蘇 舒，唐剛?cè)A，聶大紅，熊 鸚，馬 慧，林麗萍，元龔駿，向賢宏

（中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院影像醫(yī)學(xué)與核醫(yī)學(xué)科，廣東廣州 510080）

肝纖維化是各種慢性炎癥刺激導(dǎo)致的常見(jiàn)病理結(jié)果，其主要病理變化為肝星狀細(xì)胞（hepatic stellate cell，HSC）活化，并誘導(dǎo)過(guò)量細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）在肝血竇區(qū)和肝細(xì)胞周圍積聚，逐漸形成纖維瘢痕［1］。肝纖維化持續(xù)受到炎癥因子刺激將導(dǎo)致肝硬化、肝細(xì)胞癌等終末期肝病。一般而言，肝纖維化可以逆轉(zhuǎn)，而肝硬化目前除了針對(duì)病因治療或肝移植之外，沒(méi)有可用于肝硬化的有效治療措施［2］，因此，有必要建立靈敏度和特異性高的診斷方法用于檢測(cè)肝纖維化疾病嚴(yán)重程度和評(píng)估抗纖維化療效。目前臨床上用于肝纖維化診斷所采用的病理學(xué)和影像學(xué)檢查方法主要是肝組織活檢［3］和超聲彈性成像［4］、MRI彈性成像［5］，但以上診斷方法均有不足和缺陷。近年來(lái)，正電子發(fā)射斷層掃描（positron emission tomography，PET）已被廣泛應(yīng)用于評(píng)估傳染性、炎癥性和退行性疾?。?-7］。其中18F-FDG是目前臨床上最常使用的放射性示蹤劑，在腫瘤、炎癥等代謝活性高的疾病組織中會(huì)出現(xiàn)特異性濃聚及高攝取現(xiàn)象。在一項(xiàng)評(píng)估肝臟脂肪變性疾病對(duì)肝臟代謝活性影響的研究中，Bural等［8］報(bào)道了彌漫性肝臟脂肪變性患者具有更大的肝臟平均SUV值和肝臟最大SUV值及更大的肝臟代謝體積，作者認(rèn)為與彌漫性肝脂肪變性有關(guān)的活動(dòng)性炎癥可能是導(dǎo)致這些患者肝臟代謝活動(dòng)增加的一個(gè)可能原因，肝纖維化疾病的主要病理特征是炎癥，參與肝臟炎癥進(jìn)程的炎癥細(xì)胞包括庫(kù)否細(xì)胞，浸潤(rùn)性巨噬細(xì)胞，T淋巴細(xì)胞，嗜中性粒細(xì)胞和樹突細(xì)胞等［9］。已有多項(xiàng)研究證明，18F-FDG作為非特異性示蹤劑，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)其可在感染部位和炎癥部位累積［10］。以上結(jié)果為本實(shí)驗(yàn)提供了啟示：探究18FFDG PET/CT顯像用于無(wú)創(chuàng)診斷慢性炎癥刺激引起的肝纖維化的可行性。本實(shí)驗(yàn)研究旨在通過(guò)觀察并分析模型動(dòng)物肝纖維化病灶處18F-FDG濃聚情況與肝組織纖維化病理變化的關(guān)系，探討18FFDG PET/CT顯像是否可無(wú)創(chuàng)應(yīng)用于肝纖維化的顯像診斷，為肝纖維化疾病進(jìn)展程度和抗纖維化療效評(píng)估提供有效檢測(cè)手段。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑及設(shè)備18F-FDG由中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院核醫(yī)學(xué)科提供，2%戊巴比妥鈉、酒精、注射器購(gòu)置于武漢谷歌生物科技有限公司，羥脯氨酸含量測(cè)試盒購(gòu)置于Abcam公司，硫代乙酰胺（thioacetamide，TAA，98%）購(gòu)置于Sigma-Aldrich公司，小動(dòng)物PET/CT顯像儀器（Siemens，Knoxville，TN）購(gòu)置于Siemens公司。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 成年SD雄性大鼠（SPF級(jí)），體質(zhì)量為160～180 g，由中山大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心東校區(qū)提供［SYXK（粵）2016-0112］。

1.2 方法

1.2.1 大鼠肝纖維化模型的建立及分組 成年雄性SD大鼠在SPF級(jí)環(huán)境下飼養(yǎng)，其飼養(yǎng)在25℃室內(nèi)溫度及12 h明/暗周期更替的環(huán)境中并可自由獲得標(biāo)準(zhǔn)飼料和飲用水。動(dòng)物研究實(shí)驗(yàn)方案符合中山大學(xué)動(dòng)物倫理委員會(huì)的相關(guān)倫理規(guī)定并通過(guò)委員會(huì)批準(zhǔn)。12只大鼠隨機(jī)分為模型組（TAA）和對(duì)照組（CTL），每組6只。模型組給予每周兩次腹腔注射4%硫代乙酰胺200 mg/kg，持續(xù)時(shí)間為6周；對(duì)照組大鼠每周兩次腹腔注射等量的滅菌生理鹽水，持續(xù)時(shí)間為6周。

1.2.218F-FDG PET/CT顯像 腹腔注射6周后，所有大鼠在進(jìn)行顯像前均需禁食至少6 h。兩組大鼠以2%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉后經(jīng)尾靜脈注入18F-FDG生理鹽水溶解液（37 MBq/kg，1 mCi/kg）。尾靜脈注射1 h后將大鼠仰臥位置于小動(dòng)物PET/CT顯像儀器進(jìn)行PET/CT掃描，掃描時(shí)間為25 min，包括10 min CT掃描及15 min PET掃描。觀察兩組大鼠肝組織的18F-FDG攝取情況和測(cè)量肝臟纖維化區(qū)域18F-FDG攝取值（%ID/g）。

1.2.3 解剖形態(tài)學(xué)、HE染色、Masson染色和羥脯氨酸含量測(cè)定 經(jīng)18F-FDG PET/CT顯像后，兩組大鼠經(jīng)2%戊巴比妥鈉過(guò)量麻醉后頸椎脫臼處死，解剖大鼠打開腹腔暴露肝區(qū)，觀察模型組和對(duì)照組肝臟解剖形態(tài)學(xué)。大鼠經(jīng)生理鹽水灌注取材后分離出肝臟組織，取肝臟左葉組織樣本經(jīng)40 g/L多聚甲醛溶液固定，石蠟包埋，制成4 μm切片，行HE染色用于常規(guī)組織病理學(xué)檢查及Masson染色用于評(píng)估纖維化程度。顯微鏡下觀察兩組大鼠肝臟組織病理組織學(xué)情況和纖維、膠原增生情況。另取肝臟右葉組織樣本用于肝組織羥脯氨酸含量測(cè)定，測(cè)定方法按照試劑盒的說(shuō)明進(jìn)行。肝臟組織羥脯氨酸濃度與膠原蛋白密切相關(guān)，測(cè)量其含量可作為肝纖維化嚴(yán)重程度的指標(biāo)［11］。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

實(shí)驗(yàn)所有數(shù)據(jù)采用Graphpad Prism 6軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料均采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示。兩個(gè)獨(dú)立樣本比較采用Student-t檢驗(yàn)。當(dāng)P＜0.05時(shí)，認(rèn)為兩組樣本的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠肝臟纖維化的18F-FDGPET/CT顯像結(jié)果

觀察并分析18F-FDG PET/CT顯像圖，CT圖結(jié)果顯示低分辨CT不能鑒別對(duì)照組及模型組大鼠肝臟密度差異。PET與CT融合圖結(jié)果顯示對(duì)照組大鼠肝臟組織未見(jiàn)明顯放射性濃聚；模型組大鼠肝臟處可見(jiàn)較高的放射性濃聚（圖1）。模型組肝臟組織感興趣區(qū)18F-FDG的攝取值明顯高于對(duì)照組［（0.481± 0.010）vs（0.238 ± 0.007）%ID/g，t=20.46，P＜0.001；圖2］。

圖2 兩組大鼠肝組織的18F-FDG攝取值比較Fig.2 18F-FDG uptake of liver tissues in control and TAA group

圖1 兩組大鼠肝組織的18F-FDG PET/CT顯像圖Fig.1 18F-FDG PET/CT images of liver tissues in control and model group

圖3 兩組大鼠6周后肝組織的解剖形態(tài)學(xué)改變Fig.3 Anatomical morphological changes of liver tissues in control and TAA-induced rats

圖4 兩組大鼠6周后肝組織的病理組織學(xué)變化及膠原沉積情況Fig.4 Pathological changes and collagen deposition of liver tissues in control and TAA-induced rats

2.2 解剖形態(tài)學(xué)改變、病理組織學(xué)變化和羥脯氨酸含量檢測(cè)

在18F-FDG PET/CT顯像結(jié)束后，兩組大鼠經(jīng)解剖暴露肝區(qū)，對(duì)照組肝臟大小及比例正常，肝臟表面光滑平整，邊緣銳利；模型組大鼠肝臟表面則粗糙不均，呈微小細(xì)顆粒觀（圖3）。對(duì)照組大鼠肝組織鏡下HE染色及Masson染色切片觀察結(jié)構(gòu)正常，無(wú)明顯病理變化。模型組大鼠肝組織HE染色顯示肝組織結(jié)構(gòu)紊亂，肝血竇區(qū)和肝細(xì)胞周圍中性粒細(xì)胞募集；Masson染色結(jié)果顯示大鼠肝組織內(nèi)纖維增生，膠原纖維伸入肝細(xì)胞和肝血竇區(qū)（圖4）。檢測(cè)兩組大鼠肝組織的羥脯氨酸含量用以評(píng)估肝組織內(nèi)纖維增生和膠原沉積情況。結(jié)果顯示模型組大鼠肝組織羥脯氨酸含量明顯高于對(duì)照組［（3.507± 0.144）vs（0.317± 0.053）mg/L，t=20.74，P＜0.001；圖5］。

2.3 肝組織18F-FDG攝取值與纖維化程度的關(guān)系

造模6周后，模型組肝細(xì)胞周圍和肝血竇區(qū)可見(jiàn)明顯的纖維增生和膠原沉積。與病理結(jié)果顯示一致，兩組大鼠顯像圖在相同的放射性本底值處理下，模型組肝組織纖維化區(qū)18F-FDG可見(jiàn)較高濃聚，且18F-FDG攝取量明顯高于對(duì)照組。數(shù)據(jù)分析結(jié)果顯示，模型組18F-FDG攝取值與羥脯氨酸含量具有密切相關(guān)性（R2=0.9321，P=0.0018；圖6）。

3 討論

圖5 兩組大鼠肝組織中羥脯氨酸含量的測(cè)定Fig.5 Hydroxyproline content of liver in two groups

圖6 肝組織18F-FDG攝取值與羥脯氨酸含量的相關(guān)性分析Fig.6 Correlation between18F-FDG uptake and hydroxyproline content in liver tissues

肝纖維化是各種慢性肝病進(jìn)展中由于肝內(nèi)細(xì)胞外基質(zhì)合成與降解失衡，致使過(guò)多的膠原在肝內(nèi)沉積，并逐漸形成纖維性瘢痕，常伴有炎癥并可進(jìn)展為肝硬化甚至肝癌［1，12］。肝硬化是全球肝病相關(guān)發(fā)病率和死亡率的主要原因，慢性肝病在我國(guó)是常見(jiàn)病、多發(fā)病，在中國(guó)約3億人受肝病困擾［13］。因此非侵入性、準(zhǔn)確的診斷方法對(duì)于診斷早期肝纖維化疾病，監(jiān)測(cè)肝纖維化疾病進(jìn)展和評(píng)估抗纖維化治療療效具有重要意義。目前，肝組織活檢是臨床肝纖維化診斷和分期的金標(biāo)準(zhǔn)［3］?？估w維化藥物的所有臨床試驗(yàn)都需要肝活檢來(lái)評(píng)估治療前后的纖維化病情分期。但由于活檢的侵入性、抽樣隨機(jī)性、高價(jià)格等性質(zhì)對(duì)臨床試驗(yàn)設(shè)計(jì)施加了若干限制［14］。超聲瞬時(shí)彈性成像和磁共振彈性成像可應(yīng)用于測(cè)量與纖維化相關(guān)的肝硬度檢查。這兩種檢查方法能可靠地診斷中度和重度纖維化，但在早期纖維化時(shí)期，具有腹水或病態(tài)肥胖的患者中測(cè)試性能較低［15］。與超聲瞬時(shí)彈性成像和磁共振彈性成像相比，18F-FDG PET/CT顯像技術(shù)能夠分析評(píng)估局部及整體肝臟的功能代謝情況并提供準(zhǔn)確的解剖定位信息，應(yīng)用于無(wú)創(chuàng)診斷早期肝纖維化疾病并監(jiān)測(cè)纖維化活動(dòng)度具備一定可行性。近年來(lái)研究表明，18F-FDG PET/CT顯像診斷肝脂肪變性疾病具有一定的特異性，肝脂肪變性患者肝病灶處呈現(xiàn)明顯的18F-FDG放射性濃聚［16］。炎癥因子介導(dǎo)、炎性細(xì)胞浸潤(rùn)等炎癥反應(yīng)的參與在肝纖維化形成的機(jī)制中起到重要作用［17］。在存在肝臟炎癥的情況下，由于炎性細(xì)胞中不可逆的18F-FDG積聚，肝臟18F-FDG攝取可增加，這表明18F-FDG PET/CT也可作為肝纖維化的潛在成像方法。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，兩組大鼠進(jìn)行18F-FDG PET/CT顯像后，對(duì)照組大鼠肝組織無(wú)異常放射性濃聚，呈低攝取顯像；模型組大鼠肝組織內(nèi)可見(jiàn)18F-FDG放射性濃聚增高。解剖兩組大鼠發(fā)現(xiàn)兩組大鼠解剖形態(tài)學(xué)可見(jiàn)差異，模型組觀察到肝臟表面粗糙不均呈細(xì)顆粒感，邊界不均勻；對(duì)照組肝臟大小及比例正常，表面光滑平整。為了確定肝組織18F-FDG的攝取水平是否和肝纖維化疾病具備相關(guān)性，本實(shí)驗(yàn)研究對(duì)兩組大鼠肝組織進(jìn)行病理檢查和羥脯氨酸含量測(cè)定。病理結(jié)果表現(xiàn)為模型組大鼠HE染色顯示組織病理學(xué)改變即肝臟正常結(jié)構(gòu)破壞，肝小葉結(jié)構(gòu)紊亂，中性粒細(xì)胞在肝細(xì)胞周圍及肝血竇區(qū)大量募集；Masson染色顯示模型組大鼠肝細(xì)胞及肝血竇周圍大量纖維間隔包繞，出現(xiàn)明顯的纖維增生、膠原沉積等表現(xiàn)；對(duì)照組大鼠肝組織結(jié)構(gòu)無(wú)明顯異常，也未見(jiàn)纖維、膠原沉積。模型組大鼠肝組織內(nèi)羥脯氨酸含量明顯增高，進(jìn)一步證實(shí)模型組肝組織內(nèi)纖維化活動(dòng)明顯。從實(shí)驗(yàn)獲得的顯像數(shù)據(jù)和病理數(shù)據(jù)分析，肝纖維化18F-FDG濃聚情況與肝組織纖維化病理改變結(jié)果表現(xiàn)出一致性，肝臟18F-FDG攝取值與肝組織纖維化程度相關(guān)，證實(shí)了18F-FDG PET/CT顯像在肝纖維化的診斷具有一定的特異性。

綜上，本實(shí)驗(yàn)研究通過(guò)模型組大鼠肝纖維化疾病進(jìn)展時(shí)肝臟組織18F-FDG攝取增加，表明18FFDG PET/CT技術(shù)有可能發(fā)展為無(wú)創(chuàng)診斷肝纖維化的潛在成像方法，并應(yīng)用于監(jiān)測(cè)肝纖維化疾病進(jìn)展及評(píng)估抗纖維化療效。