劉 麗， 羅廣軒， 林健琳， 關(guān)燕清， 劉文曉， 肖 鵬， 李楚華

(華南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院， 廣東 廣州 510631)

帕金森病(Parkinson disease, PD)是一種常見的神經(jīng)系統(tǒng)退行性變性疾病，為世界第二大神經(jīng)性疾病[1-2]。目前，全球大約有0.3%的人口患有PD，在我國，65歲以上人群中PD發(fā)病率高達(dá)2%，占全球患者總數(shù)40%以上[3-4]。PD主要的病理特征是黑質(zhì)(substantia nigra, SN)內(nèi)多巴胺(dopamine, DA)能神經(jīng)元變性和凋亡，導(dǎo)致DA釋放不足，最終造成PD的多種功能障礙[2, 4-6]。目前，PD的發(fā)病機(jī)制并不明確，主流的學(xué)說認(rèn)為PD是由神經(jīng)炎癥、氧化應(yīng)激、興奮性毒性損害和線粒體功能障礙等導(dǎo)致的，也可能是多種因素的綜合作用[7-9]。眾所周知，PD主要的臨床表現(xiàn)為動(dòng)作遲緩、姿勢不穩(wěn)及震顫等運(yùn)動(dòng)性功能障礙[2,10]，隨著病情的不斷發(fā)展，PD一些非運(yùn)動(dòng)功能障礙，如睡眠障礙、焦慮、抑郁以及認(rèn)知障礙等也日益凸顯[2,11-12]。

蟲草素(cordycepin)又稱3’-脫氧腺苷，為冬蟲夏草及人工蛹蟲草的活性成分，具有抗炎癥、抗氧化和抗腫瘤等功效[13-14]。在PD的細(xì)胞模型中，蟲草素通過增強(qiáng)細(xì)胞的抗氧化能力，從而起到保護(hù)細(xì)胞的作用[15]。另外，在對(duì)于PD的新藥研究中發(fā)現(xiàn)，拮抗腺苷A2A受體(adenosine A2Areceptor, A2AR)可以緩解PD的癥狀，A2AR的選擇性拮抗劑結(jié)合左旋多巴的治療方案已進(jìn)入臨床試驗(yàn)的第3階段[16]。在動(dòng)物模型中，A2AR拮抗劑不僅減輕模型動(dòng)物運(yùn)動(dòng)障礙，還可以逆轉(zhuǎn)認(rèn)知功能障礙[17-19]。作為一種腺苷類似物，蟲草素在體外及體內(nèi)的研究均表現(xiàn)具有調(diào)節(jié)A2AR表達(dá)的作用[19-20]。因而本文希望通過探究蟲草素對(duì)PD小鼠運(yùn)動(dòng)、情緒和認(rèn)知等行為的影響為PD的治療提供一種新的思路。

材 料 和 方 法

1 動(dòng)物

8周齡SPF級(jí)健康雄性C57BL/6小鼠，購于中山醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，合格證編號(hào)：SCXK(粵)2016-0029。飼養(yǎng)溫度(24±2) ℃，自然光照，給予充足的飲水和食物，進(jìn)行1周的適應(yīng)性飼養(yǎng)。

2 主要試劑

蟲草素由華南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院植物化學(xué)研究室提供，純度≥98%[21]；1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氫吡啶(1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine, MPTP)購自Sigma;抗酪氨酸羥化酶(tyrosine hydroxylase, TH)抗體購自Abcam；其它化學(xué)試劑均購自碧云天生物公司。

3 主要方法

3.1帕金森小鼠模型的建立及分組處理 將小鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照(control)組、模型(MPTP)組及蟲草素(cordycepin)組，每組20只。Cordycepin組提前7 d給予口服蟲草素溶液(20 mg/kg，共15 d)；control組和MPTP組每天以同體積的生理鹽水灌胃。自灌胃的第8天起，MPTP組和cordycepin組開始腹腔注射MPTP溶液(30 mg/kg，連續(xù)8 d)，建立PD小鼠模型，control組每天腹腔注射同體積的生理鹽水。

3.2HE染色 將動(dòng)物麻醉之后，快速打開胸腔并剪開心包，自心尖部插入針頭，使其進(jìn)入升主動(dòng)脈，剪開右心耳，生理鹽水進(jìn)行灌流20 min，待肝臟變白后，緩慢灌注4%多聚甲醛固定30 min。固定完畢后，開顱取腦浸泡于新配制的4%多聚甲醛中固定24 h。常規(guī)脫水、透明、進(jìn)蠟，石蠟包埋制作腦組織蠟塊標(biāo)本。石蠟切片，每張蠟?zāi)さ暮穸葹? μm, 進(jìn)行HE染色，光鏡下觀察黑質(zhì)致密部(substantia nigra pars compacta,SNpc)細(xì)胞神態(tài)和數(shù)目變化[22]。

3.3Western blot 小鼠迅速斷頭取出腦組織，利用腦模具分離出SN組織，加入強(qiáng)RIPA細(xì)胞裂解液和蛋白酶抑制劑進(jìn)行裂解，4 ℃、12 000 rpm離心10 min后，提取總蛋白，并采用BCA法進(jìn)行蛋白定量。用12% SDS-PAGE分離蛋白并轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素膜后，5%的牛奶封閉液室溫封閉90 min，加入抗TH抗體(1∶2 500，Abcam)和抗α-tubulin抗體(1∶1 000，碧云天)4 ℃孵育過夜。次日，反復(fù)洗膜3次后，辣根過氧化物酶偶聯(lián)的Ⅱ抗(1∶1 000)室溫孵育1.5 h，化學(xué)發(fā)光法顯影，掃描。用圖像處理系統(tǒng)對(duì)條帶灰度進(jìn)行分析，以α-tubulin作為內(nèi)參照。

3.4曠場實(shí)驗(yàn)(open-field test, OFT) 曠場實(shí)驗(yàn)測試前，小鼠放置在原鼠籠中，在曠場實(shí)驗(yàn)箱所在的室內(nèi)適應(yīng)環(huán)境30 min。正式記錄前，用75%乙醇清潔測試區(qū)域，待氣味散去，每只小鼠放置在獨(dú)立曠場測試區(qū)(40 cm×40 cm×37 cm)進(jìn)行測試，錄像15 min，記錄小鼠運(yùn)動(dòng)軌跡，并利用分析軟件分析中間區(qū)域活動(dòng)時(shí)間和時(shí)間路程、速度以及總路程等實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

3.5自發(fā)交替行為(spontaneous alternation beha-vior, SAB) 自發(fā)交替行為測試全程保持黑暗，利用Y-maze裝置進(jìn)行自發(fā)交替評(píng)估探索和空間記憶能力。小鼠在原鼠籠進(jìn)行30 min的暗適應(yīng)后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。明確標(biāo)記Y-maze外側(cè)三臂為“Ⅰ”“Ⅱ”和“Ⅲ”后，將小鼠放進(jìn)Y-maze的任一壁中，閉合各臂上方擋板，開始觀察并記錄小鼠在Y-maze中的活動(dòng)情況。每只鼠測試1次，每次進(jìn)行10 min，記錄小鼠進(jìn)入不同壁的順序，統(tǒng)計(jì)小鼠總進(jìn)臂次數(shù)及正確率。

3.6水迷宮實(shí)驗(yàn)(water maze test, WMT) 水迷宮測試是用于測試實(shí)驗(yàn)動(dòng)物對(duì)空間位置感和空間定位的學(xué)習(xí)記憶能力。定位航行試驗(yàn)歷時(shí)5 d，每天將小鼠面向池壁分別從4個(gè)不同的入水點(diǎn)放入水中各1次，記錄其尋找到隱藏在水面下平臺(tái)的時(shí)間，記為潛伏期。在每日的測試中，每次的入水位置都是隨機(jī)的，若小鼠在60 s內(nèi)未找到平臺(tái)，實(shí)驗(yàn)者需引導(dǎo)其至平臺(tái)并停留15 s，并記其潛伏期為60 s。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 17.0對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤(mean±SEM)表示。多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用Bonferroni校正的t檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 蟲草素增加PD小鼠黑質(zhì)致密部細(xì)胞數(shù)目

HE染色結(jié)果示,control組小鼠的SNpc細(xì)胞形態(tài)正常，細(xì)胞數(shù)目明顯多于MPTP組(P<0.05);而MPTP組小鼠SNpc內(nèi)細(xì)胞胞體小，核變大，輪廓模糊;蟲草素可以明顯增多細(xì)胞數(shù)目(P<0.05)，說明蟲草素可以阻止由MPTP所造成的SNpc細(xì)胞數(shù)目減少，見圖1。

Figure 1.Cordycepin increased the number of cells in the SNpc in PD mice (HE staining, ×200). Mean±SEM.n=10.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsMPTP group.

圖1蟲草素增加PD小鼠黑質(zhì)致密部細(xì)胞數(shù)目

2 蟲草素提高PD小鼠黑質(zhì)內(nèi)TH的表達(dá)量

MPTP導(dǎo)致小鼠SN內(nèi)TH的表達(dá)量明顯減少(P<0.05)，而蟲草素可以明顯逆轉(zhuǎn)TH表達(dá)量減少的趨勢(P<0.05)，見圖2，說明蟲草素對(duì)SN內(nèi)的多巴胺能神經(jīng)元有保護(hù)作用，減少M(fèi)PTP的毒害。

3 蟲草素減輕PD小鼠的運(yùn)動(dòng)遲緩

與control組相比，MPTP組小鼠的平均速度明顯降低(P<0.05)，中央?yún)^(qū)域路程減少，但并沒有顯著差異，說明MPTP導(dǎo)致小鼠出現(xiàn)運(yùn)動(dòng)遲緩，但并不引起焦慮行為；而蟲草素顯著提高小鼠的運(yùn)動(dòng)速度(P<0.05)，但并不影響小鼠在中央?yún)^(qū)域路程，說明蟲草素可以改善短期PD小鼠的運(yùn)動(dòng)異常，見圖3。

Figure 2.Cordycepin increased the expression of TH in SN in PD mice. Mean±SEM.n=3.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsMPTP group.

圖2蟲草素提高PD小鼠黑質(zhì)內(nèi)TH蛋白表達(dá)量

4 蟲草素提高PD小鼠探索和空間記憶能力

與control組相比，MPTP導(dǎo)致小鼠總進(jìn)臂次數(shù)和正確率都明顯減少(P<0.05)，說明MPTP導(dǎo)致小鼠的探索能力和空間記憶能力出現(xiàn)障礙;蟲草素能夠增加小鼠的總進(jìn)臂次數(shù)并提高正確率(P<0.05)，說明蟲草素改善PD小鼠的探索和空間記憶能力障礙，見圖4。

5 蟲草素不影響PD小鼠學(xué)習(xí)記憶行為

與control組相比，MPTP組小鼠的潛伏期有延長，但沒有顯著差異;蟲草素可以縮短由MPTP引起的潛伏期延長，但也沒有顯著差異;說明本研究所模擬的PD小鼠模型更適用于研究PD早期的癥狀，并沒有出現(xiàn)學(xué)習(xí)記憶能力的障礙，見圖5。

討 論

PD最明顯的特征是SN內(nèi)多巴胺能神經(jīng)元的壞死，TH是兒茶酚胺合成過程中的限速酶，SN中TH陽性神經(jīng)元大多是多巴胺能的，因此TH可以看作是SN中多巴胺能神經(jīng)元的標(biāo)志物，SN內(nèi)TH表達(dá)含量成為檢測PD模型的一大指標(biāo)[23]。Deguil等[24]使用30 mg/kg MPTP連續(xù)腹腔注射5 d，發(fā)現(xiàn)小鼠SN內(nèi)的TH陽性神經(jīng)元急劇減少。在本研究中，采用30 mg/kg的MPTP 連續(xù)注射8 d，HE染色結(jié)果顯示，MPTP導(dǎo)致小鼠SNpc內(nèi)細(xì)胞數(shù)目明顯減少，Western blot結(jié)果也顯示SN內(nèi)TH表達(dá)量明顯降低，表明MPTP導(dǎo)致小鼠出現(xiàn)PD樣的病理特征。

Figure 3.Cordycepin attenuated bradykinesia in PD mice. Mean±SEM.n=20.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsMPTP group.

圖3蟲草素減輕PD小鼠的運(yùn)動(dòng)遲緩

Figure 4.Cordycepin improved the explorative ability in PD mice. Mean±SEM.n=20.*P<0.05,**P<0.01vscontrol group;#P<0.05vsMPTP group.

圖4蟲草素改善PD小鼠的探索及空間記憶能力

在PD的細(xì)胞模型中，蟲草素通過提高細(xì)胞內(nèi)氧化酶的活性有效抑制由6-OH多巴胺引起的細(xì)胞凋亡，發(fā)揮保護(hù)細(xì)胞的作用[15]。陳琴等[25]也發(fā)現(xiàn)，蟲草素可以顯著抑制魚藤酮誘導(dǎo)的的細(xì)胞凋亡。另外，蟲草素對(duì)魚藤酮引起的PD大鼠多巴胺能神經(jīng)元凋亡具有抑制作用[26]。在本實(shí)驗(yàn)中，蟲草素同樣逆轉(zhuǎn)了MPTP引起的SNpc內(nèi)的細(xì)胞數(shù)目減少和SN內(nèi)TH表達(dá)量降低的現(xiàn)象，表明蟲草素可以減少M(fèi)PTP對(duì)SN內(nèi)多巴胺能神經(jīng)元的損傷，在PD小鼠中發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。

PD患者最明顯的臨床表現(xiàn)為出現(xiàn)嚴(yán)重的運(yùn)動(dòng)功能障礙，并隨著病情的加劇，萎靡不振、焦慮以及認(rèn)知障礙等非運(yùn)動(dòng)功能障礙越加明顯[11-12]。蟲草素對(duì)PD小鼠具有神經(jīng)保護(hù)作用，那能否在行為上表現(xiàn)出來？OFT是用于評(píng)價(jià)小鼠自發(fā)行為以及焦慮狀態(tài)的經(jīng)典行為學(xué)實(shí)驗(yàn)[27]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示蟲草素改善由MPTP引起的平均速度減慢，總路程減少，但小鼠并沒有出現(xiàn)焦慮現(xiàn)象，表明蟲草素可以改善PD小鼠的運(yùn)動(dòng)遲緩癥狀。SAB實(shí)驗(yàn)檢測小鼠對(duì)新異環(huán)境的探索能力以及空間記憶能力[28]，蟲草素增加小鼠的總進(jìn)臂次數(shù)，并提高其正確率，表明蟲草素可以增強(qiáng)PD小鼠的探索和空間記憶能力。WMT檢測實(shí)驗(yàn)動(dòng)物對(duì)空間位置感和方向感的學(xué)習(xí)記憶能力[29-30]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，MPTP雖使小鼠的潛伏期增加，但是并沒有顯著差異，蟲草素雖有一定的改善作用，但也并不明顯。此結(jié)果表明，本實(shí)驗(yàn)所模擬的PD小鼠模型可能更多地接近PD患者的早期癥狀，表現(xiàn)出運(yùn)動(dòng)和探索能力下降，但并沒有出現(xiàn)焦慮和學(xué)習(xí)記憶能力的缺陷，說明此模型并不適用于研究PD患者后期的各種非運(yùn)動(dòng)障礙，例如焦慮和記憶障礙等。

Figure 5.Cordycepin had no effect on the ability of learning and memory in PD mice. Mean±SEM.n=12.

圖5蟲草素不影響PD小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力

綜上所述，我們發(fā)現(xiàn)MPTP處理導(dǎo)致小鼠SN內(nèi)多巴胺能神經(jīng)元丟失，并表現(xiàn)出PD早期的運(yùn)動(dòng)障礙和探索能力下降，而蟲草素處理后，可以明顯減輕這種癥狀，說明蟲草素對(duì)PD小鼠具有神經(jīng)保護(hù)作用，并能在運(yùn)動(dòng)和探索能力上顯現(xiàn)出來。