終濃度為1×109/L的細胞懸液。在EP管中加入細胞懸液5 μL和Annexin V-FITC，再加入5 μL的PI Solution。室溫下避光培養(yǎng)15 min，加入500 μL 1×Annexin V Binding Solution，1 h內(nèi)上流式細胞儀檢測。

3 統(tǒng)計學處理

所有實驗均重復3 次，實驗數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差(mean±SD)表示，使用Prism 6 制圖和進行數(shù)據(jù)分析。多組間比較應用單因素方差分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

1 DANA處理和NEU3沉默后對人前列腺癌DU145細胞NEU3表達的影響

DANA處理和轉(zhuǎn)染NEU3 siRNA后，用Western blot法檢測DU145細胞中NEU3蛋白的表達，結(jié)果顯示，DANA處理前后NEU3蛋白水平變化差異無統(tǒng)計學顯著性，而siRNA轉(zhuǎn)染后，NEU3蛋白的表達量明顯下降(P<0.01)，見圖1。因為DANA是在胞外結(jié)合蛋白達到抑制效果，不會減少蛋白數(shù)量，而siRNA的原理是干擾蛋白表達，故此結(jié)果可說明實驗的轉(zhuǎn)染效果較好。

Figure 1.The effects of DANA andNEU3 silencing on the protein level of NEU3 in the prostate cancer DU145 cells. Mean±SD.n=3.**P<0.01vsblank group.

圖1DANA和NEU3沉默對前列腺癌DU145細胞NEU3蛋白水平的影響

2 DANA處理和NEU3沉默對DU145細胞活力的影響

采取CCK-8法分別觀察DANA處理和NEU3沉默處理后DU145細胞活力的變化，結(jié)果顯示DANA處理與NEU3沉默后細胞活力均增加，且沉默后細胞活力的增加趨勢更加顯著，兩處理組與空白對照組相比差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05或P<0.01)，見圖2。

Figure 2.The effects of DANA andNEU3 silencing on the viability of prostate cancer DU145 cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vsblank group.

圖2DANA和NEU3沉默對前列腺癌DU145細胞活力的影響

3 DANA處理和NEU3沉默對DU145細胞MMP2表達的影響

根據(jù)Western blot結(jié)果，與空白對照組相比，DANA處理后DU145細胞的MMP2表達下降(P<0.05)，NEU3 siRNA處理對MMP2蛋白表達的影響差異無統(tǒng)計學顯著性，見圖3。

Figure 3.The effects of DANA andNEU3 silencing on the protein level of MMP2 in the prostate cancer DU145 cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsblank group.

圖3DANA和NEU3沉默對前列腺癌DU145細胞MMP2蛋白水平的影響

4 DANA處理和NEU3沉默對DU145細胞侵襲能力的影響

用Transwell實驗檢測DU145細胞的侵襲能力，與空白對照組相比，用DANA處理后的DU145細胞侵襲力明顯降低(P<0.01)；NEU3 siRNA處理后細胞侵襲力稍有降低，但差異并無統(tǒng)計學顯著性，說明抑制NEU3活性可以抑制細胞侵襲，而抑制NEU3表達則對細胞的侵襲無明顯影響，見圖4。

Figure 4.The effects of DANA andNEU3 silencing on the invasion ability of prostate cancer DU145 cells (×200). Mean±SD.n=3.**P<0.01vsblank group.

圖4檢測DANA和NEU3沉默對前列腺癌DU145細胞侵襲能力的影響

5 DANA處理和NEU3沉默對DU145細胞凋亡能力的影響

Annexin V-FITC/PI雙染標記后采取流式細胞術(shù)檢測各組的前列腺癌細胞凋亡水平,DANA處理后細胞的凋亡水平無明顯變化，而經(jīng)過siRNA處理后細胞凋亡比例明顯升高(P<0.05)，見圖5。

Figure 5.The effects of DANA andNEU3 silencing on the apoptosis of prostate cancer DU145 cells analyzed by flow cytometry. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsblank group.

圖5DANA和NEU3沉默對前列腺癌DU145細胞凋亡水平的影響

6 DANA處理和NEU3沉默對DU145細胞Bcl-2 mRNA和蛋白水平的影響

應用qPCR方法檢測Bcl-2的mRNA水平,DANA處理和RNA干擾后Bcl-2 的mRNA水平均有下降趨勢，且DANA處理組更顯著(P<0.05)。與空白對照組相比，DANA處理后DU145細胞Bcl-2蛋白表達受到明顯抑制,NEU3 siRNA處理對Bcl-2蛋白的表達有下調(diào)作用(P<0.05)，與qPCR結(jié)果一致，見圖6。

討 論

Figure 6.The effects of DANA andNEU3 silencing on the expression of Bcl-2 at mRNA and protein levels in the prostate cancer DU145 cells. A: the mRNA expression of Bcl-2 was detected by qPCR; B: the protein expression of Bcl-2 was determined by Western blot. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsblank group.

圖6DANA和NEU3沉默對前列腺癌DU145細胞Bcl-2mRNA和蛋白水平的影響

作為一種遺傳因素和環(huán)境因素共同作用的復雜疾病，腫瘤的確切病因及致病過程還不甚明朗。目前針對腫瘤致病機理的研究多集中在基因水平，癌基因的激活或者抑癌基因的失活以及其它相關(guān)調(diào)節(jié)基因的突變等均是目前研究的焦點[7]。隨著人們對生命科學的認識不斷深入，糖與人體各種生理和病理過程，特別是腫瘤的相關(guān)性越來越受到關(guān)注。有關(guān)非小細胞肺癌細胞的研究顯示，NEU3可通過表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor，EGFR)直接作用于細胞外信號調(diào)節(jié)激酶(extracellular signal-regulated kinase，ERK)通路，并且在Akt途徑上對EGFR起作用[8]；在患頭頸部鱗狀細胞癌的患者體內(nèi)，腫瘤組織中的NEU3含量相較正常組織中明顯上調(diào)，并且MMP9表達增高，提示NEU3提高了頭頸部鱗狀細胞癌細胞的活性與侵襲力[9]; NEU3作為神經(jīng)節(jié)苷脂的關(guān)鍵調(diào)節(jié)分子，通過調(diào)控Wnt信號通路，與結(jié)腸癌的癌變過程有關(guān)。研究顯示，NEU3在受體水平調(diào)節(jié)Wnt信號通路，可能在結(jié)腸癌細胞干細胞特性的維持過程中發(fā)揮重要作用，對Ras/絲裂原激活蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase， MAPK)通路的信號調(diào)節(jié)可能與腫瘤侵襲水平相關(guān)[10];關(guān)于HeLa細胞外泌體(exosome)的研究顯示，NEU3通過調(diào)節(jié)負電荷和改變糖蛋白的位阻，提高HeLa細胞exosome的動力生物學特性，因此，exosome表面的NEU3有望成為exosome的檢驗標志物之一，并且作為細胞間信息與物質(zhì)傳遞的重要載體，exosome在生理、病理過程中發(fā)揮的作用尚不明確，NEU3可以成為進一步研究exosome的有力工具[11]。

腫瘤之所以對人體有著極大的威脅，與其侵襲能力強及凋亡受抑制等特性有著密不可分的關(guān)系，故本次實驗將焦點放在NEU3對前列腺癌細胞活力、侵襲及凋亡等生物學行為的影響上。從目前關(guān)于NEU3與腫瘤細胞的研究看來，不同部位、不同來源的腫瘤細胞似乎對NEU3的反應不盡相同。本次實驗采用DANA處理和siRNA沉默NEU3，采用CCK-8法檢測細胞活力，Transwell方法檢測細胞侵襲能力，qPCR方法檢測Bcl-2的mRNA水平，流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡水平，Western blot方法檢測細胞凋亡抑制蛋白Bcl-2和MMP2的蛋白表達水平，結(jié)果顯示siRNA組細胞活力增強，Bcl-2的mRNA和蛋白表達均減少，而侵襲能力和MMP2水平無變化。根據(jù)結(jié)果推測，NEU3可以減弱前列腺癌細胞的活力，抑制凋亡能力，而對侵襲能力沒有明顯的影響，這與基于其它腫瘤細胞的實驗結(jié)果不完全相同，原因可能與實驗選取的細胞株特性有關(guān)，也可能與NEU1、NEU2、NEU3和NEU4 4種唾液酸酶的相互作用有關(guān)。DANA可以同時抑制4種唾液酸酶的酶活性[12]，通過與DANA處理后的結(jié)果對比發(fā)現(xiàn)，抑制唾液酸酶活性可以抑制DU145細胞的侵襲力，這說明唾液酸酶在腫瘤的侵襲過程中也發(fā)揮著重要作用，但其中主導的不是NEU3。其它3種唾液酸酶與腫瘤侵襲能力的關(guān)系仍需進一步探索。對于細胞活力，單獨抑制NEU3和抑制總的唾液酸酶活性趨勢一致，說明NEU3在影響前列腺癌活力的過程中，可能在4種唾液酸酶中起主要作用。根據(jù)流式細胞術(shù)的檢測結(jié)果，NEU3沉默后前列腺癌細胞的凋亡水平上升，而同時抑制4種唾液酸酶的活性時無明顯變化，顯示NEU3在細胞的凋亡過程中起抑制作用，而NEU1、NEU2和NEU4的整體效果與NEU3相反，因此4種唾液酸酶同時作用時對凋亡的影響不明顯。而后，我們針對凋亡通路進行了初步探究，腫瘤細胞凋亡抑制蛋白Bcl-2的表達在DANA和NEU3沉默后均明顯下降，這與流式細胞術(shù)的結(jié)果不完全相符。造成此結(jié)果的原因可能是外源性細胞凋亡途徑或內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激凋亡途徑等不同通路的相互作用，具體機制仍需進一步進行探究。

哺乳動物的唾液酸酶在各種細胞功能中的作用在很大程度上仍未被探索，部分原因是相對于其它蛋白質(zhì)的低表達水平和內(nèi)源性唾液酸酶的不穩(wěn)定性[13]，例如，除了最高度表達的NEU1形式外[14]，甚至所有的生理亞細胞定位都尚不清楚。雖然通過cDNA的轉(zhuǎn)染研究提供了亞細胞位點的證據(jù)，但重組蛋白的過度表達通常會導致人工干預的失敗。因此，進一步明確唾液酸酶的性質(zhì)與功能，闡明其與腫瘤的關(guān)系，具有繼續(xù)探究的必要性與可行性。