張 彥，孫櫻桐，許藝明，丁紅珂，張 巍，尹愛華

（1.廣東省婦幼保健院醫(yī)學(xué)遺傳中心，廣東廣州 511442；2.廣州嘉檢醫(yī)學(xué)檢測(cè)有限公司，廣東廣州 510300）

遺傳病種類繁多，臨床表現(xiàn)大多不特異，常規(guī)手段診斷困難，常常需要對(duì)整個(gè)基因組或基因組特定區(qū)域進(jìn)行檢測(cè)才能起到輔助診斷的作用。染色體微陣列技術(shù)和高通量測(cè)序技術(shù)作為基因組檢測(cè)技術(shù)的代表，對(duì)于遺傳病的臨床診斷具有重要價(jià)值［1-2］，但由于費(fèi)用和檢測(cè)周期等問題，臨床病例急需一種相對(duì)單一的解決方案。對(duì)于孟德爾遺傳病，除了種類繁雜的單核苷酸變異（single nucleotide variation，SNV）相關(guān)的遺傳病外，拷貝數(shù)變異（copy number variation，CNV）也與多種遺傳病相關(guān)［3］。高通量測(cè)序技術(shù)雖然針對(duì)不同種類的疾病有不同的檢測(cè)方案，但大多是針對(duì)SNV的檢測(cè)，對(duì)于CNV的檢測(cè)，仍然有較多的爭議，大多數(shù)的檢測(cè)方案是依據(jù)全外顯子組（whole exome）或特定基因包（panel）進(jìn)行算法優(yōu)化［4-5］。雖然不同的算法在特定的病種或群體中顯示出一定的有效性，但并未得到廣泛認(rèn)可。醫(yī)學(xué)外顯子組（medical exome）測(cè)序，也叫臨床外顯子組（clinical exome）測(cè)序，是指針對(duì)目前已知的與遺傳病相關(guān)的所有基因的編碼區(qū)及其側(cè)翼區(qū)進(jìn)行捕獲后測(cè)序［6］。不同的檢測(cè)機(jī)構(gòu)依據(jù)的數(shù)據(jù)庫版本有差異、采用的捕獲策略不同，因此方案設(shè)計(jì)上會(huì)有部分區(qū)別，但對(duì)于大多數(shù)遺傳病的檢測(cè)，尤其是SNV的檢測(cè)，設(shè)計(jì)上的差別基本上可以忽略。然而對(duì)于CNV的檢測(cè)，目前可獲得的資料相對(duì)較少。本單位從2015年開始應(yīng)用醫(yī)學(xué)外顯子組測(cè)序進(jìn)行遺傳病基因診斷，逐漸建立了較為完善的CNV檢測(cè)方法，已經(jīng)在較多病例中得到不斷驗(yàn)證。本文僅以兩個(gè)家系為例對(duì)醫(yī)學(xué)外顯子組測(cè)序在CNV相關(guān)的遺傳病基因檢測(cè)中的可行性進(jìn)行分析。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象

家系1（圖1A）正常個(gè)體1-II-3于2017年8月來我中心咨詢，自訴有智力低下家族史：2位哥哥（1-II-1和1-II-2）均為患者。患者1-II-1（36歲）和1-II-2（34歲）表現(xiàn)為頭型偏長（似長方形），智力輕度低下，語言能力差，運(yùn)動(dòng)能力正常?；颊?-II-2伴有單側(cè)眼瞼下垂，可識(shí)漢字，讀書到小學(xué)5年級(jí)，期間成績較差。

家系2（圖1B）患者2-II-1，男，9歲，2016年8月來我中心咨詢?；純撼錾鷷r(shí)手指、腳趾偏長，指關(guān)節(jié)屈曲。1歲時(shí)大腦CT提示腦發(fā)育異常（未見影像資料），智力評(píng)估低下，發(fā)育落后，并伴有房間隔缺損，三尖瓣反流（未見影像資料）。父母帶患兒來我中心咨詢時(shí)身高126 cm，體質(zhì)量19 kg，身型較瘦，呈特殊面容，眉毛粗短，左眼斜視，舌無法正常外伸，不會(huì)講話，外耳廓呈半圓形，耳位偏低（圖2）?；颊叩艿?-II-2正常，男，7歲。

1.2 方法

1.2.1 樣本采集 經(jīng)患者及家屬知情同意，采集家系1、2患者和父母及部分正常個(gè)體外周血2 mL（EDTA-Na抗凝）。取得家系1患者基因結(jié)果后，抽取個(gè)體1-II-3妻子腹中胎兒1-III-1臍血1 mL（孕26+周時(shí)）。使用德國Qiagen公司生產(chǎn)的Qiamp DNA Blood Mini Kit提取試劑盒進(jìn)行基因組DNA提?。ú僮鞑襟E參照試劑盒說明書）。

1.2.2 脆性X綜合征基因檢測(cè) FMR1基因CGG三堿基重復(fù)數(shù)檢測(cè)，采用德國Roche公司生產(chǎn)的Expand Long Template PCR System試劑盒進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)條件：98 ℃ 10 min，循環(huán)數(shù)1；97 ℃ 35 s，64 ℃ 35 s，68 ℃ 4 min，循環(huán)數(shù) 10；97 ℃ 35 s，64 ℃ 35 s，68 ℃ 4 min（每個(gè)循環(huán)增加20 s），循環(huán)數(shù)25；68℃10 min。后經(jīng)毛細(xì)管電泳（ABI 3 500-XL測(cè)序儀）進(jìn)行片段長度判斷，最后計(jì)算CGG三堿基重復(fù)數(shù)。

圖1 兩個(gè)家庭的家系圖Fig.1 Pedigree for the two families

圖2 病例2-Ⅱ-1部分表型Fig.2 Photos of patient 2-Ⅱ-1

1.2.3 染色體核型分析 采用G顯帶技術(shù)對(duì)外周血進(jìn)行常規(guī)核型分析（500～550條帶）。

1.2.4 染色體微陣列分析（chromosome microarray analysis，CMA） 使用美國Affymetrix公司生產(chǎn)的CytoScan 750 k芯片和擴(kuò)增、雜交試劑盒進(jìn)行CMA檢測(cè)。參照Infinium HD Assay標(biāo)準(zhǔn)操作流程進(jìn)行操作，檢測(cè)結(jié)果使用Chromosome Analysis Suite（Ch AS；version 2.1）軟件進(jìn)行分析。結(jié)果判讀參照DGV、ISCA、OMIM、DECIPHER等數(shù)據(jù)庫。

1.2.5 醫(yī)學(xué)外顯子組測(cè)序 取質(zhì)檢合格的1 μg基因組DNA于Q800R超聲破碎儀中打斷，電泳質(zhì)檢打斷后DNA片段大小為500 bp以下，峰值在350 bp左右。參照KAPA library Preparation kit Illumina platforms條件及方法進(jìn)行文庫構(gòu)建：在DNA擴(kuò)增酶的作用下進(jìn)行末端修復(fù)，3’端加“A”，并在兩端加上特定序列的接頭，不同樣本連接不同序列的barcode，經(jīng)PCR對(duì)帶有接頭的文庫擴(kuò)增。Qubit測(cè)定文庫濃度，每例樣本取300 ng進(jìn)行混合。往混合后樣本中加入基于NimbleGen SeqCap技術(shù)的定制探針（Roche NimbleGen，Madison，Wis），雜交 24 h后，采用 Streptavidin Dynabeads進(jìn)行目標(biāo)區(qū)域捕獲，并將捕獲后產(chǎn)物進(jìn)行純化，PCR富集目標(biāo)區(qū)域基因。瓊脂糖凝膠電泳測(cè)定文庫大小，Qubit3.0及熒光定量PCR測(cè)定文庫濃度。將質(zhì)檢合格的文庫稀釋至上機(jī)測(cè)序濃度，使用Illumina Nextseq 500測(cè)序儀進(jìn)行測(cè)序分析。

1.2.6 捕獲區(qū)域CNV分析 使用NextGene對(duì)測(cè)序原始數(shù)據(jù)進(jìn)行轉(zhuǎn)換，生成質(zhì)控文件，對(duì)低質(zhì)量的測(cè)序數(shù)據(jù)（樣本編碼序列平均覆蓋度小于3×的數(shù)據(jù)）進(jìn)行剔除。然后，通過均一化計(jì)算，分析出單（多）個(gè)外顯子的拷貝數(shù)變化，方法依據(jù)Feng等［7］發(fā)表文獻(xiàn)，簡要如下：收集每個(gè)樣本的單個(gè)外顯子所有DNA單個(gè)堿基信號(hào)，得出單個(gè)外顯子的平均覆蓋深度，然后對(duì)比參考樣本中特定外顯子的覆蓋深度，進(jìn)而得到拷貝數(shù)變異數(shù)據(jù)。理論上，正常水平標(biāo)注為1，即正常；缺失一個(gè)拷貝標(biāo)注為0.5，即雜合缺失；缺失2個(gè)拷貝標(biāo)注為0，即純合/半合缺失。實(shí)際檢測(cè)到的雜合缺失平均值為0.55±0.07。參考序列版本號(hào)：GRCh37/hg19，根據(jù)美國醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)學(xué)會(huì)（American college of medical genetics，ACMG）指南［8］，對(duì) SNVs和 CNVs進(jìn)行評(píng)估和致病性分類。

2 結(jié)果

2.1 家系1

2.1.1 脆性X染色體綜合征基因檢測(cè) 首先對(duì)患者1-II-2進(jìn)行脆性X基因檢測(cè)，結(jié)果為陰性（結(jié)果未顯示）。

2.1.2 醫(yī)學(xué)外顯子組測(cè)序 考慮家系正常個(gè)體1-II-3妻子當(dāng)時(shí)已妊娠20周，為節(jié)省檢測(cè)時(shí)間，征得家屬同意后，行核心家系臨床醫(yī)學(xué)外顯子組（約4 000個(gè)已知致病基因）的綜合檢測(cè)和分析（1-I-1、1-I-2、1-II-2）。共檢測(cè)50 585 個(gè)編碼區(qū)，8 423 367 bp。平均覆蓋深度344×±218，大于10×覆蓋區(qū)間占99.1%，大于20×覆蓋區(qū)間占98.8%。結(jié)果發(fā)現(xiàn)患者1-II-2 7q36.3區(qū)域有約3.14 Mb的雜合缺失片段（chr7：155 595 594-158 738 470；圖3A），16p13.3區(qū)域有大約11.4 kb的雜合缺失片段（chr16：215997-227410；圖3B），同時(shí)19p13.3區(qū)域有大約330.8 kb的重復(fù)片段（拷貝數(shù)為3）（chr19：589946-920748；圖3C）。其中7q36.3區(qū)域3.14 Mb片段的雜合缺失和19p13.3區(qū)域330.8 kb片段的重復(fù)未在父母中檢測(cè)到，16p13.3區(qū)域11.4 kb片段的雜合缺失遺傳自母親。

圖3 利用NGS覆蓋深度進(jìn)行綜合CNV分析Fig.3 CNV analysis data after medical exome sequencing

圖4 家系2患者胞弟（2-II-2）外周血核型圖Fig.4 Karyotype of 2-II-2

2.1.3 染色體微陣列分析 為明確家系患者病因，根據(jù)高通量測(cè)序結(jié)果，對(duì)患者1-II-1、正常個(gè)體1-II-3及其妻子腹中胎兒1-III-1同時(shí)進(jìn)行了CMA檢測(cè)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)患者1-II-1存在7q36.2-q36.3區(qū)域約4.5 Mb的雜合缺失片段（chr7：154655991-159119707）合并19p13.3區(qū)域約841 kb的重復(fù)片段（chr19：260911-1102063）；正常個(gè)體1-II-3及其胎兒未檢測(cè)到明確異常。

2.2 家系2

2.2.1 醫(yī)學(xué)外顯子組測(cè)序 核心家系（2-I-1、2-I-2、2-II-1）進(jìn)行臨床醫(yī)學(xué)外顯子組（約4000個(gè)已知致病基因）綜合檢測(cè)和分析。共檢測(cè)50585個(gè)編碼區(qū)，8423367 bp。平均覆蓋深度220×±127，大于10×覆蓋區(qū)間占99.0%，大于20×覆蓋區(qū)98.7%。經(jīng)過CNVs分析（方法同2.1.2），發(fā)現(xiàn)患者2-II-1 9q33-q34區(qū)域有大約13.02 Mb的重復(fù)片段（拷貝數(shù)為 3）（chr9：127998871-141016451；圖3D），父母未檢測(cè)到明確異常。

2.2.2 染色體核型分析 為進(jìn)一步明確家系遺傳情況，對(duì)患者父母及弟弟進(jìn)行外周血染色體核型分析，發(fā)現(xiàn)患者父親2-I-1和弟弟2-II-2存在平衡易位：46，XY，t（3；9；q29；q33；圖4，父親核型未顯示），患者母親2-I-2核型未見異常。

3 討論

CNV的檢測(cè)大多通過染色體微陣列或高通量測(cè)序?qū)崿F(xiàn)。本文的病例所涉及的染色體區(qū)域均依據(jù)GRCh37/hg19數(shù)據(jù)庫。

家系1家族多發(fā)智障，兩個(gè)患者均為男性，脆性X染色體基因（FMR1基因CGG串聯(lián)重復(fù)）篩查陰性，患者1-II-2醫(yī)學(xué)外顯子組測(cè)序，發(fā)現(xiàn)三段CNV。其中16p13.3的11.4 kb缺失包含HBA2基因全長及HBM和HBA1基因的大部分，與α地中海貧血相關(guān)，同時(shí)該片段在患者母親中也被檢測(cè)到，該區(qū)域的缺失不是導(dǎo)致家系1患者智力低下的原因。由于與家系主要癥狀無關(guān)，未進(jìn)行家系其他個(gè)體CNV驗(yàn)證。7q36.3的3.14 Mb缺失和19p13.3的330.8 kb重復(fù)則出現(xiàn)于兩個(gè)病人中，患者1-II-2通過測(cè)序發(fā)現(xiàn)并在患者1-II-1通過CMA得到驗(yàn)證，1-II-3及其胎兒1-III-1均為陰性，兩人均無癥狀（胎兒已出生，隨訪時(shí)4個(gè)月大，暫未發(fā)現(xiàn)明顯異常）。7q36.3缺失區(qū)域含有5個(gè)OMIM基因，部分CNV缺失病例報(bào)道與本家系中患 者 癥 狀 類 似（nssv1604681，nssv706407，nssv1608164），且SHH和MNX1基因突變多表現(xiàn)為 顯 性 遺 傳（OMIM ID：600725，142994）［9-10］；19p13.3區(qū)域（chr19：589946-920748）含有 3個(gè)OMIM基因，報(bào)道較少。根據(jù)臨床表現(xiàn)及生物信息學(xué)分析，可以將7q36.3的缺失判定為疑似致病CNV，而19p13.3的重復(fù)則為意義不明。結(jié)合家系信息可推斷，該家系中父母之一可能存在7號(hào)和19號(hào)染色體的平衡易位，需要進(jìn)行后續(xù)熒光原位雜交（fluorescence in situ hybridization，F(xiàn)ISH）驗(yàn)證。

家系2通過醫(yī)學(xué)外顯子組測(cè)序發(fā)現(xiàn)2-II-1帶有9q33-q34重復(fù)，目前與9q33-q34區(qū)域重復(fù)相關(guān)的病例報(bào)道，描述的主要臨床癥狀有智力障礙、并指、室間隔缺損、蜘蛛樣指/趾等（DECIPHER ID：256749、269998）以及血液系統(tǒng)疾病或多系統(tǒng)畸形［11-12］。該家系患兒9q33-q34區(qū)域13.02Mb的重復(fù)片段，包含了LMX1B、LRSAM1、SPTAN1、COL5A1、NOTCH1、CARD9、EHMT1等OMIM致病基因。根據(jù)數(shù)據(jù)庫現(xiàn)有資料、患兒臨床表現(xiàn)及家系遺傳學(xué)分析，提示9q33-q34區(qū)域13.02 Mb的重復(fù)片段很可能是導(dǎo)致該家系患者表型的原因，判定該重復(fù)片段為疑似致病CNV。結(jié)合家系信息推斷，患者異常CNV來自父親發(fā)生易位的3號(hào)染色體，而弟弟同時(shí)遺傳了來自父親的2條易位染色體，為平衡易位攜帶者，無臨床癥狀。本家系患者未檢測(cè)到3q29區(qū)域缺失，可能由于該區(qū)域不涉及OMIM致病基因，高通量測(cè)序未有提示，需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

本文僅通過兩個(gè)不相關(guān)的案例，在不同疾病、不同個(gè)體中通過相同的醫(yī)學(xué)外顯子組測(cè)序技術(shù)分別發(fā)現(xiàn)了位于不同染色體區(qū)段的CNVs，得到了其他技術(shù)手段，如核型分析和染色體微陣列等的驗(yàn)證，并初步分析了與疾病的相關(guān)性。初步得到醫(yī)學(xué)外顯子組測(cè)序技術(shù)用于臨床罕見遺傳病輔助診斷的證據(jù)，由于染色體微缺失微重復(fù)等拷貝數(shù)變異可以分布于基因組中任何位置，因此，該技術(shù)的臨床應(yīng)用效果評(píng)價(jià)仍然需要更進(jìn)一步的大量數(shù)據(jù)和病例驗(yàn)證。

（致謝：感謝郭莉?qū)Ρ疚膱D4的提供；感謝兩個(gè)家系成員的信任和配合）