兩株禽綠膿桿菌的分離鑒定與致病性研究

翟晶晶，王珊，尹姣姣，韓麗娟，牛露露，牛宏澤，程倩倩，尹夢穎，車雨桐，張鼎，寧官保*，田文霞*

(1.山西農(nóng)業(yè)大學 動物科技學院，山西 太谷 030801；2.聞喜縣畜牧獸醫(yī)發(fā)展中心，山西 聞喜 043800)

綠膿桿菌(Bacilluspyocyaners)1882年首次由Gersard從傷口膿液中分離得到，也被稱銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)[1]。最近幾十年，隨著病情的加劇，由細菌引起的疾病主要體現(xiàn)為人口的急性暴發(fā)和死亡率升高，在醫(yī)院內的感染也逐漸增多，尤其在呼吸科及重癥監(jiān)護病房(ICU)是首要病原菌[2]，感染主要引起人的肺囊性纖維化，而對燒傷、泌尿道、傷口和血液感染的免疫功能低下患者更易被感染。綠膿桿菌是加拿大ICU患者的第三大易感病原菌[3]。經(jīng)調查，多種動物均可感染綠膿桿菌, 臨床上表現(xiàn)為雛雞敗血癥、鵪鶉化膿性肝炎、水貂出血性肺炎[4]、獐子麝囊化膿[5]、長臂猿化膿性角膜炎等，綠膿桿菌是這些病的原發(fā)性或并發(fā)性病原[6]。1926年Kaupp和Dearstyne從禽類分離到綠膿桿菌，1982年傅先強分離出綠膿桿菌[7]，當時就被列入傳染病。綠膿桿菌對于雞來說是條件性致病性菌，通常能在雞的腸道、呼吸道和卵中分離到，各個年齡段都易感染，致死率在1%～90%甚至更多[8]。雛雞暴發(fā)綠膿桿菌病應激是其中主要原因，免疫低下時更易感染，尤其現(xiàn)在集約化養(yǎng)殖規(guī)模的擴大，發(fā)病率更高[9]。為此，有必要在山西地區(qū)對禽綠膿桿菌的病原和流行情況做調查。

本試驗對臨汾、平遙等地患病死亡的病雞，無菌采集病變臟器進行綠膿桿菌分離培養(yǎng)，形態(tài)鑒定，生化試驗，16S rDNA序列分析，致病性動物試驗，藥敏試驗,為研究其致病機理及臨床禽綠膿桿菌病的治療和控制提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 病料來源

山西省臨汾、平遙等地送檢的28只病、死雞。病雞表現(xiàn)為精神沉郁和拉黃綠色糞便，死雞剖檢可見心尖、心外膜出血點，有的可見心臟被覆有淡黃色的纖維素性滲出物；肝臟局部顏色偏淡發(fā)黃；腎臟水腫，表面有彌漫的小出血點。

1.2 試驗材料

細菌生化微量鑒定管和藥敏紙片(杭州濱和微生物試劑有限公司)；分離用培養(yǎng)基(北京索萊寶科技有限公司)；Premix TaqTM、TaKaRa RNAiso plus(Trizol)(大連寶生物工程公司)；6×DNA loading buffer(北京索萊寶生物科技有限公司)；DNA ladder(中科瑞泰生物科技有限公司)；Agarose-G10(Biowest公司)；細菌基因組DNA提取試劑盒(天根生物科技有限公司)；細菌16SrDNA通用引物(上海捷瑞生物工程有限公司)；50×TAE Buffer購自北京博奧拓達科技有限公司；異丙醇、異戊醇、乙醚、氯仿、乙醇、氯化鈉、無菌去離子水等均為國產(chǎn)分析純試劑。

1.3 試驗動物

36只10日齡海蘭褐公雛雞和飼料，均購于山西省康牧養(yǎng)殖合作社。

1.4 細菌分離培養(yǎng)

無菌采取病、死雞的心、肝、脾、肺、腸、腎等病料平板劃線，37 ℃培養(yǎng)18 h，挑選單個典型的菌落繼續(xù)純培養(yǎng)。

1.5 生化和藥敏試驗

參照陳晨[10]的研究選擇17項生化指標對分離株進行測定。參照NCCLS方法手冊(2007年版)規(guī)定的標準進行藥敏試驗。

1.6 16S rDNA引物及PCR擴增

根據(jù)LAU等[11]合成16S rDNA基因特異性通用引物(表1)。使用天根細菌基因組DNA提取試劑盒，經(jīng)過蛋白酶k的裂解、結合、洗滌和洗脫等步驟提取綠膿桿菌的DNA作為模板。PCR反應體系為：Premix TaqTM12.5 μL，PCR Forward Prime 1 μL，PCR Reverse Prime 1 μL，菌株DNA模板2 μL，最后補充去離子水至35 μL。設定反應條件進行PCR擴增。

表1 PCR擴增引物序列Table l Primer sequences used in the PCR analysis

注：F為上游引物；R為下游引物。

Note：F: Forward primers, R: Reverse primers.

1.7 16S rDNA的基因序列分析

將分離菌株測序結果通過NCBI選擇Blast進行比對，利用DNAStar軟件Clustal方法將其與GenBank中登錄的參考菌株進行同源性和系統(tǒng)發(fā)育分析。

1.8 致病性試驗

本研究選取2株綠膿桿菌分離株分別命名為G1和G2,通過在瓊脂培養(yǎng)基和麥康凱培養(yǎng)基上平板劃線，獲得純培養(yǎng)物。將在山西省康牧養(yǎng)殖合作社購買的36只10日齡海蘭褐公雛雞隨機分為3大組，每組12只雞，第1和第2組為試驗組，第3組為對照組，并將對照組雞隔離飼養(yǎng)。每組又隨機分3個小組，每小組4只雞。試驗第1組和第2組的雞依次對應接種0.5 mL的綠膿桿菌菌懸液，將兩株菌原液調整含菌量為5×l08CFU· mL-1。第1組和第2組的3個小組依次對應接種0.5 mL的一株分離菌原液、10-1稀釋菌懸液、10-2稀釋菌懸液；對照組雞分別接種0.5 mL肉湯，接種途徑為腿部肌肉注射。每天上午8點、11點，下午2點、5點進行飼喂、觀察雞的飲食情況、精神狀況、記錄雞死亡數(shù)、發(fā)病情況，并對死亡雞進行剖檢，對10 d后仍存活的雞只進行全部剖檢，觀察病變并做細菌分離培養(yǎng)，分別采集心、肝、脾、肺、腸、腎、腹腔和腿部肌肉進行細菌的分布檢測。無菌取試驗死亡組和對照組雛雞的心、肝、脾、肺、腎、腸，并用4%多聚甲醛固定，梯度脫水，試驗組織進行常規(guī)石蠟包埋，切片，HE染色。

2 結果與分析

2.1 細菌分離培養(yǎng)及染色鏡檢結果

本試驗共分離到11株細菌，其中2株菌落形態(tài)相似、生長均一致，分別命名為G1、G2。2株分離菌在營養(yǎng)瓊脂平板上均形成濕潤、光滑、圓形、扁平的菌落(圖1 A)，培養(yǎng)基表面有淡淡的藍色光澤，菌落有特殊氣味，血瓊脂平板上呈β溶血(圖1B)；肉湯均勻混濁，上層呈黃綠色，有細絲狀懸浮物，有菌膜覆蓋；42 ℃也可正常生長。2株均為革蘭陰性，鏡下觀察到細長且長短不一的短桿菌，兩端鈍圓，單個或成對排列(圖1C)。

圖1 分離菌培養(yǎng)特性及形態(tài)觀察Fig.1 Culture characteristics of the bacteria isolates and their morphological observation 注：A：分離菌在營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上菌落形態(tài)；B：分離菌在血瓊脂培養(yǎng)基上菌落形態(tài)； C：分離菌鏡檢結果。Note：A：Characteristics of colony morphologyon nutrient agar medium； B：Characteristics of colony morphologyon blood agar medium；C：Microscopic structure of the isolates after Gram staining.

2.2 生化鑒定結果

生化試驗結果顯示(表2)，G1和G2分解葡萄糖；尿素陽性，硝酸鹽還原試驗陰性；明膠液化試驗陽性；有運動性。

表2 分離菌株的生化試驗結果Table 2 The biochemical test results of the isolates

注：+ 表示陽性，-表示陰性。

Note: + Shows positive, - Shows negative.

2.3 藥敏試驗結果

藥敏試驗結果顯示綠膿桿菌均對環(huán)丙沙星、恩諾沙星、諾氟沙星、甲磺胺諾氟沙星、哌拉西林、替卡西林以及亞安培南這些藥物敏感；對頭孢拉定、頭孢噻肟鈉、阿奇霉素這些藥物中度敏感；對鏈霉素和阿莫西林、慶大霉素、利福平這些藥物耐藥(表3)。

2.4 16S rDNA序列測定及分析結果

2株分離菌用通用引物擴增出的片段均與預期(1 500 bp)一致(圖2)。

結果發(fā)現(xiàn)G1和G2株分離菌與銅綠假單胞細菌關系最近，序列相似性與PseudomonasaeruginosaKJ191560達到100%，可以將其歸為銅綠假單胞菌(圖3)。根據(jù)序列比較結果繪制了遺傳系統(tǒng)發(fā)育樹(圖4)。遺傳發(fā)育樹結果顯示，本試驗分離的2株細菌，G1與PseudomonasaeruginosaKT59007屬于同一分支，與PseudomonasaeruginosaKJ191 560株親源最高,G2與PseudomonasaeruginosaHM067869.1屬于同一分支。

表3 2株分離菌株的藥敏實驗結果Table 3 Antibiotic Susceptibility test of 2 bacteria isolates

注：S為敏感；I為中度敏感；R為耐藥。

Note: S Susceptibility; I Intermediate Susceptibility; R Resistance.

圖2 2株綠膿桿菌16S rDNA基因PCR擴增結果Fig.2 Amplification results of 2 strains of 16S rDNA gene of Pseudomonas aeruginosa注：M：D2000 DNA ladder 1：陰性對照；2：G1；3：G2。Note：M: D 2 000 DNA Marker 1: Negative control; 2: G1; 3:G2.

2.5 致病性試驗結果

G1株第1小組雞在接種后的12～24 h內死亡100%，第2小組雞在36 h發(fā)生死亡，死亡率為75%，第3小組雞在接種后第3天開始出現(xiàn)死亡，癥狀不太明顯，死亡率為50%。對照組連續(xù)觀察10 d無明顯臨床癥狀。G2株第1小組雞在接種后的12～24 h內死亡100%，第2小組雞在36 h發(fā)生死亡，死亡率25%，第3小組雞未出現(xiàn)死亡,對照組連續(xù)觀察10 d無明顯臨床癥狀。說明G1株綠膿桿菌在5×108CFU·mL-1時對雛雞的致病力最高，G2株對雛雞的致病力弱于G1。在心、肝和肺中分離到了綠膿桿菌，其中肺部分離出的綠膿桿菌含量最多。用雛雞致病性試驗顯示綠膿桿菌對雛雞的致病力相對較強。

2.6 死亡雛雞的剖檢變化

剖檢死亡病雞發(fā)現(xiàn)有的雛雞心臟出現(xiàn)心包膜混濁，嚴重的心冠脂肪膠凍樣水腫；腺胃外壁淤血(圖5A，箭頭指示處)，內壁有出血點，粘膜變厚；肝臟表面光滑，部分淤血肝下側明顯色淡、發(fā)黃，脂肪變性(圖5B，箭頭指示處)；肺單側或雙側腫大，部分肺臟出血發(fā)炎；腸道內壁有不同程度的出血點；腎臟表面有淤血，部分腎臟單側或雙側腫大，嚴重的腎臟出血壞死，輸尿管有灰白色尿酸鹽沉淀(圖5C，箭頭指示處)；切開表皮可見到有淡黃色膠凍樣滲出物；關節(jié)發(fā)炎腫大。

圖5 死亡雛雞的剖檢變化Fig.5 The necropsy change of dead chick’s organs注：A 腺胃 B 心臟、肝臟 C 腎臟。Note：A Glandular stomach B Heart and liver C Kidney.

2.7 死亡雛雞的組織病理學變化

死亡雛雞的心肌局部出血，出血灶區(qū)域肌纖維之間被紅細胞撐開(圖6 A，箭頭指示處)，橫紋消失，心肌壞死；腎出血，紅細胞較多(圖6B，箭頭指示處)，有的腎細胞出現(xiàn)水腫，嚴重的腎小管壞死；肝臟胞腔內出現(xiàn)明顯的空泡，脂肪變性(圖6C，箭頭指示處)，細胞核和細胞漿不清楚，少量細胞核顏色變淺出現(xiàn)濃縮，表現(xiàn)為壞死；其它組織器官未見明顯病變。

圖3 序列比對結果Fig.3 The result of sequence alignment

圖4 根據(jù)PA繪制的遺傳發(fā)育樹Fig.4 Phylogenetic tree based on PA sequences

圖5 死亡雛雞的剖檢變化Fig.5 The necropsy change of dead chick’s organs注：A 腺胃 B 心臟、肝臟 C 腎臟。Note：A Glandular stomach B Heart and liver C Kidney.

圖6 人工感染綠膿桿菌死亡雛雞主要器官的組織病理學觀察(400×)，HE染色Fig.6 Observation of histopathological changes in tissues of dead chicks infected with Pseudomonas aeruginosa (400×), hematoxylin and eosin stain注：A心臟B腎臟C肝臟。Note：A Heart B Kidney C Liver.

3 討論

綠膿桿菌分布廣泛，據(jù)報道已有多種動物被感染，且癥狀不一[12, 13]，其中集約化養(yǎng)殖感染率較高，常見癥狀為敗血癥、肺炎、關節(jié)炎，嚴重引起死亡，導致養(yǎng)殖場損失慘重。感染綠膿桿菌表現(xiàn)出不一樣的癥狀，與其相關的毒力因子有關，受不同的毒力因子調節(jié)，造成綠膿桿菌的復雜性[14]。外毒素、胞外酶、菌毛、彈性蛋白酶等都是重要的毒力因子[15]。養(yǎng)雞場易感染綠膿桿菌，主要是雛雞感染，孵化室感染，主要是由于1日齡時注射馬立克疫苗或在7日齡時注射油苗致創(chuàng)傷而感染，引起死亡。本次臨汾、平遙雞場270日齡和161日齡的海蘭褐感染綠膿桿菌，引起精神不振，呼吸困難，產(chǎn)蛋量下降，發(fā)病的日齡范圍擴大，需引起養(yǎng)殖場高度重視。本次病雞組織中所分離的2株綠膿桿菌，細菌分離培養(yǎng)及染色鏡檢結果與張香齋等[16]對綠膿桿菌形態(tài)特征的描述一致，生化試驗結果與周學章等[17]對綠膿桿菌的生化特性描述一致，遺傳發(fā)育樹結果顯示分離株G2與PseudomonasaeruginosaHM067869.1屬于同一分支[18]，藥敏試驗結果高度敏感的藥物有鏈霉素、慶大霉素、鹽酸環(huán)丙沙星、鹽酸恩諾沙星、乳酸諾氟沙星、甲磺胺諾氟沙星、哌拉西林、替卡西林及亞安培南等，目前碳青霉烯類藥物多用于人醫(yī)臨床治療綠膿桿菌感染[19]。2株綠膿桿菌對頭孢拉啶、頭孢噻肟鈉等頭孢菌素類藥物有耐藥性，綠膿桿菌耐藥是由其天然耐藥引起，還是由臨床頻繁用藥引起，還有待于進一步考證[20]，因此，為嚴禁濫用抗生素，臨床上治療雛雞綠膿桿菌病之前，需進行藥敏試驗篩選出敏感藥物[21]，以減少因耐藥造成的經(jīng)濟損失。

4 結論

本研究從山西臨汾、平遙兩規(guī)?；B(yǎng)殖場病雞中，成功分離鑒定出2株致病性較強的綠膿桿菌，對環(huán)丙沙星、恩諾沙星、亞胺培南、哌拉西林和替卡西林等抗生素敏感，為繼續(xù)深入研究家禽綠膿桿菌病的致病性及制定防控措施提供理論支持。