孔祥波，尹 萍，任 婕，鐘婉珍，劉 仰，李 潔，房思煉

（1.中山大學孫逸仙紀念醫(yī)院口腔科，廣東廣州510120；2.中山大學附屬第六醫(yī)院口腔頜面外科，廣東廣州510655）

放射性頜骨壞死（osteoradionecrosis of the jaws，ORNJ）是頭頸頜面部腫瘤放射治療后所導致的嚴重并發(fā)癥，發(fā)病率約為5%～15%［1-2］。ORNJ的發(fā)生和發(fā)展相對緩慢，往往在放療后數(shù)年乃至10余年才出現(xiàn)如軟硬組織壞死糜爛、瘺管形成和病理性骨折等結(jié)局，嚴重影響患者的生存質(zhì)量，其發(fā)病機制至今尚未完全明確［3］。骨髓是對放射線較為敏感的組織器官之一，骨髓間充質(zhì)干細胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMMSC）來源于骨髓，是一類具有自我更新和多向分化潛能的前體細胞，在不同條件的誘導下可向成骨細胞、軟骨細胞和脂肪細胞等成體細胞分化［4-5］。BMMSC是骨組織中對放射線較為敏感的細胞之一，同時也是骨組織放射損傷的主要靶細胞之一。有研究表明，高劑量的放射線可導致BMMSC染色體受損，細胞增殖率降低，并破壞細胞的基因穩(wěn)定性［6］。目前，細胞模型由于影響因素少、實驗條件可控性強等優(yōu)點而被廣泛應(yīng)用于某一類疾病的體外研究中。因此，本研究擬通過采用X射線照射建立人骨髓間充質(zhì)干細胞（human bone marrow mesenchymal stem cells，hBMMSC）放射損傷的細胞模型，并利用該模型評價X射線對hBMMSC自噬、凋亡、克隆形成、多潛能干性和成骨分化能力的影響，以期將其應(yīng)用于ORNJ的相關(guān)研究中。所檢測指標中Beclin1是一種自噬相關(guān)蛋白，也是控制自噬途徑的關(guān)鍵分子；克隆形成反映了細胞群體依賴性和增殖能力的性狀；Sox2和Nanog是代表干細胞多分化潛能特性的細胞因子；RUNX2和OGN是骨代謝相關(guān)因子。經(jīng)多方面證實hBMMSC放射損傷的細胞模型的成功建立。

1 材料與方法

1.1 試劑和儀器

人骨髓間充質(zhì)干細胞（hBMMSC）和成骨誘導分化培養(yǎng)基購自賽業(yè)生物科技有限公司，胎牛血清（FBS）、高糖達爾伯克改良伊格爾培養(yǎng)基（DMEM）購自美國Gibco公司，Annexin V/PI雙染試劑盒購自凱基生物，龍膽紫染液購自美國Sigma公司，堿性磷酸酶檢測試劑盒購自南京建成，兔抗人Beclin1、Sox2、Nanog單克隆抗體和鼠抗人GAPDH單克隆抗體購自美國Proteintech公司，山羊抗兔二抗、山羊抗鼠二抗購自聯(lián)科生物，兔抗人RUNX2多克隆抗體購自美國Cell Signaling Technology公司，鼠抗人OGN單克隆抗體購自美國Santa Cruz公司，PCR引物購自上海生工，逆轉(zhuǎn)錄和實時熒光定量PCR試劑盒購自日本TaKaRa公司；二氧化碳培養(yǎng)箱、生物安全柜、酶標儀購自美國Thermo公司，倒置顯微鏡購自日本Nikon公司，電泳槽、轉(zhuǎn)印槽、超高靈敏度化學發(fā)光成像系統(tǒng)購自美國BIO-RAD公司，實時熒光定量PCR儀購自瑞士Roche公司，流式細胞儀購自美國Becton Dickinson公司，X射線輻照儀購自美國Rad Source公司。

1.2 hBMMSC細胞的培養(yǎng)

使用含體積分數(shù)10%胎牛血清、1%青-鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基，置于37℃、體積分數(shù)為5%的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，觀察并記錄細胞的生長狀態(tài)。每3天換液一次，待細胞匯合度達到80%～90%時按1∶3進行傳代，取第4代細胞進行實驗。

1.3 細胞照射

細胞處于對數(shù)生長期時進行X射線照射，采用中山大學醫(yī)學實驗中心RAD SOURCE RS 2000型X-ray生物學輻照儀進行照射，工作電壓160 kV，電流25 mA，劑量率1.24 Gy/min（加反射體），照射劑量分別為0、2、4、8 Gy劑量，所有樣品照射均在室溫下進行，照射完成后細胞重新放回培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)。

1.4 Western blotting

將對數(shù)生長期的hBMMSC接種于6孔板中，用RIPA裂解液裂解各組細胞提取總蛋白，用蛋白濃度測定試劑盒測定樣品的蛋白濃度，配平。取20 μg蛋白樣品上樣，經(jīng)SDS-PAGE電泳分離后，將待測蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，用5%脫脂奶粉溶液于室溫下封閉1 h，加入一抗于4℃孵育過夜。次日用TBST洗膜3次，加入二抗室溫下孵育1 h。TBST洗膜3次后，化學發(fā)光法顯影采集目的條帶圖像。

1.5 RT-qPCR

將對數(shù)生長期的hBMMSC接種于6孔板中，采用Trizol提取細胞總RNA，定量后將細胞RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，使用實時熒光定量PCR分析各組mRNA的表達水平，配制20 μL的反應(yīng)體系：上、下游引物（10 μmol/L）各 0.8 μL、SYBR Green 10 μL，DNA 模板 2 μL、dH2O 6.4 μL。反應(yīng)條件為：95 ℃ 30 s，1個循環(huán)；95 ℃ 5 s、60 ℃ 30 s，40個循環(huán)。每組樣品設(shè)置3個復(fù)孔。采用2-ΔΔCt相對定量法進行分析，使用GAPDH進行校正，計算目的基因的相對表達量，所使用的引物序列見表1。

表1 引物序列Table 1 The sequences of the primers

1.6 細胞凋亡

將對數(shù)生長期的hBMMSC接種于6孔板中，加入不含EDTA的胰酶1 mL，消化后收集細胞，PBS重懸，再次離心。去上清，500 μL Binding Buffer重懸細胞，調(diào)整細胞濃度為1×106個/mL。分別加入5 μL Annexin-V和5 μL PI，室溫下避光孵育15 min，上流式細胞儀檢測，采用Flowjo軟件進行分析。

1.7 克隆形成

將對數(shù)生長期的hBMMSC接種于6 cm培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)2周后吸走細胞培養(yǎng)基，PBS洗滌2次，加入40 g/L的多聚甲醛溶液固定20 min，吸走多聚甲醛，ddH2O洗滌2次，0.1%結(jié)晶紫染色15 min，漂洗后烘干水漬，拍照觀察。

1.8 成骨誘導分化

當hBMMSC匯合度達到70%時，將完全培養(yǎng)基更換為成骨誘導分化培養(yǎng)基（DMEM+10%胎牛血清，10 mmol/L β-甘油磷酸鈉，50 mg/L抗壞血酸，1 μmol/L地塞米松，100 U/mL青-鏈霉素），每3天進行換液。

1.9 堿性磷酸酶活性測定

將對數(shù)生長期的hBMMSC接種于12孔板中，每孔加入200 μL TritonX-100裂解液，4℃裂解過夜。完成后取30 μL裂解液，按照試劑盒說明書進行操作，使用酶標儀于520 nm波長處測定吸光度A520nm。另取10 μL裂解液用BCA法測定蛋白濃度，計算每克蛋白所含有的堿性磷酸酶活性。

1.1 0 統(tǒng)計學分析

采用SPSS 20.0軟件進行分析，結(jié)果以均數(shù)±標準差（mean±SD）表示，所有實驗獨立重復(fù)3次。兩組間采用兩獨立樣本t檢驗，多組間采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用Dunnett-t檢驗法，雙側(cè)檢驗，以P＜0.05代表差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 X射線對hBMMSC Beclin1蛋白和mRNA表達的影響

與0 Gy對照組相比，hBMMSC經(jīng)2、4、8 Gy X射線照射后，Beclin1的蛋白水平表達呈劑量依賴性上調(diào)，多組間根據(jù)單因素方差分析，差異具有統(tǒng)計學意義（F=128.40，P＜0.001），Dunnett-t檢驗法兩兩比較顯示不同劑量照射組與0 Gy對照組相比，差異均有統(tǒng)計學意義（P=0.025 vs 2 Gy；P=0.009 vs 4 Gy，P=0.005 vs 8 Gy；圖 1）；Beclin1 的mRNA水平表達亦呈劑量依賴性升高，多組間根據(jù)單因素方差分析，差異具有統(tǒng)計學意義（F=79.31，P＜0.01），Dunnett-t檢驗法兩兩比較顯示不同劑量照射組與0 Gy對照組相比，差異均有統(tǒng)計學意義（P=0.010 vs 2 Gy；P＜0.001 vs 4 Gy，P＜0.001 vs 8 Gy；圖2）。

2.2 X射線對hBMMSC凋亡率的影響

與0 Gy對照組相比，hBMMSC經(jīng)2、4、8 Gy X射線照射后，細胞凋亡率隨著照射劑量的增加而逐漸升高，依次為（1.96±0.91）%、（4.28±0.83）%、（5.65±0.64）%、（14.64±1.57）%。根據(jù)單因素方差分析，差異具有統(tǒng)計學意義（F=84.34，P＜0.001），Dunnett-t檢驗法兩兩比較顯示不同劑量照射組與0 Gy對照組相比，2、4 Gy照射組的差異均無統(tǒng)計學意義，8 Gy照射組與0 Gy對照組相比，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.001；圖3）。

圖1 不同劑量X射線對hBMMSC Beclin1蛋白表達的影響Fig.1 Effect of different doses of X-ray on Beclin1 protein expression in hBMMSC

2.3 X射線對hBMMSC克隆形成率的影響

克隆形成實驗結(jié)果顯示，hBMMSC經(jīng)8 Gy X射線照射后克隆形成率為（11.32±2.08）%，空白對照組克隆形成率為（31.25±2.97）%，照射后細胞克隆形成率顯著下降，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.001；圖4）。

圖2 不同劑量X射線對hBMMSC Beclin1 mRNA表達的影響Fig.2 Effect of different doses of X-ray on Beclin1 mRNA expression in hBMMSC

2.4 X射線對hBMMSC Sox2、Nanog蛋白和mRNA表達的影響

與0 Gy對照組相比，hBMMSC經(jīng)8 Gy X射線照射后，Sox2和Nanog的蛋白水平表達下調(diào)（Sox2：P=0.009；Nanog：P＜0.001；圖5）；同時Sox2和Nanog的mRNA水平表達亦降低，差異均具有統(tǒng)計學意義（Sox2：P＜0.001；Nanog：P＜0.001；圖6）。

圖3 不同劑量X射線對hBMMSC凋亡率的影響Fig.3 Effect of different doses of X-ray on apoptosis rate in hBMMSC

圖4 不同劑量X射線對hBMMSC克隆形成率的影響Fig.4 Effect of different doses of X-ray on CFU-F efficiency in hBMMSC

圖5 不同劑量X射線對hBMMSC Sox2和Nanog蛋白表達的影響Fig.5 Effect of different doses of X-ray on Sox2 and Nanog protein expression in hBMMSC

2.5 X射線對hBMMSC成骨誘導分化后RUNX2、OGN蛋白和mRNA表達的影響

與0 Gy對照組相比，hBMMSC經(jīng)2、4、8 Gy X射線照射后，成骨誘導分化第7天RUNX2和第14天OGN的蛋白水平表達均呈劑量依賴性下調(diào)，分別對各組進行單因素方差分析，差異具有統(tǒng)計學意義（RUNX2：F=70.4，P＜0.001；OGN：F=64.07，P＜0.001），利用Dunnett-t檢驗兩兩比較顯示：與0 Gy對照組相比，2 Gy照射組的RUNX2和OGN蛋白水平表達差異無統(tǒng)計學意義外（RUNX2：P=0.059，OGN：P=0.067），4 Gy和8 Gy照射組差異均有統(tǒng)計學意義（RUNX2：P=0.002 vs 4 Gy，P=0.002 vs 8 Gy ；OGN：P=0.025 vs 4 Gy，P=0.009 vs 8 Gy；圖7）；RUNX2和OGN的mRNA水平表達亦呈劑量依賴性降低，根據(jù)單因素方差分析，差異具有統(tǒng)計學意義（RUNX2：F=51.92，P＜0.01；OGN：F=58.16，P＜0.01），Dunnett-t檢驗兩兩比較顯示與0 Gy對照組相比，除2 Gy照射組的RUNX2水平表達差異無統(tǒng)計學意義外（P=0.075），其余各組差異均有統(tǒng)計學意義（RUNX2：P=0.002 vs 4 Gy，P=0.0002 vs 8 Gy；OGN：P=0.003 vs 2 Gy，P=0.001 vs 4 Gy，P=0.0004 vs 8 Gy；圖8）。

2.6 X射線對hBMMSC成骨誘導分化后堿性磷酸酶活性的影響

與0 Gy對照組相比，hBMMSC經(jīng)2、4、8 Gy X射線照射后，成骨誘導分化第7天堿性磷酸酶活性呈劑量依賴性降低，根據(jù)單因素方差分析，差異具有統(tǒng)計學意義（F=47.97，P＜0.001），Dunnett-t檢驗法兩兩比較顯示不同劑量照射組與0 Gy對照組相比，2 Gy照射組的差異無統(tǒng)計學意義（P=0.068），4、8 Gy照射組差異具有統(tǒng)計學意義（P=0.011 vs 4 Gy，P=0.0004 vs 4 Gy；圖9）。

3 討論

圖6 不同劑量X射線對hBMMSC Sox2和Nanog mRNA表達的影響Fig.6 Effect of different doses of X-ray on Sox2 and Nanog mRNA expression in hBMMSC

圖7 不同劑量X射線對hBMMSC RUNX2和OGN蛋白表達的影響Fig.7 Effect of different doses of X-ray on RUNX2 and OGN protein expression in hBMMSC

圖8 不同劑量X射線對hBMMSC RUNX2和OGN mRNA表達的影響Fig.8 Effect of different doses of X-ray on RUNX2 and OGN mRNA expression in hBMMSC

圖9 不同劑量X射線對hBMMSC堿性磷酸酶活性的影響Fig.9 Effect of different doses of X-ray on alkaline phosphatase activity in hBMMSC

放射治療是目前頭頸部惡性腫瘤的主要治療手段之一，但放療所致頜面部組織的損傷卻給患者帶來嚴重的并發(fā)癥，其中以O(shè)RNJ最為嚴重［7］。ORNJ的發(fā)病機制至今尚未能完全明確，其病理學轉(zhuǎn)歸大多表現(xiàn)為放射區(qū)域的組織細胞受到破壞，同時氧自由基大量形成，引起細胞外基質(zhì)堆積和微血管血栓，最終骨重塑平衡被打破造成骨壞死［8］。頜骨組織的形成主要包括hBMMSC定向分化為成骨祖細胞和后續(xù)向成熟成骨細胞分化的過程，hBMMSC是存在于骨髓中一類具有多向分化潛能和自我更新能力的干細胞，是髓腔內(nèi)的“種子細胞群”，同時也是骨組織中對放射線敏感的細胞之一。本研究通過采用輻照儀對細胞進行不同劑量X射線照射，從而建立hBMMSC放射損傷的細胞模型。

hBMMSC在缺氧、細胞毒藥物以及放射等應(yīng)激狀態(tài)之下，會激發(fā)自噬從而維持細胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定。有研究顯示，當細胞經(jīng)各類射線照射后，細胞中最主要的反應(yīng)為生物膜、細胞器和細胞核等在結(jié)構(gòu)或者功能上受到損傷，細胞死亡是其中最為嚴重的結(jié)局，自噬與凋亡是細胞對損傷剌激的適應(yīng)反應(yīng)［9］。Beclin1作為參與自噬形成的重要基因，其表達水平在一定程度上能反應(yīng)細胞的自噬情況［10］。細胞凋亡則是維持正常組織形態(tài)和一定功能的主動自殺過程，是在基因控制下按照一定程序進行的細胞死亡［11-12］。我們在研究中分別給予單次照射劑量0、2、4、8 Gy，照射后Western blot與RT-qPCR檢測結(jié)果均顯示，正常hBMMSC中Beclinl呈弱表達，而在照射后表達則呈劑量依賴性升高，其中在8 Gy時表達最高；此外，我們在0、2、4、8 Gy的X射線照射劑量下檢測hBMMSC的凋亡率，結(jié)果顯示照射組的凋亡率與空白對照組相比均有升高，經(jīng)8 Gy單次照射后hBMMSC的凋亡率與空白對照組凋亡率差異最為顯著。

細胞克隆形成率即細胞接種存活率，表示細胞接種后貼壁細胞成活并形成克隆的數(shù)量，反映了細胞群體依賴性和增殖能力兩個重要性狀［13］。根據(jù)本實驗中克隆形成結(jié)果顯示，hBMMSC經(jīng)8 Gy X射線照射后克隆形成率為（11.32±2.08）%，未照射空白對照組克隆形成率為（31.25±2.97）%，表明照射后細胞克隆形成率顯著下降。

Sox2和Nanog是代表干細胞多分化潛能特性的細胞因子，對于維持干細胞的功能起關(guān)鍵作用［14-15］。當這些細胞因子處于受損狀態(tài)下，干細胞的多潛能分化特性就會受到影響。RUNX2是調(diào)控成骨分化早期階段的重要轉(zhuǎn)錄因子［16］；OGN稱為骨誘導因子，是骨組織的一種分泌蛋白［17］；堿性磷酸酶是成骨細胞的早期標志性物質(zhì)［18］。我們的研究表明，8 Gy X射線照射后hBMMSC Sox2和Nanog的表達降低，這提示干細胞的多潛能特性受到損傷，后續(xù)有望繼續(xù)開展相應(yīng)X射線照射后體外誘導hBMMSC成骨誘導，成脂誘導及成軟骨誘導的細胞實驗，以及在臨床ORNJ樣本中檢測成骨相關(guān)基因的表達變化差異。此外，不同劑量X射線照射后hBMMSC成骨分化基因RUNX2和OGN的表達下調(diào)，堿性磷酸酶活性降低，其中以8 Gy照射組最為明顯，這說明X射線能抑制hBMMSC的成骨分化能力，影響新生骨組織形成，打破放射后骨組織內(nèi)平衡以及體內(nèi)骨髓微環(huán)境的穩(wěn)定性，從而增進破骨細胞介導的骨吸收過程，導致了骨缺損的形成。

綜上所述，本研究建立的hBMMSC放射損傷細胞模型分別從細胞的自噬、凋亡、克隆形成、多潛能干性和成骨分化能力等方面驗證了X射線對hBMMSC的放射性損傷，充分說明該細胞模型的構(gòu)建是成功的，并為ORNJ發(fā)病機制等的實驗研究提供新的研究對象，也對開展抗輻射藥物對hBMMSC的保護作用的驗證以及藥物通過信號通路發(fā)揮作用的深入探討具有重要意義。