湯 雷， 謝汝佳， 鄭 璐， 田 甜， 余 蕾， 胡曉霞， 蔡 爽， 馬子華， 楊 勤△， 韓 冰△

(貴州醫(yī)科大學(xué) 1病理生理學(xué)教研室， 貴州省常見慢性疾病發(fā)病機(jī)制及藥物研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 2生理學(xué)教研室， 貴州 貴陽 550000)

砷(arsenic)是一種嚴(yán)重危害人類健康的環(huán)境毒物和已知的人類致癌物，可造成包括肝臟在內(nèi)的多個(gè)器官功能損傷[1]。在砷中毒致肝損傷的機(jī)制中，砷及其化合物可以引發(fā)細(xì)胞凋亡是目前較公認(rèn)的觀點(diǎn)[2]。本研究前期發(fā)現(xiàn)砷可通過介導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(endoplasmic reticulum stress，ERS)，促進(jìn)肝細(xì)胞凋亡[3]。SET7也稱為SET9(SET domain containing 7/9，SET7/9)，屬于組蛋白賴氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶家族成員，它含有催化結(jié)構(gòu)域SET結(jié)構(gòu)域，對調(diào)節(jié)多種細(xì)胞因子的功能起著重要作用[4-6]。有學(xué)者研究還發(fā)現(xiàn)，在糖尿病腎病小鼠的腎臟組織中葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78(glucose-regulated protein 78，GRP78)和SET7/9表達(dá)與對照組相比都明顯升高，提示SET7/9和ERS可能存在著聯(lián)系[7]。本研究旨在探討SET7/9可能通過ERS介導(dǎo)砷致肝細(xì)胞凋亡的機(jī)制。

材 料 和 方 法

1 細(xì)胞和主要試劑

正常肝細(xì)胞系LO2(中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏中心上海細(xì)胞庫)。DMEM培養(yǎng)基購自Gibco；胎牛血清購自HyClone；SET7/9 siRNA 購自上海吉瑪基因； LipofectamineTM2000 transfection reagent購自賽默飛公司；抗蛋白激酶R樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶(protein kinase R-like endoplasmic reticulum kinase，PERK)、p-PERK和GRP78兔抗人 I 抗購自Cell Signaling Technology；抗GAPDH鼠抗人 I 抗、羊抗兔 II抗和兔抗鼠 II 抗購自武漢普美克生物技術(shù)有限公司；Western blot 化學(xué)發(fā)光工作液均購自常州天地人和生物科技有限公司；Annexin V/PI 雙染凋亡試劑盒購自江蘇凱基生物技術(shù)有限公司；胰酶和彩虹Maker購自北京索萊寶科技有限公司。

2 主要方法

2.1細(xì)胞培養(yǎng) 設(shè)置對照(control)組、模型(mo-del)組、陰性對照轉(zhuǎn)染(negative control, NC)組和SET7/9 siRNA轉(zhuǎn)染(SET7/9 siRNA)組，取對數(shù)期生長的LO2細(xì)胞鋪在10 cm的培養(yǎng)皿中，待每皿長滿皿底80%時(shí)各組分別加入終濃度為0 μmol/L、100 μmol/L、100 μmol/L和100 μmol/L的亞砷酸鈉處理細(xì)胞，4 h后SET7/9 siRNA轉(zhuǎn)染組進(jìn)行SET7/9 siRNA轉(zhuǎn)染，陰性轉(zhuǎn)染組用亞砷酸鈉染毒后4 h再轉(zhuǎn)染陰性對照siRNA，對照組和模型組砷染毒4 h后加入等轉(zhuǎn)染試劑體積的PBS但不轉(zhuǎn)染siRNA，然后各組細(xì)胞再繼續(xù)培養(yǎng)20 h。

2.2細(xì)胞轉(zhuǎn)染 嚴(yán)格按照轉(zhuǎn)染試劑說明書操作步驟執(zhí)行。

2.3流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡情況 各組細(xì)胞用不含EDTA的0.25%胰酶消化收集細(xì)胞并用PBS洗滌2次，2 000 r/min離心5 min后加入binding buffer 500 μL重懸細(xì)胞，再避光并先后加入Annexin V-FITC 5 μL和碘化丙啶染色液5 μL，室溫避光靜置15 min后上流式細(xì)胞儀檢測。

2.4Western blot 法檢測GRP78、PERK和p-PERK蛋白水平的變化 收集各組細(xì)胞，按100∶1的比例加入蛋白裂解液及蛋白酶抑制劑，冰上裂解 10 min，收集細(xì)胞懸液，超聲破碎，4 ℃、12 000 r/min離心20 min，棄沉淀，收集上清，使用 BCA 蛋白定量試劑盒進(jìn)行蛋白定量，取30 μg總蛋白上樣，行SDS-PAGE，電泳結(jié)束后轉(zhuǎn)移蛋白至PVDF膜，用含5%脫脂奶粉的TBST封閉90 min，分別加入1∶1 500稀釋的兔抗GRP78、PERK、SET7/9和p-PERK抗體。4 ℃搖床孵育過夜。第2天用TBST洗膜后加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的Ⅱ抗(1∶4 000)，室溫孵育90 min，TBST洗膜3次，ECL發(fā)光成像，以GAPDH為內(nèi)參照。條帶用Image Lab圖像分析軟件對每個(gè)條帶灰度值進(jìn)行定量分析。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，多組間比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，組間兩兩比較采用SNK-q法分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 流式細(xì)胞術(shù)檢測各組LO2細(xì)胞凋亡的變化

通過流式細(xì)胞術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)，對照組細(xì)胞凋亡率為(0.41±0.03)%，模型組細(xì)胞凋亡率為(5.18±0.40)%，較對照組顯著增加(P<0.05)；陰性對照轉(zhuǎn)染組細(xì)胞凋亡率為(7.04±0.42)%，SET7/9 siRNA轉(zhuǎn)染組細(xì)胞凋亡率為(3.26±0.34)%，SET7/9 siRNA轉(zhuǎn)染組細(xì)胞凋亡率與陰性對照轉(zhuǎn)染組細(xì)胞凋亡率相比明顯降低(P<0.05)，見圖1。這說明轉(zhuǎn)染SET7/9 siRNA作用于砷染毒的LO2細(xì)胞后能明顯降低其凋亡。

Figure 1.The changes of the apoptosis of the LO2 cells in diffe-rent groups analyzed by flow cytometry.Mean±SD.n=4.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsNC group.

圖1流式細(xì)胞術(shù)檢測各組LO2細(xì)胞凋亡的變化

2 各組LO2細(xì)胞SET7/9蛋白表達(dá)的變化

Western blot 法檢測結(jié)果顯示，模型組SET7/9的表達(dá)水平和對照組相比較明顯升高(P<0.05);SET7/9 siRNA轉(zhuǎn)染組的SET7/9表達(dá)水平與陰性對照轉(zhuǎn)染組相比明顯降低(P<0.05)，見圖2。

Figure 2.The changes of SET7/9 protein expression level in LO2 cells from different groups. Mean±SD.n=4.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsNC group.

圖2各組LO2細(xì)胞SET7/9蛋白表達(dá)的變化

3 各組LO2細(xì)胞ERS相關(guān)蛋白GRP78、PERK和p-PERK水平的變化

Western blot 法檢測結(jié)果顯示，模型組與對照組相比其內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白GRP78和p-PERK的水平均有明顯升高(P<0.05)，而SET7/9 siRNA轉(zhuǎn)染組與陰性對照轉(zhuǎn)染組相比其內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白GRP78和p-PERK的水平均有明顯降低(P<0.05),而模型組、陰性對照轉(zhuǎn)染組及SET7/9 siRNA轉(zhuǎn)染組的PERK的蛋白水平要明顯低于對照組(P<0.05)，見圖3。

討 論

肝臟是砷中毒時(shí)主要受損器官[8-9],其致肝損傷的機(jī)制包括通過ERS誘導(dǎo)肝細(xì)胞凋亡。ERS主要涉及的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)跨膜效應(yīng)蛋白有需肌醇酶1(inositol-requiring enzyme 1，IRE1)、PERK和活化轉(zhuǎn)錄因子6(activating transcription factor 6，ATF6)[10]。當(dāng)ERS過強(qiáng)或長期持續(xù)時(shí)可通過上述3個(gè)信號(hào)通路激活各自下游因子使CHOP表達(dá)水平增加并激活caspase 蛋白酶家族從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。本課題前期研究表明，砷中毒時(shí)可介導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。本次研究通過GRP78表達(dá)變化及流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡結(jié)果再次證實(shí)該機(jī)制的作用。

Figure 3.The changes of expression levels of ERS-related proteins GRP78, PERK and p-PERK in the LO2 cells from different groups. Mean±SD.n=4.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsNC group.

圖3各組LO2細(xì)胞ERS相關(guān)蛋白GRP78、PERK和p-PERK表達(dá)的變化

SET7/9是蛋白賴氨酸甲基化轉(zhuǎn)移酶(protein lysine methyltransferases，PLMTs或PKMTs)家族成員，具有SET結(jié)構(gòu)域?qū)S持體內(nèi)活性蛋白質(zhì)含量和調(diào)節(jié)基因表達(dá)具有重要意義[11-13]。Chuikov等[14]發(fā)現(xiàn)SET7/9能使p53穩(wěn)定性提高且對靶基因的活化作用增強(qiáng)，p53基因被激活后抑制細(xì)胞周期的推進(jìn)或誘導(dǎo)凋亡，SET7/9過表達(dá)能夠誘導(dǎo)人骨肉瘤U20S細(xì)胞凋亡[15]。本實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)砷染毒LO2細(xì)胞SET7/9的表達(dá)水平與對照組相比有明顯升高，再通過SET7/9 siRNA轉(zhuǎn)染，沉默了相關(guān)基因后其凋亡率與陰性對照轉(zhuǎn)染組的細(xì)胞凋亡率相比顯著降低，且發(fā)現(xiàn)SET7/9 siRNA轉(zhuǎn)染組的GRP78表達(dá)水平與陰性轉(zhuǎn)染組相比明顯降低，因此可以證實(shí)SET7/9在砷染毒的LO2細(xì)胞中可能通過介導(dǎo)ERS來誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。p-PERK作為ERS中PERK通路激活的標(biāo)志，p-PERK能特異性上調(diào)細(xì)胞中ATF4和CHOP的表達(dá)，從而激活ERS誘導(dǎo)的凋亡信號(hào)通路，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡的發(fā)生[16-17]。本研究發(fā)現(xiàn)p-PERK表達(dá)水平在模型組明顯高于對照組，SET7/9 siRNA轉(zhuǎn)染組明顯低于陰性對照轉(zhuǎn)染組，可以說明砷染毒的LO2細(xì)胞SET7/9表達(dá)增高可促進(jìn)PERK活化為p-PERK從而激活下游通路而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。SET7/9是否還可通過PERK以外的信號(hào)通路介導(dǎo)ERS從而促進(jìn)砷染毒肝細(xì)胞凋亡本次實(shí)驗(yàn)尚未涉及，值得后續(xù)深入研究。