杜亞麗，徐凱，龍登隆，李新宇，王春梅，蘭俊，趙慧婷，姜玉鎖*

(1.山西農業(yè)大學 動物科技學院，山西 太谷 030801；2.山西農業(yè)大學 生命科學學院，山西 太谷 030801)

昆蟲嗅覺識別過程需要多種蛋白的參與，其中嗅覺受體(olfactory receptors，ORs)能夠介導化學物質(包括各種信息素和植物性氣味)與嗅覺神經(jīng)元(olfactoty sensory neurons，OSNs)的特異性結合，對于配偶、同伴、食物和產(chǎn)卵場所的選擇至關重要[1]。中華蜜蜂(Apisceranacerana)是我國特有的當家蜂種，具有敏銳的嗅覺和較強的抗逆能力，善于搜尋零散的蜜粉源，適于在我國的高寒山區(qū)進行定地飼養(yǎng)[2]。研究中華蜜蜂普通嗅覺受體有利于我們進一步了解中華蜜蜂的氣味識別機制，為其科學飼養(yǎng)管理提供新的理論指導。昆蟲ORs在嗅覺神經(jīng)元樹突膜上特異性表達，一般由300～450個氨基酸組成，含有7個α-螺旋跨膜結構域，N-末端在細胞膜內，C-末端在細胞膜外，這與脊椎動物的G蛋白偶聯(lián)受體(G-protein-coupled receptors，GPCR)的膜拓撲學結構相反。目前已在鱗翅目、雙翅目、膜翅目和鞘翅目等多種昆蟲中鑒定出了嗅覺受體基因。其中，從膜翅目昆蟲西方蜜蜂Apismellifera[3]、麗蠅蛹集金小蜂Nasoniavitripennis[4]、阿根廷蟻Linepithemahumile[5]、紅色收獲蟻Pogonomyrmexbarbatus[6]、佛羅里達弓背蟻Camponotusfloridanus[7]、印度跳蟻Harpegnathossaltator[8]、東方蜜蜂Apiscerana[9]、小蜜蜂Apisflorea[10]、蘭州熊蜂Bombuslantschouensis[11]中分別篩選獲得了170、301、367、344、407、377、119、180、165個ORs。昆蟲的嗅覺神經(jīng)元通常表達兩類嗅覺受體：一類是傳統(tǒng)嗅覺受體ORs，該類受體主要用于識別普通氣味分子和信息素，其同源性較低，僅在少部分嗅覺神經(jīng)元中低豐度表達。另一類是非典型嗅覺受體Orco(olfactory receptor co-receptor)，該類受體不能直接識別氣味，但是可以協(xié)助ORs精確定位到神經(jīng)元樹突膜上而提高ORs對氣味分子的敏感性，其高度保守，在大多數(shù)神經(jīng)元中均有表達。按配體結合差異特性又將ORs分為識別普通揮發(fā)性氣味分子的普通嗅覺受體(general olfactory receptors)和識別性信息素的性信息素受體(pheromone receptors)兩類。在對岡比亞按蚊Anophelesgambiae、煙芽夜蛾Heliothisvirescens和黑腹果蠅Drosophilamelanogaster的研究中發(fā)現(xiàn)，缺失Orco后會降低昆蟲對氣味的敏感性，重新導入后又逐漸恢復正常[12]。ORs通常與Orco以異源二聚體的形式組成一個配體門控離子通道，將環(huán)境中的小分子化學信息物質所攜帶的信息轉化為電信號，刺激嗅覺神經(jīng)元產(chǎn)生動作電位并傳至腦部的觸角葉，使昆蟲感知到外界氣味進而做出相應的行為反應。不同ORs對不同類氣味的反應譜也不同。例如，意大利蜜蜂AmelOR11在雄蜂中表達并特異性地識別反式-9-氧代-癸二烯酸(9-ODA)[13]，綠盲蝽AlucOR40只對反-2-己烯醇有特異性反應[14]，小菜蛾PxylOR9只對植物揮發(fā)物β-紫羅蘭酮的刺激具有反應[15]，而黑腹果蠅DmelOR67能被大多數(shù)氣味分子激活[16]，豆桿野螟OscaOR3對種內和近緣種的性信息素都有反應[17]，中華蜜蜂AcerOR1能廣泛地識別丁香酚、月桂酸、橙花醇等9種花香物質[18]。不同昆蟲普通嗅覺受體基因間的同源性比較低，使用同源克隆技術很難獲得目的基因序列，而目前對中華蜜蜂普通嗅覺受體的研究報道還相對較少。克隆獲得了AcerOR141的cDNA序列，并對其編碼蛋白的結構進行預測分析，明確其在工蜂不同發(fā)育階段各組織中的mRNA表達情況，為中華蜜蜂普通嗅覺受體的功能研究提供理論參考。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

試驗用中華蜜蜂A.c.cerana于2018年5-7月份在山西農業(yè)大學動物科技學院實驗蜂場進行樣本的標記及收集工作。選擇群勢較強、健康無病的正常蜂群，抽出2張成熟的封蓋子脾(可看到有正在出房的新蜂)置于恒溫培養(yǎng)箱中(T(34±1) ℃；RH(75±5)%)。次日，使用專用記號筆在新蜂背部進行標記(約3 000只)，20 min后放回原來的蜂群。剛出房的新蜂記為1日齡，之后每5 d采一次樣，每次270只，隨機分為3組，分離觸角、頭(去除觸角)、胸(去除足和翅膀)、腹、足和翅膀等組織，迅速投入液氮冷凍后置于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 主要試劑與試劑盒

TRIzol?Reagent購自美國Invitrogen公司；克隆載體pGEM?-T Easy，化學感受態(tài)細胞JM109和凝膠回收試劑盒Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System購自美國Promega公司；PrimeScriptTMRT Reagent Kit with gDNA Eraser (Perfect Real Time)，RNase-free water，SYBR?Premix Ex TaqTMII (Tli RNaseH Plus)和DL 2000 DNA Marker購自日本Takara公司；2×Easy Taq PCR SuperMix(-dye)和GelStain購自北京全式金生物技術有限公司；低熔點瓊脂糖購自西班牙Biowest公司；酵母粉和胰蛋白胨購自英國Oxoid公司；50×TAE Buffer，Ampicillin，IPTG，X-Gal和固相清除劑等試劑均購自北京EBT生物公司；甲醇、無水乙醇、異丙醇、氯仿等分析純購自天津天力化學試劑有限公司。

1.3 總RNA的提取和cDNA的合成

參照TRIzol試劑說明書提取1.1中收集的成蜂不同發(fā)育階段各組織的總RNA，并利用瓊脂糖凝膠電泳和ND-1000(NanoDrop，美國)進行質量和濃度測定。以1 μg總RNA為模板反轉錄合成cDNA，測定濃度后4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 引物設計

依據(jù)轉錄組分析得到的Unigene序列，利用Primer 3.0 plus在線程序(http://www.bioinformatics.nl/cgi-bin/primer3plus/primer3plus.cgi)設計用于擴增目的基因序列的引物；根據(jù)分析獲得的ORF序列，利用Primer Premier 5.0軟件設計用于qRT-PCR的特異性引物。內參基因為NCBI上獲得的AcerArp1(HM640276.1)。引物詳細信息見表1。

表1 引物信息Table 1 The information of primers

1.5 基因克隆

以中華蜜蜂觸角cDNA為模板，使用2×Easy Taq PCR SuperMix(-dye)，在ABI VeritiTM96 well PCR system中進行PCR擴增。反應程序設定為：94 ℃ 4 min；94 ℃ 30 s，X ℃(退火溫度X詳見表1)30 s，72 ℃ 30 s，擴增循環(huán)35次；72 ℃ 8 min。擴增產(chǎn)物用1.0%瓊脂糖電泳分離后，利用Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System試劑盒進行目的片段的回收，將其連接到pGEM?-T Easy載體后進行雙向測序(由北京華大基因科技有限公司完成)。

1.6 序列分析

使用EditSeq工具查找并翻譯AcerOR141的ORF區(qū)，運用在線工具ProtParam(http://web.expasy.org/cgi-bin/protparam/protparam)分析AcerOR141的基本理化性質；TMHMM-2.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)預測該蛋白的跨膜區(qū)域；SignalP 4.1(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)查找含有的信號肽序列；Conserved Domains(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)分析存在的保守區(qū)域；CBS Prediction Servers(http://www.cbs.dtu.dk/services/)分析潛在的糖基化和磷酸化位點；SMART(http://smart.embl-heidelberg.de/)分析功能結構域；CELLULAR(https://cello.life.nctu.edu.tw/)進行亞細胞定位。將其編碼的氨基酸序列導入在線軟件PSIPRED(http://bioinf.cs.ucl.ac.uk/psipred/)預測二級結構。Blastx(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)查找同源的氨基酸序列后，使用MEGA6.0軟件中的ClustalW比對氨基酸序列，采用NJ法構建系統(tǒng)進化樹，Bootrap值為1 000。

1.7 AcerOR141表達量的檢測

以1.3中獲得的cDNA為模板進行熒光定量PCR檢測。qRT-PCR反應體系包括：SYBR?Premix Ex TaqTMII(2×)7.5 μL，上、下游引物(10 μM)各0.6 μL，cDNA模板100 ng，ROX Reference Dye II(50×)0.3 μL，ddH2O補至15 μL。反應程序為：95 ℃ 30 s；接著進行45個循環(huán)：95 ℃ 30 s，62 ℃ 34 s。每個樣品進行3次平行。應用MXPro-MX3000P軟件分析標準曲線及擴增曲線的Ct值，采用2-△△Ct法進行數(shù)據(jù)處理，結果以平均數(shù)±標準誤(Mean±SE)表示。通過SPSS17.0軟件進行方差分析(ANOVA)，接著采用Duncan′s法進行多重比較，最后利用GraphPad Prism 6.0軟件作圖。

2 結果與分析

2.1 基因克隆與測序分析

用設計的引物對目的基因進行擴增(圖1)，隨后進行克隆和測序。利用DNAStar軟件中的SeqMan工具拼接測序結果，獲得的cDNA序列全長為1 657 bp，包括303 bp的5′非編碼區(qū)(5′UTR)、1 299 bp的完整開放閱讀框(ORF)和55 bp的3′非編碼區(qū)(3′UTR)，共編碼432個氨基酸(圖2)。經(jīng)Blastp比對發(fā)現(xiàn)，推測的氨基酸序列與西方蜜蜂AmelOR141一致性為91%，因此確定該序列為中華蜜蜂AcerOR141基因，并提交至NCBI數(shù)據(jù)庫(GenBank登錄號為：KT246483.1。)

圖1 AcerOR141基因擴增結果Fig.1 Amplification results of AcerOR141 注：M，DNA分子量標準；1，2和3泳道分別為720、405、1 063 bp。Note：M, DNA Marker; Lane 1, 2 and 3 are 720, 405 and 1 063 bp, respectively.

2.2 理化特性和結構分析

ExPASy ProtParam在線分析表明，AcerOR141蛋白分子式為C2259H3533N563O624S24，分子量大小為49.33 kDa，理論等電點為8.74，為堿性蛋白。在組成AcerOR141蛋白的20種氨基酸中，亮氨酸(Leu)所占比例最高，達12.3%；色氨酸(Trp)和脯氨酸(Pro)所占比例最低，為1.6%；帶正、負電荷的氨基酸總數(shù)分別為40和33?？偲骄H水性系數(shù)、脂溶指數(shù)、不穩(wěn)定系數(shù)分別為0.306、106.06、37.07，表明AcerOR141是一種穩(wěn)定的脂溶性蛋白。

AcerOR141蛋白無信號肽，具有7個跨膜結構，分別位于第37～59，69～91，130～152，208～230，309～331，341～363，406～428位氨基酸之間，且N端位于胞內，C端位于胞外(圖3)。該蛋白的氨基酸序列中，第184～421位間有一個昆蟲嗅覺受體7tm-6 superfamily的保守結構域(E值：1.00e-29)。AcerOR141氨基酸序列中不含有O-糖基化位點，但存在4個潛在的N-糖基化位點，為第61、64、164和322位的天冬酰胺(Asn)殘基；含有15個潛在的磷酸化位點，包括7個蘇氨酸殘基(Thr6,124, 222, 268, 274, 308, 334)、3個酪氨酸殘基(Tyr199, 340, 378)和5個絲氨酸殘基(Ser119, 240, 272, 279, 319)。亞細胞定位結果表明，AcerOR141為細胞質膜蛋白(Plasma Membrance)的可能性為0.997。二級結構預測結果顯示，AcerOR141編碼的蛋白以α-螺旋(helix)為主，占68.52%；β-折疊(strand)和卷曲環(huán)(coil loop)所占比例分別為28.94%和2.55%。

2.3 序列比對和進化樹分析

利用Blastp找到與AcerORs同源蛋白的氨基酸序列，其中，AmelOR141和AmelOR13a-like的氨基酸序列一致性為99%，蛋白結構相似，應該為同一個基因。中華蜜蜂與其它膜翅目昆蟲的ORs氨基酸序列一致性差異較大，在43%～97%之間。從圖4可以看出，所有膜翅目的ORs分為兩大分支：即蜜蜂科的中華蜜蜂AcerOR141、西方蜜蜂AmelOR141和AmelOR13a-like、大蜜蜂AdorOR56a-like、小蜜蜂AfloOR85e、熊蜂BimpOR49b-like、地熊蜂BterOR13a、回條蜂HlabOR13a-like、蘆蜂CcalOR49b-like與苜蓿切葉蜂MrotOR92a為一大分支；蟻科的牛角刺槐蟻PgraOR49b-like、北方粗切葉蟻TsepOR49b-like、佛羅里達弓背蟻CfloOR13a、育菌蟻CcosOR49b-like和紅色收獲蟻PbarOR49b-like聚為另一大分支。

圖2 AcerOR141基因cDNA和氨基酸序列Fig.2 cDNA and amino acid sequences of AcerOR141 注：紅色方框表示起始和終止密碼子，紅色下劃線表示跨膜區(qū)，箭頭方向表示膜內。TMD1-7：跨膜結構域1-7。Note: The start and stop codons are shown by the red box; the transmembrane regions are indicated by a red line down the sequences; the direction of arrowheads represents the inside of membranes. TMD1-7, the number of transmembrane region.

圖3 AcerOR141跨膜區(qū)域預測圖Fig.3 AcerOR141 transmembrane region prediction

2.4 AcerOR141基因時空表達分析

工蜂羽化出房后不同日齡各組織中AcerOR141 mRNA的表達情況見圖5。綜合各發(fā)育階段的組織特異性分布模式可發(fā)現(xiàn)，AcerOR141 mRNA在工蜂觸角和頭部的表達量較高，且極顯著高于其他組織(胸、腹、足和翅膀)(P<0.01)，在其它組織中僅有微量的表達。1、15、25和30日齡工蜂觸角中AcerOR141的表達量最高，極顯著高于其它組織(P<0.01)；頭部的表達量次之，其余組織之間無明顯差異(P>0.05)。5、10和20日齡工蜂頭部的表達量最高，觸角次之，均極顯著高于其它組織(P<0.01)。觸角和頭部不同日齡的表達模式(圖5)顯示，AcerOR141在不同日齡的表達量差異較大。工蜂頭部的表達量在1日齡時較低，之后大幅上調，5日齡達到最高，隨后又逐漸下降，20日齡緩慢增加，之后又突然下降，與1日齡表達量無顯著差異(P>0.05)。觸角的表達趨勢與之基本一致，變化幅度較小，且10日齡表達量達到最高，極顯著高于其它日齡(P<0.01)。

圖4 幾種膜翅目昆蟲ORs的系統(tǒng)進化樹Fig.4 Phylogenetic tree of ORs from several Hymenoptera insects 注：各蛋白的來源、登錄號The source and accession number of various protein sequence: AcerOR141, 中華蜜蜂Apis cerana cerana (ALR87041.1); AmelOR141, 西方蜜蜂Apis mellifera (Robertson and Wanner, 2006); AdorOR56a-like, 大蜜蜂Apis dorsata (XP_006608157.1); AmelOR13a-like (XP_006563645.1); AfloOR85e, 小蜜蜂Apis florae (XP_012339623.1); BimpOR49b-like, 熊蜂Bombus impatiens (XP_003486905.2); BterOR13a, 地熊蜂Bombus terrestris (XP_003401155.2); HlabOR13a-like, 回條蜂Habropoda laboriosa (XP_017796563.1); CcalOR49b-like, 蘆蜂Ceratina calcarata (XP_017889358.1); MrotOR92a, 苜蓿切葉蜂Megachile rotundata (XP_003705978.2); PgraOR49b-like, 牛角刺槐蟻Pseudomyrmex gracilis (XP_020293473.1); TsepOR49b-like, 北方粗切葉蟻Trachymyrmex septentrionalis (XP_018356899.1); CfloOR13a, 佛羅里達弓背蟻Camponotus floridanus (XP_011252458.2); CcosOR49b-like, 育菌蟻Cyphomyrmex costatus (XP_018407571.1); PbarOR49b-like, 紅色收獲蟻Pogonomyrmex barbatus (XP_011639928.1).

3 討論

一般認為，昆蟲嗅覺受體ORs的典型結構特征是含有7個α-螺旋跨膜結構域，但不屬于G蛋白偶聯(lián)受體。在實驗室前期中華蜜蜂觸角轉錄組測序數(shù)據(jù)的基礎上，本研究克隆得到了嗅覺受體基因AcerOR141的全長序列。生物信息學分析表明，AcerOR141編碼432個氨基酸，無信號肽序列，具有7個跨膜結構且N-端位于胞內。這與棉鈴蟲HarmOR29[19]、小菜蛾PxylOR17[20]、綠盲蝽AlucOR40[14]、中華蜜蜂AcerOR2[21]、AcerOR10[22]和AcerOR35[23]的預測結果相一致，因此我們可以確定AcerOR141為中華蜜蜂的嗅覺受體基因。序列比對和進化樹分析結果顯示蜜蜂科和蟻科嗅覺受體序列保守性較低，親緣關系較遠，這與嗅覺受體具有多樣性和物種特異性的特征是一致的。

圖5 AcerOR141在工蜂不同發(fā)育階段、不同組織中的差異性表達Fig.5 The differential expression of AcerOR141 at different developmental stages and in different tissues of workers 注：An，觸角；H，頭(去除觸角)；T，胸(去除足和翅膀)；Ab，腹；L，足；W，翅膀；1 d～30 d：成年工蜂的日齡。柱上不同大寫字母表示同一日齡工蜂不同組織間AcerOR141 mRNA的表達差異極顯著(P<0.01)，小寫字母表示工蜂同一組織不同日齡間AcerOR141 mRNA的表達差異極顯著(P<0.01)。Note: An: Antenna; H: Head without antenna; T: Thorax without legs and wings; Ab: Abdomen; L: Legs; W: Wings; 1 d～30 d: day-ages of adult worker bees. Significant difference at 0.01 level in the expression of AcerOR141 mRNA between tissues of same day-ages was shown by different upper-case, and significant difference in the expression of AcerOR141 mRNA in antenna and head between day-ages was shown by different lower-case.

在生物體內，翻譯得到的蛋白需要進行不同的修飾加工，修飾方式調控著蛋白質的生物功能。N-糖基化修飾是一種新生肽鏈的共翻譯或翻譯后修飾方式，將糖鏈與天冬酰胺的自由基-NH2基連接，可顯著增加蛋白結構的穩(wěn)定性，在蛋白質的折疊和轉運等生理過程中起重要作用[24]。AcerOR141含有的4個N-糖基化位點可能會增加AcerOR141的構象穩(wěn)定性，改變其生物活性。此外，蛋白質磷酸化是調節(jié)和控制蛋白質活性和生物功能的一種普通的調節(jié)方式，在酶的催化作用下將磷酸基團連接到底物蛋白質的絲氨酸、酪氨酸和蘇氨酸上，在細胞信號傳遞過程中發(fā)揮著重要作用[25]。AcerOR141包含15個潛在的磷酸化位點，這可能與嗅覺識別過程中電生理信號的轉導有關。

昆蟲基因的表達模式在一定程度上能夠反映其相應的生物學功能[26]。性信息素受體一般在雄蟲觸角中特異性高表達，而普通嗅覺受體的表達分布范圍較廣。本研究qRT-PCR結果顯示，工蜂觸角和頭中AcerOR141 mRNA的表達量均極顯著高于其他組織(P<0.01)，這說明AcerOR141可能屬于普通嗅覺受體。嗅覺受體表達于嗅覺感器神經(jīng)元內，而觸角是昆蟲重要的嗅覺器官，其上密布著豐富的嗅覺感器[1]，因此，AcerOR141在觸角中高表達與其推測的嗅覺受體的生理功能是一致的。本課題組前期研究的中華蜜蜂AcerOR1、AcerOR35、AcerOR96、AcerOR113和AcerOR167均在工蜂觸角中特異性高表達[23, 27～29]。此外，昆蟲頭部的口器附肢表面也分布著大量的感覺器，內部有腦、消化道前端、與附肢相關的肌肉和神經(jīng)等，是昆蟲重要的感覺和攝食中心[30]。中紅側溝繭蜂MmedOR6和MmedOR10在觸角、頭和足中均有表達，可能參與棲息場所選擇和天敵躲避等行為[31]。小菜蛾PxylOR16、PxylOR17和PxylOR18除觸角之外，在頭、下唇須和喙中有較高的表達，推測其能夠識別普通氣味物質[20]。致倦庫蚊CquiOR118高表達于雌蚊頭部，可能參與宿主的搜尋、定位等行為[32]。中華蜜蜂AcerOR141在頭部也有相對較高的表達，推測其可以用頭部來感受外界環(huán)境中的化學物質。

工蜂承擔蜂群內除繁殖以外的所有工作，且根據(jù)日齡的不同進行明確的勞動分工。一般來說，1～3日齡的幼蜂主要從事清理巢房和封蓋幼蟲的工作；4～12日齡主要承擔照顧蜂王和幼蟲、調制日糧等工作；13～18日齡主要進行泌蠟造脾的工作，后期的主要任務是巢門防守；19～21日齡之后開始出巢采集花粉、花蜜、水和樹膠等，稱為采集蜂[33]。本研究發(fā)現(xiàn)25和30日齡采集蜂頭部中AcerOR141的表達量較低，極顯著低于觸角(P<0.01)，這可能與采集蜂主要參與外出采集工作，生理上逐漸發(fā)生退化，腦部出現(xiàn)氧化損傷、神經(jīng)元減退等現(xiàn)象，嗅覺記憶功能顯著喪失密切相關[34]。

4 結論

本研究成功獲得了中華蜜蜂嗅覺受體基因AcerOR141 cDNA序列。生物信息學分析結果表明AcerOR141具有昆蟲嗅覺受體的典型特征。時空表達結果顯示，AcerOR141 mRNA在工蜂觸角和頭部的表達較高，極顯著地高于其他組織(P<0.01)，在胸、腹、足和翅膀中僅有微量的表達，暗示該基因屬于普通嗅覺受體，其可能在普通氣味組分的識別過程中發(fā)揮重要作用，具體功能還有待進一步研究。