郭剛 陳文政 張帆 張旭

1中國人民解放軍總醫(yī)院泌尿外科100853北京

腎上皮樣血管平滑肌脂肪瘤（epithelioid ano?myolipoma，EAML）為腎血管平滑肌脂肪瘤的少見亞型，是一種來源于血管周上皮樣細胞的間葉性腫瘤[1-2]。腎EAML在臨床少見，文獻多見于個案報道，該類腫瘤具有惡性潛能并呈現(xiàn)高侵襲性生物學(xué)行為，可發(fā)生局部復(fù)發(fā)、遠處轉(zhuǎn)移和死亡等情況[3]，目前仍無標準的治療方案。本研究對中國人民解放軍總醫(yī)院2014年10月－2017年10月收治的5例侵襲性腎上皮樣血管平滑肌脂肪瘤進行包括手術(shù)和依維莫司藥物的綜合治療，取得了良好的臨床效果，現(xiàn)報告如下。

1 資料及方法

1.1 臨床資料

收集5例侵襲性腎EMAL患者的臨床資料，包括臨床癥狀、腫瘤大小、病理學(xué)和影像學(xué)特點、手術(shù)方式及隨訪情況。5例患者均因腎腫瘤手術(shù)后復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移就診，男女比例為2∶3，年齡27～60歲，平均（39.8±11.5）歲。左側(cè)2例，雙側(cè)3例。3例患者首次手術(shù)接受根治性腎切除，2例首次手術(shù)接受腎部分切除。5例患者在首次手術(shù)后7～100個月后出現(xiàn)疾病進展，中位至疾病進展時間30個月；局部復(fù)發(fā)3例、多發(fā)轉(zhuǎn)移2例；其中2例復(fù)發(fā)患者均接受二次手術(shù)切除病灶，1例遠處轉(zhuǎn)移患者行右肩胛骨轉(zhuǎn)移灶切除術(shù)，另2例患者未接受手術(shù)治療。2例患者符合結(jié)節(jié)性硬化的臨床診斷，2例通過基因檢測確診為結(jié)節(jié)性硬化，1例不伴有結(jié)節(jié)性硬化。所有患者病理診斷均為上皮樣腎血管平滑肌脂肪瘤，所有病例均為HMB45染色陽性，其中病例1、3、5的Ki-67陽性率超過20%，核分裂像超過2/10 HPF。病例2、4的Ki-67陽性率均為3%，核分裂像均為1～2/10 HPF，詳表1。

1.2 TSC1/2基因二代測序

1.2.1 目標序列捕獲與測序 抽取受試者及對照者靜脈血5 mL，按標準流程提取基因組DNA（QIAamp DNA Blood Midi Kit，Qiagen，Hilden，Germany）。利用 Covaris LE220超聲波儀（Mas?sachusetts，USA）將基因組DNA打斷成200～250 bp的片段，隨后進行Ampure Beads純化，將純化后的DNA片段進行末端修復(fù)、加“A”以及加接頭反應(yīng)，從而完成單個受檢者的DNA建庫。Non-Captured樣品進行LM-PCR反應(yīng)，純化，利用定制的基因片段捕獲探針（BGI自主探針），65℃雜交捕獲24 h，雜交結(jié)束后進行探針的洗滌和洗脫反應(yīng)，隨后進行Captured樣品的LM-PCR反應(yīng)。文庫經(jīng)Agilent 2100 Bioanalyzer和ABI StepOne進行片段大小、濃度的檢測，最后利用高通量測序儀 Illumina HiSeq2500 Analyzers（Illumi?na，SanDiego，USA）連續(xù)雙向測序90個循環(huán)，用Illumina Pipeline software（version 1.3.4）讀出原始測序數(shù)據(jù)。

1.2.2 序列分析 數(shù)據(jù)下機后進入信息分析部分。首先對下機的原始數(shù)據(jù)（Raw reads）進行測序質(zhì)量評估，去除低質(zhì)量以及被接頭污染的數(shù)據(jù)。隨后用BWA軟件（Burrows Wheeler Align?er）與HG19進行序列比對，與此同時進行序列捕獲效果評價，用SOAPsnp軟件和Samtools軟件分別進行 SNV（single nucletide variant）和 Indel（insertion and deletion）的查詢，生成目標區(qū)域堿基多態(tài)性結(jié)果，隨后進行數(shù)據(jù)庫（NCBI dbSNP，HapMap，1000 human genome dataset和 data?base of 100 Chinese healthy adults）的比對，并對找出的可疑突變進行注釋、篩選。

表1 患者臨床資料

1.2.3 Sanger法驗證 對于所有發(fā)現(xiàn)的致病突變，在其所在片段上下游設(shè)計引物，進行PCR擴增，并對產(chǎn)物做Sanger測序。將所得結(jié)果與TSC1和TSC2基因標準序列進行比對，從而驗證探針捕獲和高通量測序的結(jié)果。

1.3 依維莫司藥物治療與評價

對所有患者給予依維莫司（諾華制藥，瑞士）藥物治療，起始劑量均為10 mg口服，1次/d，連續(xù)用藥。藥物治療直至疾病進展或者出現(xiàn)需要減量或停藥的Ⅲ級或Ⅳ級藥物不良反應(yīng)。定期評估患者藥物治療的療效、血藥濃度及不良反應(yīng)發(fā)生情況。

依維莫司治療前，所有患者均采用螺旋CT或者MRI測定腫瘤病灶，以最大直徑腫瘤作為靶病灶，應(yīng)用實體瘤評價標準判定療效（RECIST 1.0）[4]。分別于治療后第 1、3、6、12 個月進行療效評價，之后每6個月進行療效評價。不良反應(yīng)每周期進行評價，按照《美國國立癌癥研究所不良事件通用術(shù)語標準》（NCI CTCAR 3.0版2006年8月）進行分級[5]。依維莫司的血藥濃度通過檢測血清雷帕霉素血藥濃度并通過公式換算得出[6]。

2 結(jié)果

2.1 TSC1/2基因二代測序

BWA軟件行序列捕獲效果評價顯示，所有樣本NGS平均堿基覆蓋度為99.88%，最低樣本覆蓋度為99.44%。目標區(qū)域平均測序深度＞30X位點所占比例平均值為98.92%，最低值為97.35%。所有樣本的平均測序深度為280.4X，最低測序深度為168.4X。而且TSCl和TSC2基因各外顯子上的平均測序深度與測序深度中位數(shù)均比較接近，表明目標序列捕獲二代測序的隨機性較好。

共檢測到有臨床意義的TSC2突變3例、TSC1突變1例，均為錯義突變，另有1例患者檢測到TSC1的點突變，屬于良性突變（表2）。通過對比以往文獻及LOVD數(shù)據(jù)庫MJ[7]，有1個臨床意義未明確的突變，病例1的TSC1外顯子15的c.1700C＞T錯義突變?；驒z測與臨床診斷的符合率為60%（3/5）。

應(yīng)用常規(guī)Sanger測序?qū)?例NGS檢測到5種突變位點進行驗證，其結(jié)果與目標序列捕獲測序結(jié)果完全一致，符合率100%。

2.2 依維莫司藥物療效與安全性評價

5例患者均接受口服依維莫司治療，治療持續(xù)時間3～16個月，治療1個月時的初始療效評估：PR4例、SD1例，平均腫瘤最大徑從8.5 cm縮小為6.4 cm；治療3個月療效評估：PR4例，SD1例，平均腫瘤最大徑為5.2 cm（圖1），6個月時腫瘤直徑變化不顯著（圖2）。隨訪3～20個月，4例患者病情穩(wěn)定，1例患者用藥16個月后出現(xiàn)疾病進展。4例通過臨床診斷或基因診斷為結(jié)節(jié)性硬化的患者療效顯著優(yōu)于不伴有結(jié)節(jié)性硬化的患者，而是否伴有TSC1/2基因突變與依維莫司療效間無顯著相關(guān)性。

主要不良反應(yīng)包括口腔黏膜炎5例、皮疹2例、貧血2例、月經(jīng)失調(diào)2例、肝功能異常1例，大部分為1～2級不良反應(yīng)，不需要停藥或減低劑量，給予對癥處理后可緩解。1例患者用藥9個月出現(xiàn)3級肝功能不全，檢測雷帕霉素血藥濃度結(jié)果谷濃度為15.18 μg/L，換算依維莫司血藥濃度為19.7 μg/L，暫停依維莫司并給予積極保護肝功能治療后緩解，遂重新開始依維莫司治療，劑量調(diào)整為5 mg口服，1次/d，復(fù)查依維莫司血藥濃度為 7.4 μg/L。

表2 患者TSC1/2基因二代測序結(jié)果

圖1 病例5患者依維莫司治療前后CT對比

圖2 依維莫司治療后腫瘤最大直徑變化

3 討論

腎EAML是一類比較罕見的腎臟腫瘤，其發(fā)病率不到所有腎腫瘤的1%，約占腎血管平滑肌脂肪瘤的4.6%[2]。該病好發(fā)于腎臟皮質(zhì)，成年女性多見，Aydin等[1]報道腎 EAML 患者較經(jīng)典AML更趨于年輕化。與經(jīng)典AML不同，腎EM?AL以上皮樣細胞為主，缺乏脂肪組織[8]，腫瘤多呈良性發(fā)展過程，因此其臨床表現(xiàn)缺乏特異性，故腫瘤體積小時常無任何癥狀，多由查體時偶然發(fā)現(xiàn)。腎EMAL術(shù)前診斷主要依賴于影像學(xué)檢查，但其影像學(xué)特征存在多種變化，部分腫瘤呈侵襲性表現(xiàn)，可侵犯鄰近器官或遠處轉(zhuǎn)移，容易造與其他類型腎腫瘤混淆而誤診。本研究組中有4例患者首次發(fā)病因腰痛就診，1例因血尿就診，MRI檢查均為乏脂肪占位，其中2例臨床診斷符合結(jié)節(jié)性硬化癥表現(xiàn)。

腎EMAL具有獨特的生物學(xué)行為，其惡性診斷和預(yù)后參數(shù)尚無統(tǒng)一標準。2015年Lei等[9]依據(jù)腫瘤標本及病理學(xué)特點提出新的預(yù)測標準：①腫瘤直徑大于9 cm；②靜脈瘤栓形成；③上皮樣細胞成分大于70%或不典型的分裂像細胞大于60%；④發(fā)現(xiàn)壞死。當(dāng)腫瘤符合至少3項視為有高度惡性生物學(xué)行為，需要臨床密切關(guān)注。Var?ma等[10]發(fā)現(xiàn)腎EMAL腫瘤P53陽性提示有惡性變的趨勢，并提出Ki-67、P53有助于該類腫瘤良惡性的評估。本組患者中所有病例均為HMB45染色陽性，其中病例1、3、5均為多發(fā)轉(zhuǎn)移，其共同特點是Ki-67陽性率超過20%，核分裂像超過2/10 HPF。而病例2、4的Ki-67陽性率均為3%，核分裂像均為1～2/10 HPF。病例5年輕女性患者在人工流產(chǎn)后短時間內(nèi)出現(xiàn)腫瘤快速進展，值得關(guān)注。Tsai等[11]研究發(fā)現(xiàn)半數(shù)以上腎EAML伴有家族結(jié)節(jié)性硬化癥（tuberous sclerosis，TSC）或其他部位的腫瘤。有報道稱腎EMAL患者伴隨結(jié)節(jié)硬化癥的比例明顯高于經(jīng)典型腎AML，20%～30%的青年腎EAML患者合并結(jié)節(jié)性硬化癥[12]。本組患者均接受了TSC1/2基因檢測，4例發(fā)現(xiàn)致病性TSC1或TSC2基因突變，其中2例符合結(jié)節(jié)性硬化臨床診斷標準，占同期我院診斷EAML患者的30.8%（4/13）。

腎EMAL目前的治療方案沒有統(tǒng)一規(guī)范標準，手術(shù)切除是主要的有效治療方式，而完整的腫瘤切除可提高治療效果[13]。在手術(shù)方式的選擇上，應(yīng)根據(jù)患者腫瘤大小、位置、周圍組織侵犯及遠處轉(zhuǎn)移等情況綜合評估，本組5例患者中3例在術(shù)后出現(xiàn)局部復(fù)發(fā)，因此在術(shù)中徹底切除腫瘤尤為重要。目前部分學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)腎EMAL對阿霉素、環(huán)磷酰胺、順鉑等化療藥物治療有一定療效，同時也有個案報道腎EMAL對于放療、化療及分子靶向治療均不敏感[14-16]。Kenerson等[17-18]研究發(fā)現(xiàn)mTOR信號通路的異常激活在腎EAML的生長及進展中起重要作用，部分患者應(yīng)用雷帕霉素、依維莫司等mTOR抑制劑出現(xiàn)瘤體縮小，說明mTOR抑制劑可對上皮樣血管平滑肌脂肪瘤有一定的治療作用。在一項多中心隨機對照前瞻性臨床研究（EXIST-2）中，79例臨床診斷為TSC相關(guān)EAML患者接受了6個月的依維莫司藥物治療，42%的依維莫司組患者腎臟EAML病灶體積縮?。?0%，而對照組未出現(xiàn)病灶體積縮小的病例[19-20]。而依維莫司在侵襲性EAML治療中的應(yīng)用僅有個案報道[21-22]。本組有4例患者考慮為結(jié)節(jié)性硬化相關(guān)的EAML，給予依維莫司治療1個月后瘤體明顯減小，腫瘤持續(xù)縮小至要治療后6個月，其療效持續(xù)穩(wěn)定達12個月，目前僅有1例出現(xiàn)進展，而另外1例非結(jié)節(jié)性硬化相關(guān)的EAML患者使用依維莫司后腫瘤變化不明顯。我們選擇了既往治療結(jié)節(jié)性硬化相關(guān)腎血管平滑肌脂肪瘤的給藥劑量10 mg/d作為初始劑量，不良反應(yīng)多為1～2級，3～4級不良反應(yīng)發(fā)生率低，用藥期間進行定期的安全性檢查及血藥濃度監(jiān)測將有效避免嚴重不良反應(yīng)的發(fā)生，并可根據(jù)血藥濃度進行合理的劑量滴定，合理的藥物滴定有助于患者長期安全地接受藥物治療。

綜上所述，侵襲性腎EMAL是一種具有惡性潛能的腫瘤，完整的腫瘤切除是治療的關(guān)鍵。對于術(shù)前評估難以完整切除或者術(shù)后出現(xiàn)疾病進展的患者應(yīng)進行TSC1和TSC2基因突變分析，對于存在致病性TSC1/2基因突變或臨床診斷為結(jié)節(jié)性硬化的患者，依維莫司的應(yīng)用可以增加手術(shù)完整切除的概率，還可以有效控制局部復(fù)發(fā)或者轉(zhuǎn)移病灶，其療效還安全性還需要進一步的大樣本前瞻性隨機對照研究來證實。